Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Um método para monitorizar a actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas é descrito. A degron-GFP-desestabilizado (GFP-dgn) e uma proteína de fusão GFP estável dgnFS-são gerados e transduzidos para a célula utilizando um vector de expressão lentiviral. Esta técnica permite a geração de um estábulo GFP-dgn/GFP-dgnFS linha celular que expressa em que a actividade de ubiquitina-proteassoma podem ser facilmente avaliados utilizando epifluorescência ou citometria de fluxo.

Proteassoma é o principal organelo intracelular envolvida na degradação proteolítica da anormais, deformadas, proteínas danificadas ou oxidadas ^{1, 2.} Manutenção da atividade do proteassoma foi implicado em vários processos celulares, como resposta celular ao estresse ^3, regulação do ciclo celular e diferenciação celular em ⁴ ou ⁵ resposta do sistema imunológico. A disfunção do sistema ubiquitina-proteassoma tem sido relacionado com o desenvolvimento de tumores e doenças neurodegenerativas ^{4, 6.} Além disso, a diminuição da actividade do proteassoma foi encontrada como uma característica de senescência celular e envelhecimento organismal ^{7, 8, 9, 10.} Aqui, apresentamos um método para medir a atividade da ubiquitina-proteassoma em células vivas usando uma proteína de fusão GFP-dgn. Para ser capaz de monitorizar actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas primárias, constrói DNA complementar que codifica para uma proteína fluorescente verde (GFP), proteína de fusão dgn (GFP-dgn, instável) e uma variante de realização de uma mutação frameshift (GFP-dgnFS, estável ¹¹⁾ são inseridos em vectores de expressão lentiviral. Nós preferimos desta técnica em relação às técnicas tradicionais de transfecção, porque garante uma eficiência de transfecção elevada, independentemente do tipo de célula ou a idade do dador. A diferença entre a fluorescência exibida pelo GFP-dgnFS (estável) da proteína e da proteína desestabilizado (GFP-dgn) na ausência ou na presença de inibidor de proteassoma podem ser utilizados para estimar a actividade de ubiquitina-proteassoma em cada linhagem celular particular. Estas diferenças podem ser monitorizadas através de microscopia de epifluorescência, ou pode ser medido por citometria de fluxo.

1. Construção do plasmídeo

1. Ordem personalizada codificação oligonucleótidos para dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ e para dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) e ligar-lo para o vector pEGFP-C1 para obter a fusão da GFP com dgn / dgnFS (Figura 1).
2. Amplificar a sequência que codifica para GFP-dgn e GFP-dgnFS por PCR de acordo com o protocolo do kit de clonagem TOPO pENTR direccional e continuar com o pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Figura 6).

2. Produção de vírus

1. Um dia antes da transfecção (dia 1) para fora da semente HEK 293FT células em frascos T75 a fim de que eles serão de 90-95% confluentes no dia da transfecção.
2. No dia da transfecção dilua 36 ul de reagente de lipofectamina 2000 em 1,5 ml de DMEM sem soro e antibióticos em 15 ml Falcon. Use outro 15 ml e diluir falcon 3 ug pLenti6/V5 portador do DNA complementar para construir ou GFP -Dgn ou GFP-dgnFS, 2,5 ug do plasmídeo envelope pMD2.G codificação e 7,5 ug psPAX2 esqueleto do vector em 1,5 ml de DMEM sem soro e antibióticos. Depois de 5 min o DNA diluída é combinada com o reagente de lipofectamina 2000 diluída.
3. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente para permitir que os complexos de ADN-lipofectamina a forma.
4. Remover o meio de HEK 293FT células, substitui-lo por cuidadosamente 7 ml de meio (sem antibióticos) e adicionar a mistura de ADN-lipofectamina ao balão e rocha frente e para trás para misturar (Dia 2). Incubar o balão durante a noite a 37 ° C em um humidificada de 5% CO ₂ incubadora.
5. Alterar meio do dia seguinte (10 ml de meio sem antibióticos; Dia 3).
6. Após 48 horas (dia 5) sobrenadante da colheita, centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e filtrar o sobrenadante através de um filtro de PVDF de 0,45 um.

