Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.

Infección de las células B con el virus Epstein-Barr (EBV) conduce a la proliferación y posterior inmortalización, lo que resulta en el establecimiento de líneas de células linfoblásticas (LCL) in vitro. Desde LCL son latentes infectadas con este virus, que proporcionan un sistema modelo para investigar la latencia y el virus EBV impulsado por la proliferación de células B y la tumorigénesis ^1. LCL se han utilizado para presentar antígenos en una variedad de ensayos inmunológicos ^{2, 3.} Además, LCL se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales humanos ^{4, 5} y proporcionan una fuente potencialmente ilimitada cuando el acceso a materiales biológicos primaria es limitada ^{6, 7.}

Una variedad de métodos han sido descritos para generar LCL. Los métodos anteriores han incluido el uso de mitógenos como fitohemaglutinina, lipopolisacárido ⁸ y ⁹ mitógeno de hierba carmín para incrementar la eficiencia de VEB mediada por la inmortalización. Más recientemente, otros han utilizado immunosuppressive agentes, como la ciclosporina A para inhibir las células T mediada por el asesinato de las células B infectadas por ^{7, 10-12.}

El largo periodo de tiempo de la infección por EBV para el establecimiento de líneas celulares de las unidades de la necesidad de métodos más rápidos y más confiables para el VEB impulsada por la transformación B el crecimiento celular. Usando una combinación de alta EBV título y un agente inmunosupresor, que son capaces de infectar constantemente, transformar y generar LCL de las células B en sangre periférica. Este método utiliza una pequeña cantidad de células mononucleares de sangre periférica que se infectan en los cúmulos de células in vitro puede ser demostrada. La presencia de CD23 con este virus en la presencia de FK506, una célula T inmunosupresores. Tradicionalmente, la consecuencia de la proliferación de células B es controlada por la visualización de grupos microscópicos de células alrededor de una semana después de la infección con este virus. Los grupos de LCL se puede ver a simple vista después de varias semanas. Se describe un ensayo para determinar pronto si VEB mediada por grecimiento de transformación tiene éxito incluso antes de que grupos microscópicos de células se puede demostrar. La presencia de CD23 ^hi células CD58 ⁺ observó a tres días después de la infección indica un resultado exitoso.

1. EBV acciones de preparación

1. Subcultura que crece exponencialmente B95-8 células (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 ⁵ células / ml en un frasco de 75 cm ² de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. Las células se cultivan en completo RPMI 1640 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), penicilina / estreptomicina en 100U/ml y 100 ug / ml, respectivamente, y anfotericina B de 0,5 mg / ml a 37 ° C en presencia de 5% de CO _2.
2. Cuarenta y ocho horas más tarde, suspender las células en fresco RPMI 1640 completo en 1 x 10 ⁶ células / ml. Para inducir la producción de virus, estimular las células con 20ng/ml tetradecanoyl acetato de forbol (TPA) durante 1 hora en un estándar de incubadora de CO _2. Lavar las células tres veces con RPMI 1640 para eliminar la TPA.
3. Resuspender las células en el volumen original de RPMI 1640 completo (de 1.2) y colocar el matraz en incubadora de CO ₂ durante 96 horas. Este método se ha demostrado que producen altos títulos de par virus infecciosotículos ^6.
4. Centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4 ° C para separar EBV que contienen sobrenadante de cultivo de células. Sobrenadante del filtro a través de un filtro de 0,45 micrones, alícuota y almacenar a -70 ° C durante más de un año.
   Una alternativa es obtener el sobrenadante de B95-8 que contiene las células EBV de la ATCC (VR-1492) y el uso a la dilución recomendada por la ATCC.

2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)

1. Draw 10 ml de sangre de donantes en una jeringa heparinizada o un tubo de sangre heparinizada. Diluir la sangre con 20 ml de PBS a temperatura ambiente en un tubo cónico de 50 ml.
2. Subyace la sangre diluida con 15 ml de medio de separación Ficoll Hypaque linfocitos. Centrifugar a 225 x g sin freno a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Quitar la capa leucocitaria y la transferencia a un nuevo tubo de 50 ml cónico. Suben el volumen hasta 50 ml con PBS y se giran a 600 xg a temperatura ambiente durante 10 minutos.
4. Pour el sobrenadante. Lavar las células por la resuspensión de sedimento en 50 ml de PBS y centrifugado a 600 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar dos veces más de una manera similar.
5. Resuspender las células lavadas en 1 ml de RPMI completo. Use 5 l de las células para preparar una dilución 1 / 10 en azul tripán. Contador de células vivas utilizando un hemocitómetro.
6. Ajuste el volumen utilizando RPMI completo en un 25 cm ² frasco de cultivo de tejido para obtener una concentración celular de 2 x 10 ⁶ / ml.

