Création d'Epstein-Barr Virus croissance transformées lignées lymphoblastoïdes

Nous décrivons une méthode pour générer des lignes cellulaires transformées B à l'aide d'Epstein-Barr virus. Nous avons également illustrer un nouveau test qui permet d'identifier les cellules B destiné à subir une transformation aussi tôt que trois jours après l'infection.

L'infection de cellules B avec virus Epstein-Barr (EBV) conduit à la prolifération et l'immortalisation ultérieurs, résultant en l'établissement de lignées de cellules lymphoblastoïdes (LCL) in vitro. Depuis LCL sont infectées de façon latente par l'EBV, ils fournissent un système modèle pour étudier la latence du virus EBV et axée sur la prolifération des cellules B et la tumorigenèse ^1. LCL ont été utilisés pour présenter les antigènes dans une variété de dosages immunologiques ^{2, 3.} Par ailleurs, LCL peut être utilisé pour générer des anticorps monoclonaux humains ^{4, 5} et fournir une source potentiellement illimitée lorsque l'accès au matériel biologique primaire est limitée ^{6, 7.}

Une variété de méthodes ont été décrites pour générer LCL. Méthodes précédentes ont inclus l'utilisation de mitogènes tels que la phytohémagglutinine, le lipopolysaccharide ⁸ et ⁹ pokeweed d'accroître l'efficacité de l'EBV à médiation immortalisation. Plus récemment, d'autres ont utilisé immunosuppragents essive tels que la cyclosporine A pour inhiber des lymphocytes T destruction des cellules B infectées ^{7, 10-12.}

Le laps de temps considérable par l'EBV à l'établissement de lignées cellulaires entraîne le besoin de méthodes plus rapides et plus fiables pour l'EBV conduit la transformation de croissance des cellules B. Utilisant une combinaison de titre élevé EBV et un agent immunosuppresseur, nous sommes capables d'infecter constamment, transformer, et de générer LCL partir de cellules B dans le sang périphérique. Cette méthode utilise une petite quantité de cellules mononucléées du sang périphérique qui sont infectés dans les amas de cellules in vitro peut être démontrée. La présence de CD23 par l'EBV en présence du FK506, une cellule T immunosuppresseurs. Traditionnellement, excroissance de cellules B proliférantes est surveillé par la visualisation des amas microscopiques de cellules d'environ une semaine après l'infection par l'EBV. Des amas de LCL peut être vu par l'oeil nu, après plusieurs semaines. Nous décrivons un essai afin de déterminer rapidement si l'EBV médiation groissance de transformation est réussie avant même amas microscopiques de cellules peut être démontrée. La présence de CD23 ⁺ cellules CD58 ^Salut observée dès trois jours après l'infection indique un résultat positif.

1. EBV stock de la préparation

1. Subculture croissance exponentielle cellules B95-8 (ATCC # CRL 1612; 13) à 3 x 10 ⁵ cellules / ml dans un 75cm ² flacon de culture tissulaire en utilisant une technique stérile. Les cellules sont cultivées en RPMI complet contenant 1640 inactivées par la chaleur 10% de sérum fœtal bovin (FBS), pénicilline / streptomycine au 100U/ml et 100 pg / ml, respectivement, et l'amphotéricine B à 0,5 pg / ml à 37 ° C en présence de 5% de CO _2.
2. Quarante-huit heures plus tard, remettre les cellules en eau douce complète RPMI 1640 à 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Pour induire la production de virus, de stimuler les cellules avec 20ng/ml tétradécanoyl acétate de phorbol (TPA) pendant 1 heure dans une norme incubateur à CO _2. Laver les cellules trois fois avec du RPMI 1640 pour retirer le TPA.
3. Resuspendre les cellules dans le volume initial de complet RPMI 1640 (contre 1,2) et placer le ballon dans le CO ₂ incubateur pendant 96 heures. Cette méthode a été montré pour produire des titres élevés d'nominale virus infectieuxticles ^6.
4. Centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer les surnageant de culture contenant de l'EBV des cellules. Surnageant Filtrer à travers un filtre de 0,45 micron, aliquot, et conserver à -70 ° C pendant plus d'un an.
   Une alternative est d'obtenir le surnageant de cellules B95-8 contenant l'EBV de l'ATCC (VR-1492) et à utiliser à la dilution recommandée par l'ATCC.

2. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP)

1. Draw 10 ml de sang du donneur dans une seringue ou un tube hépariné sang hépariné. Diluer avec 20 ml de sang PBS à température ambiante dans un tube conique de 50 ml.
2. Sous-couche de sang dilué avec 15 ml de milieu Ficoll Hypaque séparation de lymphocytes. Centrifuger à 225 x g sans frein à la température ambiante pendant 30 minutes.
3. Retirez la couche leucocytaire et transférer dans un nouveau tube de 50 ml conique. Augmenter le volume à 50 ml avec du PBS et centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 10 minutes.
4. Pour le liquide surnageant. Laver les cellules par remise en suspension le culot dans 50 ml de PBS et de filer à 600 x g à température ambiante pendant 10 minutes. Laver deux fois plus dans une manière semblable.
5. Resuspendre lavé les cellules dans 1 ml de RPMI complet. Utilisez 5 pi de cellules pour préparer une dilution 1 / 10 en bleu Trypan. Nombre de cellules vivantes en utilisant un hématimètre.
6. Réglez le volume à l'aide de RPMI complet dans un flacon de 25 cm ² de culture de tissus pour obtenir une concentration cellulaire de 2 x 10 ⁶ / ml.

3. L'infection par l'EBV

1. Ajouter le FK506 (AG scientifique) à la suspension cellulaire de 2,6 à une concentration finale de 20 nM. Placez flacon de CO ₂ incubateur à 37 ° C pendant une heure.
2. Rapidement le dégel d'une partie aliquote de l'EBV. Retirer flacon de l'incubateur et d'ajouter l'EBV dans les cellules à 1 / 10 de dilution. Typiquement, cette dilution fournit une MOI de 50-100. Swirl flacon à mélanger et à le placer en position verticale dans _incubateur à CO2 à 37 ° C.

E Remarqueà l'étape 4, réalisé pour prédire le succès, est une étape facultative. Si l'étape 4 doit être effectuée, vous aurez besoin d'incuber un flacon supplémentaire de non-infectés PBMC à 2 x 10 ⁶ cellules / ml comme contrôle.