O meio de cultura - DMEM (HEK 293FT)

3. A concentração de vírus por polietileno glicol (PEG) Precipitação

1. Adicionar um volume de solução de polietileno-glicol (50 Polietilenoglicol mM, 41 mM NaCl, autoclave, pH = 7,2; PEG) para quatro volumes de sobrenadante e incubar durante 2 horas a 4 ° C. Cuidadosamente misture todos os 20-30 minutos por inversão.
2. Girar a 1500 xg durante 30 min a 4 ° C. Um pó branco deve ser visível.
3. Aspirar o sobrenadante e centrifugar novamente a 1500 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar a solução de PEG restante.
4. Ressuspender o sedimento em meio ou tampão fosfato salino (PBS), pipetando para cima e para baixo vigorosamente e vortex durante 20 a 30 segundos. A título de orientação usam 500 ul para um frasco T75 e alíquota a 100 ul. Armazenar o vírus a -80 ° C.

4. Titulação do vírus

1. Semente fora 5 × 10 ⁴ U2-OS células para cada poço de uma placa de 6 poços um dia antes da transfecção.
2. No dia da transfecção remover o meio de cultura e substitui-lo por 1 ml de DMEM contendo 8 ug / ml de polibreno (brometo Hexadimetrina). Dilui-se o vírus concentrado sobrenadante 1:10 e 1:100 e adicionar 1 ul de cada uma de um poço. Para concentrações mais elevadas de vírus usar 1 ul, 5 ul e 10 ul de sobrenadante concentrado de vírus para as cavidades remanescentes. Um poço é deixada como um controlo positivo.
3. No dia seguinte, substituir o meio por 2 ml de DMEM.
4. Comece com a selecção do dia seguinte. Aplicar 10 blasticidina ug / mL em cada poço. Substitua o meio antibiótico contendo cada segundo dia.
5. Cerca de 6-7 dias após o início da seleção das células untransduced estão mortos. Para a coloração de lavar as células três vezes com PBS e cobrir as células com violeta de cristal (10 mg / l de cristal violetaem etanol a 20%) e incuba-se durante 5-10 minutos à temperatura ambiente. Aspirado de cristal violeta (pode ser reutilizado várias vezes) e lavar os poços duas vezes com DDQ ₂ O e secar a placa.
6. Contar as colónias e se multiplicam em 1000 e a diluição correspondente (Figura 7). Este procedimento permite calcular as unidades de transfecção (TU) do vírus / ml.

Meio de cultura - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
FBS a 10%
6 mM de L-glutamina
1% Pen Strep-

5. Transdução de fibroblastos diplóides humanos (Este procedimento pode ser usado para qualquer tipo de células.)

1. Descendência a 5 × 10 ⁴ fibroblastos humanos diplóides (HDFS) a 6 poços no dia antes de transdução.
2. Usar uma multiplicidade de infecção de dois em conjunto com 8 ug / ml de polibreno como transdução potenciador, num total de um mililitro.
3. Alterar meio no dia seguinte.
4. Quandoas células estão a 70-80% de confluência início a selecção com 10 ng / ml blasticidina. Após a selecção estar completa (ausência de células não transf ectadas morrem mais) a expansão das células pode iniciar e as células estão prontas para experiências. Seleção crônica com blasticidina permite gerar uma linha celular estável superexpressão GFP-dgn ou proteínas GFP-dgnFS fusão, pronto para medir a atividade do proteassoma. Este procedimento garante uma eficiência de transfecção elevada, independentemente do tipo de célula.