3. La infección con EBV

1. Añadir FK506 (AG Científica) para la suspensión celular de 2,6 a una concentración final de 20 nM. Lugar botella de CO ₂ incubadora a 37 ° C durante una hora.
2. Rápido deshielo de una parte alícuota de este virus. Quitar frasco de la incubadora y añadir EBV a las células a dilución 1 / 10. Por lo general, esta dilución proporciona una MOI de 50 a 100. Remolino matraz para mezclar bien y colocarlo en posición vertical en incubadora de CO ₂ a 37 ° C.

Nota ªen el Paso 4, realizada para predecir el resultado exitoso, es un paso opcional. Paso 4 Si va a realizar, será necesario para la incubación de un frasco adicional de la ONU infectados PBMC a 2 x 10 ⁶ células / ml como control.

4. La identificación de la población la proliferación de las células (paso opcional)

1. Preparar tampón FACS: PBS + 5% de SFB. Almacenar a 4 ° C.
2. Hacer la siguiente mezcla de anticuerpos en un volumen de 50 l cada uno para la tinción de las células en el Paso 4.6. Diluciones de anticuerpos deben hacerse en tampón FACS contiene 1mg/ml de IgG de ratón (Sigma) para inhibir la unión no específica de los anticuerpos.
   1. solo teñidas con PE conjugado de anticuerpos anti-CD23 (1 / 50 de dilución)
   2. solo se tiñeron con FITC conjugado anti-CD58 de anticuerpos (1 / 50 de dilución)
   3. solo teñidas con PE-Cy5 conjugado de anticuerpos anti-CD19 (1 / 50 de dilución)
   4. triple tinción para CD23, CD58, CD19 y (1 / 50 de cada dilución)
   5. solo se tiñeron con el control de isotipo conjugado con PEanticuerpos coincide con CD23-PE (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD23)
   6. solo se tiñeron con anticuerpo conjugado FITC isotipo de control coincide con CD58-FITC (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD58)
   7. solo teñidas con PE-Cy5 anticuerpos conjugados isotipo de control coincide con CD19-PE-Cy5 (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD19)
   8. triple-teñidas con los tres anticuerpos isotipo de control.
   Almacenar temporalmente la mezcla a 4 ° C en la oscuridad.
3. En el tercer día posterior a la exposición a este virus, cuidado frasco agitar para obtener una suspensión celular más uniforme. Quitar 2 ml del frasco en un tubo Eppendorf de 2 ml. Girar el tubo en una microcentrífuga a 3000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos.
4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS a 5 x 10 ⁶ a 1 x 10 ⁷ células / ml.
5. Extraiga ocho alícuotas 50μl en tubos Eppendorf individuales o una placa de 96 pocillos de fondo en V. Tubos de centrifugado o la placa a 1500 x gdurante 3 minutos.
6. Descartar el sobrenadante y los tubos de vórtice / placa. Resuspender las células en cada tubo / y en 50 l de tampón FACS que contienen las diluciones adecuadas de anticuerpos preparados en 4,2.
7. Incubar los tubos / placa de hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se centrifuga a 3000 rpm durante 3 minutos, retire el sobrenadante y añadir 200 l de tampón FACS. Centrifugar las células de nuevo y eliminar el sobrenadante para completar el lavado. Repita dos lavados más.
8. Resuspender las células en 200 l FACS buffer y la adquisición de datos utilizando un citómetro de flujo, la adquisición de 20.000 eventos / tubo.
9. Analizar datos usando WinMDI (freeware para FACS análisis de datos en el PC). Puerta de células vivas mediante perfiles de dispersión frontal y lateral. Luego, las células viven puerta para la expresión de CD19 ⁺ (marcador de células B), después de comparar con las células teñidas con el anticuerpo control de isotipo coincide con anticuerpos anti-CD19. Parcela B CD19 ⁺ en vivo las células con la intensidad de fluorescencia de CD23 en el eje X y la intensidad de fluorescencia para CD58 en el eje. Determinar CD23 ⁺ y CD58 ^{+ en las} células mediante la comparación con el EBV-expuestos células teñidas con anticuerpos isotipo emparejado control. La presencia de CD23 ⁺ CD58 ^hi células EBV-expuestos de cultivo (Fig. 2C) predice consecuencia el éxito de las células infectadas con EBV de crecimiento transformado. Por el contrario, CD23 ^hi células CD58 ⁺ no surgen cuando las células no están expuestos a este virus (Figura 2) o expuestos a una cepa no inmortalizando de EBV (Figura 2B). CD23 ^hi células CD58 ⁺ se han demostrado experimentalmente que someterse a la proliferación y, posteriormente, establecer LCL (14).

