Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

Nós descrevemos um método para gerar linhas B transformada célula usando vírus Epstein-Barr. Nós também ilustrar um ensaio de romance que pode identificar as células B destinados a sofrer transformações logo aos três dias após a infecção.

Infecção de células B com vírus Epstein-Barr (EBV) leva à imortalização proliferação e subseqüentes, resultando no estabelecimento de linhas de células linfoblastóides (LCL) in vitro. Desde LCL estão latentes infectadas com EBV, eles fornecem um sistema modelo para investigar a latência e EBV-vírus impulsionado a proliferação de células B e tumorigênese ^1. LCL têm sido utilizados para apresentar antígenos em uma variedade de testes imunológicos ^{2, 3.} Além disso, LCL pode ser usado para gerar anticorpos monoclonais humanos ^{4, 5} e fornecer uma fonte potencialmente ilimitada quando o acesso a materiais biológicos primária é limitada ^{6, 7.}

Uma variedade de métodos têm sido descritos para gerar LCL. Métodos anteriores incluíram o uso de mitógenos, como fitohemaglutinina, lipopolissacarídeo ⁸ e ⁹ pokeweed mitógeno para aumentar a eficiência da EBV-mediada imortalização. Mais recentemente, outros autores utilizaram o immunosuppragentes essive como a ciclosporina A para inibir a morte celular mediada de células T infectadas B ^{7, 10-12.}

O período de tempo considerável da infecção EBV para o estabelecimento de linhas celulares impulsiona a necessidade de métodos mais rápidos e mais confiáveis ​​para EBV-driven de transformação do crescimento de células B. Usando uma combinação de alta título EBV e um agente imunossupressor, somos capazes de infectar consistentemente, transformar e gerar a partir de células LCL B no sangue periférico. Este método utiliza uma pequena quantidade de células mononucleares do sangue periférico, que são infectados em clusters in vitro de células pode ser demonstrada. A presença de CD23 com EBV, na presença de FK506, uma célula T imunossupressoras. Tradicionalmente, o crescimento de células B proliferam é monitorado através da visualização de aglomerados de células microscópicas cerca de uma semana após a infecção com EBV. Aglomerados de LCL pode ser visto a olho nu depois de várias semanas. Nós descrevemos um ensaio para determinar cedo se EBV mediada gCRESCIMENTO transformação for bem sucedida, mesmo antes aglomerados microscópico das células pode ser demonstrada. A presença de CD23 ⁺ células CD58 ^oi observados logo aos três dias pós-infecção indica um resultado positivo.

1. EBV preparação de

1. Subcultura crescimento exponencial B95-8 células (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 ⁵ células / ml em um frasco de 75 centímetros de cultura de tecido usando a técnica de ^dois estéril. As células são cultivadas em RPMI 1640 completo contendo inativado pelo calor 10% de soro fetal bovino (FBS), Penicilina / Estreptomicina em 100U/ml e 100 mg / ml, respectivamente, e anfotericina B, 0,5 mg / ml a 37 ° C na presença de 5% de CO _2.
2. Quarenta e oito horas depois, as células ressuspender em fresco RPMI completo 1640 em 1 x 10 ⁶ células / ml. Para induzir a produção de vírus, estimulam as células com acetato de forbol tetradecanoyl 20ng/mL (TPA) por 1 hora em um padrão de incubadora de CO _2. Lave as células três vezes com RPMI 1640 para remover TPA.
3. Ressuspender as células do volume original de RPMI completo 1640 (de 1,2) e colocar o balão na incubadora de CO ₂ por 96 horas. Este método tem sido mostrado para produzir títulos elevados de vírus infeccioso partigos ^6.
4. Centrifugar a 600 x g por 10 min a 4 ° C para separar EBV contendo sobrenadante de cultura de células. Sobrenadante do filtro através de um filtro de 0,45 micron, alíquota, e armazenar a -70 ° C por mais de um ano.
   Uma alternativa é obter o sobrenadante de B95-8 células contendo EBV da ATCC (VR-1492) e uso na diluição recomendada pelo ATCC.

2. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

1. Draw 10 ml de sangue do dador para uma seringa heparinizada ou um tubo de sangue heparinizado. Diluir 20 ml de sangue com PBS em temperatura ambiente em um tubo de 50 ml.
2. Underlay sangue diluído com 15 Ficoll Hypaque ml de meio de separação de linfócitos. Centrifugar a 225 x g sem freio em temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Remover buffy coat e transferência para um novo tubo cônico de 50 ml. Aumentar o volume para 50 ml com PBS e girar a 600 xg à temperatura ambiente por 10 minutos.
4. Pour fora o sobrenadante. Lave as células pela ressuspensão pellet em 50 ml de PBS e centrifugação a 600 x g à temperatura ambiente por 10 minutos. Lavar duas vezes mais de uma maneira similar.
5. Ressuspender as células lavadas em 1 ml de RPMI completo. Use 5 mL de células para preparar uma diluição 1 / 10 em Trypan azul. Contagem de células vivas usando um hemocitômetro.
6. Ajustar o volume usando RPMI completo em um frasco de 25 centímetros de cultura de tecido ² para obter uma concentração de células de 2 x 10 ⁶ / ml.