6. Medição por citometria de fluxo

1. Semente out 1 × 10 ⁵ células (transporte ou GFP-dgn ou GFP-dgnFS) um dia antes do experimento.
2. Tratar as células de controlo 3 horas antes da medição com o inibidor de proteassoma, por exemplo, 100 ug / ml LLNL.
3. Lavar duas vezes com PBS e colheita das células utilizando-se 0,5 ml de tripsina. Para parar a tripsinização utilizar 4,5 ml de meio de cultura e transferência das células para uma de 15 ml Falcon.
4. Spin-tele células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Aspirar o meio, ressuspender as células em PBS e girar para baixo outra vez a 300 xg durante 5 min a 37 ° C.
6. Aspirar o PBS, ressuspender em 400 ul de tampão de FACS (10 mM de Hepes, 140 mM de NaCl, 2,5 mM de _CaCl2, pH = 7,4) e transferir as células em tubos de FACS.
7. Manter as células em amostras de gelo e medida por citometria de fluxo. As células não deve ser armazenado por mais de 30 min a 4 ° C.

7. Resultados representativos

A proteína de fusão GFP-dgn transporta uma sequência que é voltado para o proteassoma e, portanto, a proteína é imediatamente degradada, que corresponde à diminuição do sinal de fluorescência da GFP. O mutante de frameshift (GFP-dgnFS) transporta uma versão mutada desta sequência e não é degradada pelo proteassoma, que leva a uma maior fluorescência verde. Por estas razões, o jovem esperava HDFs com alta atividade do proteassoma e transduzidas com GFP-dgn apresentam um sinal de (6% de células positivas) baixa fluorescência na medida tanto em citometria de fluxo e de epifluorescência (Figura 2A e B, Figura 3). O mesmo HDFs transduzidas com GFP-dgnFS exibir 39,7% de células positivas. O tratamento das células com inibidor de proteassoma LLNL (N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal) elevou o sinal a um máximo de 62,9% em ambos, GFP-dgn e GFP-dgnFS células (Figura 2 A e B ).

Para determinar possível declínio da actividade do proteassoma em idade as amostras de pele humana, os fibroblastos da derme isolados de doadores jovens, de meia idade e de idade foram infectadas com GFP-dgn e GFP-dgnFS, como descrito acima e cultivadas à passagem número mesmo antes da análise por fluxo citometria. Nesses experimentos, um aumento nítido na GFP sinal entre indivíduos jovens (11,2 ± 0,88% de células GFP-positivo) e de meia-idade doadores (20,4 ± 2,27% GFP células positivas, p = 0,003) foi observada, indicando uma diminuir em proteasatividade ome em amostras obtidas de doadores com idades entre ⁷ (Figura 4). Nenhuma diminuição adicional na actividade do proteassoma foi observada em fibroblastos isolados a partir de indivíduos mais idosos (Figura 4). A intensidade da fluorescência para GFP-dgnFS foi em todos os casos, a 90% (dados não apresentados) o que indica uma alta eficiência de transfecção para os três grupos etários distintos.

Figura 1. A sequência de GFP-dgn e GFP-dgnFS. Displayed é a extremidade 3 'de GFP (verde) no local de clonagem múltipla do vector pEGFP-CL1 (cinzento) e a sequência de dgn / dgnFS (vermelho).

Figura 2. A análise de citometria de fluxo de GFP-dgn e GFP-dgnFS fibroblastos diplóides humanos. A. Young fibroblastos de prepúcio humano (HFF-2) foram infectadas com os vectores lentivirais que transportam a proteína verde fluorescente (GFP)-dgn gene ou um GFP-dgnFS (frameshift) construção, tal como indicado e analisadas por fluorescência de GFP por citometria de fluxo (FACS Canto II, Becton Dickinson). Quando indicado, as células foram também tratados, durante 3 h com inibidor de proteassoma de N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal (LLNL). As células não infectadas foram utilizadas como um controlo. As experiências foram realizadas em triplicado. B. Os dados são representativos de três experiências independentes. Os números refletem a quantidade de células GFP positivas. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. A análise por microscopia de fluorescência de GFP-dgn e GFP-dgnFS HFF-2 células. Jovem HFF-2 foram tratados como na Figura 2. Aos 9 dias após a infecção, as células foram visualized por fluorescência e microscopia de contraste de fase.