5. La expansión y la criopreservación de LCL

1. Visualización de las células al microscopio óptico: Por una semana después de la infección por VEB, grupos de células son visibles al microscopio óptico. La Figura 3 muestra un ejemplo de los primeros grupos microscópicos (Figura 3B) en un matraz.
2. Con el tiempo, los grupos microscópicos se hacen más grandes grupos de tal manera que sean visiblesmacroscópicamente en el matraz. Figura 3C muestra grandes grupos de células en LCL establecido por microscopía de luz.
3. La alimentación de las células: el doble de volumen de medio de cultivo en el frasco de cultivo en el día 12. Posteriormente, ampliar la cultura mediante el aumento de su volumen de 2.3 veces con RPMI completo.
4. Periodicidad de las células de alimentación debe ser determinado con base en la tasa de crecimiento de las células. Cuando el medio de cultivo se vuelve amarilla, por lo general el momento de sustituir los medios de comunicación que el anterior. Normalmente, esto ocurre una vez por semana. Sin embargo, algunas líneas celulares pueden necesitar ser alimentado con más o con menos frecuencia. Ampliar la cultura de 75 a 100 ml durante las próximas semanas.
5. Criopreservación: Al congelar las células de las células se centrifuga a 600 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de células y resuspender el pellet en medio de un frío que contiene 90% de SFB y el 10% dimetilsulfóxido a 1 x 10 ⁷ células / ml. Colocar el tubo en nitrógeno líquido.

6. Los resultados representativos:

Éxito está en relación con la presencia de CD23 ⁺ CD58 ^hi células. Aproximadamente 2.3% de células vivas en el día 3-4 después de la exposición a este virus debe tener este perfil (Fig. 2C). Otros sub-poblaciones de CD23 ^+, CD23 ^-, CD58 ^+, CD58 y ^- las células observadas después de la exposición a este virus muestran la proliferación de un mínimo de ^14. Un de las células infectadas (Figura 2A) y las células expuestas a este virus de HH514-16 células (Figura 2B), que alberga una cepa no inmortalizando de EBV, no demuestran CD23 ⁺ CD58 ^hi células.

También puede visualizar las células al microscopio óptico para controlar éxito: Como se mencionó anteriormente, dentro de una semana después de la infección por VEB, pequeños grupos de células en el matraz son visibles al microscopio óptico (Figura 3B). A medida que avanza el tiempo y las células se convierten en LCL, los grupos microscópicos se hacen más grandes (Figura 3C) de tal manera que son visibles macroscópicamente grupos en el matraz.

Figura 1. Flujo de trabajo para la generación y la criopreservación de líneas de células linfoblásticas. Sangre periférica, se centrifuga a través de un gradiente de Ficoll. PBMC presente en la capa leucocitaria de un gradiente establecido se exponen a FK506 seguido por la adición de este virus. EBV-expusieron células se cultivan a 37 ° C en presencia de 5% de CO ₂ para establecer y posteriormente ampliar LCL para la criopreservación.

Figura 2. Identificación de una subpoblación de células B espera de someterse a la proliferación después de la exposición a este virus. Un infectados PBMC (A) o PBMC expuestos a este virus derivados de HH514-16 células (B) o de células B95-8 (C) en presencia de FK506 fueron cosechadas en el día 3. Las células se tiñeron con fluorocromo y conjugado con anticuerpos dirigidos contra CD19, CD23, CD58 y. Después de gating en células vivass, sin infección (A) y EBV-expuestos (B y C) las células B CD19 ⁺ fueron examinados para la expresión de CD23 y CD58. Una subpoblación de células B que expresan CD58 y los niveles altos de CD23 (CD23 ^hi CD58 ^+), observado sólo en las células expuestas a la transformación competente EBV (derivado de la B95-8 células), se representa.

Figura 3. Visualización de grupos de células en las células infectadas por EBV. PBMC fueron tratados con FK506 e infectadas con este virus. Un infectadas (A) y EBV-expuestos (B), las células fueron examinados una semana después de la infección por microscopía de contraste de fase (10 aumentos). Cinco semanas de la antigua línea de células linfoblásticas se muestra en la C.

El método descrito en este documento genera LCL de donantes de sangre periférica, con la inmortalización rápido y los tiempos de criopreservación. Mediante el uso de FK506, un inmunosupresor de células T, y altos títulos de virus infecciosos que son capaces de promover la proliferación de las células B infectadas con EBV en las células mononucleares de sangre periférica. Estas intervenciones que el método descrito más eficiente, resultando en la rápida expansión de las células para los experimentos posteriores.

Tradicionalmente, la transformación del crecimiento ha sido supervisado por la visualización de grupos de células por microscopía de luz alrededor de una semana después de la exposición a este virus ^{6, 15.} Sin embargo, la agrupación de células no es un indicador específico de la transformación del crecimiento mediada por VEB. Hemos demostrado anteriormente identificación consistente de la población de células proliferantes mediante citometría de flujo ^14, proporcionando un método preciso y específico para determinar el resultado exitoso tan pronto como tres días de popaer la exposición de las células B a este virus.

No hay conflictos de interés declarado.

Esta investigación fue financiada por el NIH K08 AI062732, K12 HD001401, y 1UL1RR024139-02 y una beca de investigación de Salud Infantil de la Charles H. Hood Foundation para SB-M. y por la Fundación para la Investigación de la Universidad Estatal de Nueva York en Stony Brook.