4. Identifier la population proliférante de cellules (étape optionnelle)

1. Préparer tampon FACS: PBS + 5% de FBS. Conserver à 4 ° C.
2. Faire l'anticorps suivants mélange dans un volume de 50 uL de chaque pour la coloration des cellules à l'étape 4.6. Dilutions d'anticorps doit être faite dans le tampon FACS contenant 1mg/ml d'IgG de souris (Sigma) à inhiber la liaison non spécifique par des anticorps.
   1. mono-coloré avec PE conjugué anti-CD23 anticorps (1 / 50 de dilution)
   2. mono-coloré avec FITC conjugué anti-CD58 anticorps (1 / 50 de dilution)
   3. mono-coloré avec PE-Cy5 conjugués anticorps anti-CD19 (1 / 50 de dilution)
   4. triple-colorées pour CD23, CD58, et CD19 (1 / 50 de dilution de chaque)
   5. unique teinté avec un contrôle PE isotype conjuguésd'anticorps adaptés à CD23-PE (à la même concentration que les anti-CD23 anticorps)
   6. unique colorés avec des anticorps isotype contrôle FITC conjugué adapté à CD58-FITC (à la même concentration que les anti-CD58 anticorps)
   7. mono-coloré avec PE-Cy5 anticorps conjugué de contrôle adapté à l'isotype CD19-PE-Cy5 (à la même concentration que anticorps anti-CD19)
   8. triple-colorés avec les trois anticorps isotype contrôle.
   Stocker temporairement les mélanges à 4 ° C dans l'obscurité.
3. En trois jours après l'exposition à l'EBV, doucement flacon tourbillonner pour obtenir une suspension cellulaire plus uniforme. Retirer du flacon 2ml dans un tube Eppendorf 2ml. Spin tube dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm à température ambiante pendant 3 minutes.
4. Aspirer cellules surnageant et remettre en mémoire tampon FACS à 5 x 10 ⁶ à 1 x 10 ⁷ cellules / ml.
5. Enlevez huit parties aliquotes 50 pl dans des tubes Eppendorf individu ou d'un de 96 puits à fond en V assiette. Spin tubes ou la plaque à 1500 x gpendant 3 minutes.
6. Jeter les tubes vortex de surnageant et / plaque. Resuspendre les cellules dans chaque tube / puits dans 50 pi de tampon FACS contenant des dilutions d'anticorps appropriés préparées en 4.2.
7. Incuber les tubes / plaque sur la glace dans l'obscurité pendant 30 minutes. Centrifuger les cellules à 3000 rpm pendant 3 minutes, retirez le surnageant et ajouter 200 ul de tampon FACS. Centrifuger les cellules et retirer le surnageant pour compléter le lavage. Répéter deux lavages.
8. Resuspendre les cellules dans 200 uL de tampon FACS et d'acquérir des données en utilisant un cytomètre en flux, l'acquisition de 20 000 événements / tube.
9. Analyser les données en utilisant WinMDI (freeware pour FACS analyse des données sur PC). Porte sur des cellules vivantes en utilisant des profils de dispersion avant et latérale. Puis, les cellules porte vivre pour l'expression de CD19 ⁺ (marqueur des cellules B) après comparaison avec les cellules colorées avec un anticorps isotype contrôle adaptés aux anticorps anti-CD19. Terrain CD19 ⁺ live cellules B avec une intensité de fluorescence pour CD23 sur l'axe x et l'intensité de fluorescence pour CD58 sur l'axe Y. Déterminer CD23 ⁺ CD58 ⁺ et les cellules en comparant à l'EBV ont exposé des cellules colorées par correspondance anticorps isotype contrôle. Présence de CD23 ⁺ CD58 ^Salut cellules EBV-exposées de la culture (figure 2C) prédit prolongement réussi de l'EBV infectées de croissance des cellules transformées. En revanche, CD23 ⁺ cellules CD58 ^Salut n'émergent pas lorsque les cellules ne sont pas exposés à l'EBV (figure 2A) ou exposé à une souche non immortalisant de l'EBV (figure 2B). CD23 CD58 ^Salut cellules ⁺ ont été expérimentalement démontré de subir la prolifération et par la suite établir des LCL (14).

5. Expansion et la cryoconservation de LCL

1. Visualisation des cellules par microscopie optique: En une semaine après l'infection à EBV, des amas de cellules sont visibles en microscopie optique. La figure 3 montre un exemple de début grappes microscopiques (figure 3B) dans un ballon.
2. Comme le temps passe, les grappes microscopiques deviennent plus grands tels que des bouquets sont visiblesmacroscopiquement dans le ballon. La figure 3C montre grandes grappes de cellules dans établies LCL en microscopie optique.
3. Nourrir les cellules: doubler le volume de milieu de culture dans le ballon de la culture au jour 12. Par la suite, étendre la culture en augmentant son volume 2-3 fois à l'aide de RPMI complet.
4. Périodicité des cellules d'alimentation doit être déterminée selon le taux de croissance des cellules. Lorsque le milieu de culture devient jaune, il est généralement temps de remplacer les médias comme ci-dessus. Typiquement, cela se produit une fois par semaine. Toutefois, certaines lignées cellulaires peuvent avoir besoin d'être nourri, plus ou moins fréquemment. Développer la culture à 75-100 ml au cours des prochaines semaines.
5. Cryoconservation: Quand le gel jusqu'à cellules, les cellules par centrifugation à 600 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez la cellule surnageant et remettre le culot dans un milieu de congélation froide contenant 90% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde à 1 x 10 ⁷ cellules / ml. Placer le tube dans l'azote liquide.