Figura 4. Mudanças na atividade do proteassoma no envelhecimento da pele humana. Os fibroblastos de prepúcio humano de nove diferentes doadores nas faixas etárias indicadas foram minimamente expandidos e infectados com construções lentivirais codificam GFP-DGN. Aos 9 dias após a infecção, as células foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados foram obtidos em três amostras por grupo de idade em duplicados (± SE).

Figura 5. Abordagem experimental. Custom-oligo nucleótidos para dgn e dgnFS são clonados no vector pEGFP-C1 e os vírus são produzidos para cada constructo utilizando células HEK 293FT células. O título do vírus foi determinado. As células são transfectadas com o vírus e expandido. Após o tratamento favorecido as células são analisadaspara o sinal de fluorescência por citometria de fluxo.

Figura 6. Mapa de Plenti GFP-dgn. O mapa da pLenti6/V5-DEST vector incluindo a sequência de GFP-dgn é exibida. Abreviaturas: pCMV (promotor CMV), GFP-dgn (sequência de GFP-dgn), P _SV40 (SV40 promotor precoce), EM7 (EM7 promotor), blasticidina (blasticidina gene de resistência), ΔU3 / LTR 3 '(LTR 3' com excluído região U3), SV40 pA (sinal de poliadenilação de SV40), ampicilina (gene de resistência à ampicilina), pUC ori (origem pUC), PRSV / 5 'LTR (RSV / LTR 5' do promotor híbrido), Ψ (HIV-1 do sinal de embalagem Ψ ), RRE (HIV-1 elemento de resposta rev).

Figura 7. U2-OS placa titulação. U2-OS foram semeadas em uma placa de 6 poços e transfectadas com concentrações de vírus diferentes (diluição de 1/100 e 1/10, 1, 5 e 10 ul de concentrated sobrenadante viral). Um bem foi utilizado como controle não transfectados (NT). Após 6-7 dias, as células foram coradas com violeta de cristal e seco ao ar.

A primeira publicação utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) como substrato repórter para a actividade de ubiquitina-proteassoma, foi publicado em 2000 ^12. Desde então, a GFP tem sido uma ferramenta comum para visualizar as actividades celulares, especialmente o processo de ubiquitina-proteassoma. Para monitorar a ubiquitina-proteassoma actividade in vivo num modelo de ratinho transgénico com um repórter GFP baseada foi introduzido ^13. Também, em pesquisa in vivo estabeleceu outro modelo de camundongo transgênico com uma semelhante repórter GFP degron-desestabilizado como utilizados nesta publicação ^14.

Infelizmente, como um repórter GFP tem algumas imperfeições, que tem sido mostrado por Dantuma et al. E Bowman et al. ^12,15. Em primeiro lugar, desestabilizado GFP pode acumular-se sem a inibição do proteassoma devido a razões desconhecidas. À medida que a maquinaria ubiquitina-proteassoma é um sistema cuja funcionalidade é dependente de vários passos, adisturbance antes da degradação pode levar à acumulação do substrato repórter e resultam em falsos-positivos efeitos ^12. Em segundo lugar, com base em substratos de GFP repórter são, devido à sua curta semi-vida sensível a alterações na transcrição e tradução. Qualquer alteração na fluorescência GFP pode, portanto, ser um resultado da síntese reduzida ou aumentada, e de tradução ^15. Estes problemas foram abordados em outros estudos de modificações de GFP como segue:

Actividade do proteassoma foi encontrado para ser diminuída em senescência celular e envelhecimento organismal ^{7, 8, 9, 10.} No campo da investigação de envelhecimento, o foco é principalmente na remoção de proteínas oxidadas em que o proteassoma desempenha um papel essencial, e não há nenhuma evidência conclusiva de que a proteína ubiquitylation precede degradação neste caso ^2. Trabalhos anteriores mostraram também que a utilização de GFP com um mutante porção uncleavable ubiquitina é adequado para o estudo do processo complexo de protein degradação ^16. Este constructo-GFP permite a possibilidade de monitorizar a actividade do proteassoma, sem a influência potencial para a sua actividade através de perturbações na maquinaria ubiquitina.