3. Infecção com EBV

1. Adicionar FK506 (AG Scientific) para a suspensão de células de 2,6 para uma concentração final de 20 nM. Frasco lugar na incubadora de CO ₂ a 37 ° C durante uma hora.
2. Descongelar rapidamente uma alíquota de EBV. Remover balão de incubadora e adicione EBV para as células em 10/01 diluição. Tipicamente, esta diluição oferece uma MOI de 50-100. Frasco para misturar e coloque-o na posição vertical em incubadora de CO ₂ a 37 ° C.

ª notana Etapa 4, realizada para prever o resultado bem-sucedido, é uma etapa opcional. Passo 4 Se é para ser realizado, você vai precisar para incubar um frasco adicional de não-infectados PBMC de 2 x 10 ⁶ células / ml como controle.

4. Identificação da população de células em proliferação (etapa opcional)

1. Prepare FACS buffer: PBS + 5% de SFB. Armazenar a 4 ° C.
2. Tornar o anticorpo seguinte mistura em 50 mL de volume para cada coloração de células no Passo 4.6. Diluições devem ser feitas na FACS tampão contendo 1mg/ml de rato IgG (Sigma) para inibir a ligação não específica de anticorpos.
   1. single-coradas com PE de anticorpos anti-CD23 conjugado (1 / 50 de diluição)
   2. single-coradas com FITC anticorpo anti-CD58 conjugado (1 / 50 de diluição)
   3. single-coradas com PE-Cy5 anticorpo anti-CD19 conjugado (1 / 50 de diluição)
   4. triple-coloração para CD23, CD58, e CD19 (1 / 50 cada diluição)
   5. single-coradas com conjugado PE controle isotipoanticorpos combinados para CD23-PE (na mesma concentração de anticorpos anti-CD23)
   6. single-coradas com anticorpo controle conjugado FITC isotipo combinados para CD58-FITC (na mesma concentração de anticorpos anti-CD58)
   7. single-coradas com PE-Cy5 anticorpo controle isotipo conjugados combinados para CD19-PE-Cy5 (na mesma concentração de anticorpos anti-CD19)
   8. triple-coradas com os três anticorpos isotipo controle.
   Armazenar temporariamente as misturas a 4 ° C no escuro.
3. Em três dias pós-exposição ao EBV, gentilmente frasco agite para obter uma suspensão celular mais uniforme. Remover 2ml de balão para um tubo Eppendorf de 2ml. Tubo giratório em uma microcentrífuga a 3000 rpm em temperatura ambiente por 3 minutos.
4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão FACS, 5 x 10 ⁶ a 1 x 10 ⁷ células / ml.
5. Remover oito alíquotas 50μl em tubos Eppendorf individuais ou uma placa de 96 poços V-fundo. Tubos de rotação ou a placa a 1500 x gpor 3 minutos.
6. Descartar o sobrenadante e os tubos vortex / placa. Ressuspender as células em cada tubo / poço em 50 mL de tampão FACS contendo diluições apropriadas preparadas em 4.2.
7. Incubar os tubos / placa de gelo no escuro por 30 minutos. Células Centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos, retire o sobrenadante e adicionar 200 mL de tampão FACS. Centrifugar as células novamente e remover o sobrenadante para completar a lavagem. Repita mais duas lavagens.
8. Ressuspender as células em 200 mL de buffer FACS e aquisição de dados usando um citômetro de fluxo, a aquisição de 20 mil eventos / tubo.
9. Analisar os dados usando WinMDI (freeware para FACS análise de dados no PC). Portão em células vivas usando perfis de dispersão para a frente e lateral. Então, as células portão ao vivo para a expressão de CD19 ⁺ (marcador de células B) depois de comparar com as células coradas com anticorpos isotipo controle pareado para anticorpos anti-CD19. Plot CD19 ⁺ B ao vivo células com intensidade de fluorescência de CD23 em eixo-x e intensidade de fluorescência de CD58 em eixo y. Determine CD23 ⁺ e CD58 ⁺ células, comparando a EBV-expostos de células marcadas com anticorpos isotipo controle pareado. Presença de CD23 ⁺ CD58 ^oi células EBV-expostos cultura (Figura 2C) prevê crescimento bem sucedida de EBV-infectados crescimento das células transformadas. Em contraste, CD23 ⁺ células CD58 ^oi não surgem quando as células não estão expostos a EBV (Figura 2A) ou exposto a uma cepa não imortalizando de EBV (Figura 2B). CD23 ⁺ células CD58 ^oi têm sido experimentalmente demonstrado submeter-se a proliferação e, posteriormente, estabelecer LCL (14).