6. Les résultats représentatifs:

Succès est prédite par la présence de CD23 ⁺ CD58 ^Salut cellules. Environ 2-3% des cellules en direct sur 3-4 jours après l'exposition à l'EBV devrait avoir ce profil (figure 2C). D'autres sous-populations de CD23 ^+, CD23 ^-, CD58 ^+, CD58 et ^- les cellules observées après une exposition à l'EBV montre la prolifération minime ^14. Un des cellules infectées (figure 2A) et les cellules exposées à partir de l'EBV HH514-16 cellules (figure 2B), l'hébergement d'une souche non-immortalisant de l'EBV, ne démontrent pas CD23 ⁺ CD58 ^Salut cellules.

Vous pouvez également visualiser les cellules par microscopie optique pour contrôler le succès: Comme mentionné précédemment, une semaine après l'infection à EBV, de petits amas de cellules dans le ballon sont visibles au microscope optique (figure 3B). Comme le temps passe et les cellules se développer en LCL, amas microscopiques deviennent plus grands (figure 3C), tels que les amas sont visibles macroscopiquement dans le ballon.

Figure 1. Workflow pour la génération et la cryopréservation des lignées de cellules lymphoblastoïdes. Le sang périphérique est centrifugé à travers un gradient de Ficoll. Présents PBMC dans le buffy coat d'un gradient d'établis sont exposés à FK506 suivie par l'addition de l'EBV. EBV ont exposé des cellules sont cultivées à 37 ° C en présence de 5% de CO ₂ d'établir et d'étendre ultérieurement LCL pour la cryoconservation.

Figure 2. Identification d'une sous-population de cellules B devrait subir la prolifération après une exposition à l'EBV. Un-infectés PBMC (A) ou PBMC exposé à l'EBV provenant HH514-16 cellules (B) ou à partir de cellules B95-8 (C) en présence du FK506 ont été récoltés le jour 3. Les cellules ont été colorés avec un fluorochrome-conjugués anticorps dirigés contre CD19, CD23, CD58 et. Après gating sur cellules vivantess, non-infectées (A) et EBV-exposée (B et C) CD19 ⁺ cellules B ont été examinées pour l'expression de CD23 et CD58. Une sous-population de cellules B exprimant CD58 et de niveaux élevés de CD23 (CD23 CD58 ^{+ Salut),} observée uniquement dans les cellules exposées à la transformation compétents EBV (dérivée de cellules B95-8), est représenté.

Figure 3. Visualisation des amas de cellules dans les cellules infectées par l'EBV. PBMC ont été traités avec le FK506 et infectés par l'EBV. Un-infectées (A) et EBV-exposée (B), les cellules ont été examinées une semaine après l'infection par microscopie à contraste de phase (grossissement 10X). Cinq semaines ancienne ligne de cellules lymphoblastoïdes est montré en C.

La méthode décrite dans cet article génère LCL du sang du donneur périphérique avec l'immortalisation rapide et les temps de cryopréservation. Grâce à l'utilisation du FK506, un immunosuppresseur des cellules T, et des titres élevés de virus infectieux que nous sommes en mesure de favoriser la prolifération des cellules B infectées par EBV des cellules mononucléées du sang périphérique. Ces interventions font de la méthode décrite plus efficace, résultant en une expansion rapide de cellules pour des expériences ultérieures.

Traditionnellement, la transformation de croissance a été surveillée par la visualisation des amas de cellules par microscopie optique d'une semaine environ après l'exposition à l'EBV ^{6, 15.} Toutefois, le regroupement des cellules n'est pas un indicateur spécifique de la transformation de la croissance EBV médiation. Nous avons précédemment démontré identification cohérente de la population cellulaire proliférant à travers ¹⁴ cytométrie en flux, en fournissant une méthode précise et spécifique pour déterminer le succès le plus tôt que trois jours à l'arrièrel'exposition er des cellules B à l'EBV.

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Cette recherche a été financée par les subventions du NIH K08 AI062732, K12 HD001401, et 1UL1RR024139-02 et une subvention de recherche en santé des enfants de la Fondation Charles H. Hood SB-M. et par la Fondation de recherche à l'Université d'État de New York à Stony Brook.