Neste trabalho, foi utilizado um degron-desestabilizado proteína repórter GFP-based (GFP-dgn) para monitorar a atividade ubiquitina-proteassoma em viver fibroblastos humanos diplóides. Para se ter uma visão geral da eficiência de transfecção, a funcionalidade e os níveis de transcrição / tradução do repórter GFP-dgn, vários controles apropriados foram incluídos. Usamos jovens não tratados GFP-DGN fibroblastos transfectados para mostrar que não há quase nenhuma função fluorescência verde visível e proteassoma não é afetado. Para validar que o sinal aumenta com a inibição do proteassoma, tratámos GFP-DGN fibroblastos transfectados com um inibidor de proteassoma de ver a acumulação de GPF após a inibição. Como um terceiro controle usamos GFP-dgnFS. Com esta construção, podemos mostrar o overaa eficiência de transfecção ll que pode diferir da estirpe de células de linhagem celular e com todos os três controlos que temos uma vista geral sobre a taxa de síntese das construções no interior da célula.

O método aqui apresentado permite ao utilizador medir rápida e facilmente a actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas. A sobre-expressão estável do substrato repórter GFP pode ser conseguida com técnicas diferentes ^17. Nesta publicação, a transfecção de ADNc de GFP-dgn para dentro das células é conseguida pelo sistema lentiviral que proporciona uma expressão estável. Além disso, a utilização deste sistema permitiu a eficiência de transfecção elevada, independentemente do tipo de célula, condição metabólica celular ou a idade do dador ^7. Nós temos utilizado com sucesso este protocolo para introduzir ADN nas células endoteliais em que os outros métodos de transfecção falharam ^18. No entanto, as experiências anteriores demonstraram que as células que são expandidas em cultura já exibem uma baixa fluorescênciasinal de que as células transfectadas de fresco, possivelmente devido à pressão mais de selecção.

A precipitação com PEG é utilizada para aumentar o título de uma das unidades por ml de transformação (TU / mL). Se os títulos de boas são atingidas (superior a 5 x 10 ⁵ TU / ml), a precipitação com PEG pode ser omitido. Um passo importante na precipitação com PEG é a de evitar ou suspender vigorosa pipetagem, que gera bolhas de ar. Ele pode inactivar as partículas de vírus e diminuir significativamente a eficiência da transfecção.

Quando o uso de inibidores de proteassoma uma experimentos priori deve ser realizada. A concentração final utilizado e tempo de incubação são o tipo de células dependente e têm de ser determinadas experimentalmente. Observações anteriores sobre células HFF-2 revelou que a incubação de 3 h com LLNL não deve ser excedido devido a 1), os efeitos tóxicos do inibidor 2) do sinal GFP demasiado elevada, que pode ser alcançado, ou 3) os efeitos secundários da inibição de proteassoma sobre tim jáperíodos e.

Não há conflitos de interesse declarados.

Este estudo foi financiado por: Rede Nacional de Pesquisa do Envelhecimento (NFN S93) pelo austríaco Science Foundation (FWF), Comissão Europeia e projetos integrados de mimage PROTEOMAGE, Holanda Genomics Initiative / Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NGI / NWO; 05040202 e 050 - 060-810 NCHA), a UE financiou Rede de Excelência Longevidade (FP6 036.894), Programa de Pesquisa e Inovação Orientada em Genômica (SenterNovem; IGE01014 e IGE5007).