5. Expansão e criopreservação de LCL

1. Visualização de células por microscopia de luz: Por uma semana após a infecção EBV, grupos de células são visíveis por microscopia de luz. A Figura 3 mostra um exemplo dos primeiros aglomerados microscópicos (Figura 3B) num balão.
2. Como o tempo passa, tornam-se maiores aglomerados microscópicos de tal forma que aglomerados são visíveismacroscopicamente no frasco. Figura 3C mostra os clusters maior de células em LCL estabelecidos pela microscopia de luz.
3. Alimentando células: o dobro do volume de meio de cultura no frasco de cultura no dia 12. Posteriormente, expandir a cultura, aumentando seu volume de 2-3 vezes usando RPMI completo.
4. Periodicidade das células de alimentação deve ser determinado com base na taxa de crescimento celular. Quando o meio de cultura torna-se amarelo, geralmente é hora de substituir a mídia como acima. Normalmente, isso ocorre uma vez por semana. No entanto, algumas linhagens de células podem precisar ser alimentados mais ou menos freqüência. Expandir a cultura de 75-100 ml ao longo das próximas semanas.
5. Criopreservação: Quando o congelamento até as células, as células de centrifugação a 600 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular em meio de muito frio contendo 90% FBS e dimetilsulfóxido 10% no 1 x 10 ⁷ células / ml. Coloque o tubo em nitrogênio líquido.

6. Resultados representativos:

Resultado bem-sucedido é previsto pela presença de CD23 ⁺ CD58 ^oi células. Cerca de 2-3% de células vivas no dia 04/03 após a exposição ao EBV deve ter este perfil (Figura 2C). Outras sub-populações de CD23 ^+, CD23 ^-, CD58 ^+, e CD58 ^- células observadas após a exposição ao EBV mostram proliferação mínima ^14. Un células infectadas (Figura 2A) e células expostas a EBV de HH514-16 células (Figura 2B), abrigando uma cepa não imortalizando de EBV, não demonstram CD23 CD58 ⁺ células ^oi.

Você também pode visualizar as células por microscopia óptica para monitorar êxito: Como mencionado anteriormente, dentro de uma semana após a infecção EBV, pequenos aglomerados de células no frasco são visíveis por microscopia de luz (Figura 3B). Enquanto o tempo progride e as células se desenvolvem em LCL, clusters microscópicas tornam-se maiores (Figura 3C) de tal forma que aglomerados são visíveis macroscopicamente no frasco.

Figura 1. Fluxo de Trabalho para a geração e criopreservação de linhagens de células linfoblastóides. Sangue periférico é centrifugada por um gradiente de Ficoll. PBMC presentes no revestimento buffy de um gradiente estabelecidas estão expostos a FK506 seguido por adição de EBV. EBV-expuseram as células são cultivadas a 37 ° C na presença de 5% de CO ₂ para estabelecer e, posteriormente, expandir LCL para criopreservação.

Figura 2. Identificação de um sub-população de células B deverá submeter-se a proliferação após a exposição ao EBV. Un-infectados PBMC (A) ou PBMC expostos a EBV derivadas de células HH514-16 (B) ou de células B95-8 (C) na presença de FK506 foram colhidas no dia 3. Células foram marcadas com fluorocromo-anticorpos dirigidos contra CD19, CD23, CD58 e. Depois de chaveamento em células vivass, un-infectados (A) e EBV-exposed (B e C) CD19 ⁺ células B foram examinados para a expressão de CD23 e CD58. A sub-população de células B expressando níveis de CD58 e alta de CD23 (CD23 ^oi CD58 ^+), observada apenas nas células expostas à transformação competentes EBV (derivado de B95-8 células), é descrito.

Figura 3. Visualization dos ninhos de células em células infectadas pelo EBV-. PBMC foram tratados com FK506 e infectados com EBV. Un-infectados (A) e EBV-exposed (B) as células foram examinados uma semana após a infecção por microscopia de contraste de fase (aumento de 10x). Cinco semanas de idade linfoblastóides linha celular é mostrado na C.

O método descrito neste trabalho gera LCL de doadores de sangue periférico com imortalização rápida e os tempos de criopreservação. Através do uso de FK506, uma célula T imunossupressoras, e altos títulos de vírus infecciosos que somos capazes de promover a proliferação de células infectadas pelo EBV B a partir de células mononucleares do sangue periférico. Estas intervenções fazem o método descrito mais eficiente, resultando em rápida expansão das células para os experimentos subseqüentes.

Tradicionalmente, a transformação de crescimento tem sido monitorado através da visualização de aglomerados de células por microscopia de luz cerca de uma semana após a exposição ao EBV ^{6, 15.} No entanto, o agrupamento de células não é um indicador específico de EBV-mediada transformação de crescimento. Temos demonstrado anteriormente identificação consistente da população de proliferação celular através de citometria de fluxo ^14, fornecendo um método preciso e específico para determinar sucesso tão cedo quanto três dias à réer a exposição de células B para EBV.

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta pesquisa foi financiada pelo NIH concede AI062732 K08, K12 HD001401 e 1UL1RR024139-02 e uma criança Grant Pesquisa em Saúde da Fundação Charles H. capa para SB-M. e pela Fundação de Pesquisa da Universidade Estadual de Nova York em Stony Brook.