엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 B 세포의 감염은 체외에서 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL)의 설립에 결과 증식 및 후속 불멸화 발생합니다. LCL은 latently EBV에 감염되므로, 그들은 EBV 지연 및 바이러스 기반의 B 세포 증식과 tumorigenesis ¹ 조사 모델 시스템을 제공합니다. LCL은 immunologic의 assays ^{2, 3의} 다양한 항원을 제시하는 데 사용되었습니다. 또한, LCL은 인간 단클론 항체 ^{4, 5를} 생성하고 기본 생물 학적 물질에 대한 액세스가 ^{6, 7} 제한됩니다 잠재적으로 무제한 소스를 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

다양한 방법은 LCL을 생성 설명했습니다. 이전 방법은 phytohemagglutinin, lipopolysaccharide ^8로 mitogens의 사용을 포함하고, EBV - 중재 불멸화의 효율성을 높이기 위해 mitogen ⁹ pokeweed있다. 최근 다른 immunosuppr를 사용한같은 시클 로스 포린과 같은 essive 에이전트는 감염된 B 세포 ^{7, 10-12의} T 세포 - 매개 살인을 억제합니다.

EBV 감염의 세포 라인 설립 시간의 상당한 길이는 EBV 중심 B 세포의 성장 변환에 대한 더 빠르고, 좀 더 신뢰할 수있는 방법에 대한 요구 사항을 드라이브. 높은 titer EBV와 immunosuppressive 대리인의 조합을 사용하여, 우리는 지속적으로, 감염 변환, 그리고 주변 혈액에서 B 세포의 LCL를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 세포의 체외 클러스터에 감염된 말초 혈액 mononuclear 세포의 작은 금액이 시연 수 있습니다 사용합니다. FK506, 면역 반응 억제제 T 세포의 존재에 EBV와 CD23의 존재. 전통적으로, proliferating B 세포의 가지는 EBV로 감염 후 일주일에 대한 세포의 미세한 클러스터의 시각화에 의해 모니터링됩니다. LCL의 대단히 짧은 시간은 몇 주 후에 육안으로 볼 수 있습니다. 우리는 결정하기 위해 분석을 설명하는 초기 EBV - 중재 g 경우rowth 변환은 세포의 현미경 클러스터가 시연 수 있습니다 전에도 성공이다. CD23의 존재는 ^하이 CD58 ⁺ 세포로 초기 셋처럼 일 후 감염에게 관찰은 성공적인 결과를 나타냅니다.

1. EBV 재고 준비

1. 멸균 기술을 사용하여 ^75cm이 조직 문화 플라스크에서 3 × 10 ⁵ 세포 / ML에서, 기하 급수적으로 B95 - 8 세포 (13 ATCC # CRL 1612) 성장 Subculture. 전지는 37 0.5 μg / ML에서 각각 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 / 100U/ml에서 스트렙토 마이신과 100 μg / ML을 포함하는 완전한 RPMI 1640에서 성장하고, Amphotericin B 아르 ° C를 면전에서 5% CO _2.
2. 마흔 여덟 시간 후, 1 × 10 ⁶ 세포 / ML에서 신선한 완료 RPMI 1640에 resuspend 세포. 바이러스 생산을 유발하기 위해서, 표준 CO ₂ 배양기에서 1 시간 동안 20ng/ml tetradecanoyl phorbol 아세테이트 (TPA)와 세포를 자극. TPA를 제거하는 RPMI 1640과 세포 세 번 씻으십시오.
3. 전체 RPMI 1640의 원래 볼륨 (1.2부터)에 세포를 Resuspend 및 96시간에 대한 CO ₂ 배양기에서 술병을 배치. 이 방법은 전염성 바이러스 파의 높은 titers을 생산하기 위해 표시되었습니다ticles ^6.
4. 4 10 분 600 X g에서 원심 ° C 세포에서 EBV - 포함된 문화 뜨는 분리 수 있습니다. 년 이상 -70에서 0.45 - 마이크론 필터, 나누어지는 및 저장 ° C를 통해 필터 뜨는.
   대안은 ATCC (VR - 1492)에서 EBV를 포함하는 B95 - 8 세포에서 뜨는을 획득하고 ATCC에서 권장하는 희석에 사용하는 것입니다.

2. 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)의 분리

1. heparinized 주사기 또는 heparinized 혈액 튜브에 기증자 10 ML 혈액을 그립니다. 50 ML 원뿔 튜브의 상온 20 ML PBS로 혈액을 희석.
2. 15 ML Ficoll Hypaque 림프구 분리 매체와 밑받침 희석 혈액. 30 분 동안 상온에서 브레이크없이 225 X g에서 원심 분리기.
3. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 버피 코트와 송금을 제거합니다. PBS로 50 ML에 볼륨을 인상하고 10 분 동안 상온에서 600 XG에 스핀.
4. Pou뜨는 해제 R. 50 ML PBS에서 펠렛을 resuspending 10 분 상온에서 600 X g에서 회전하여 세포를 씻으십시오. 비슷한 방식으로 두 번 이상 씻으십시오.
5. Resuspend 완료 RPMI 1 ML에서 세포를 씻어. Trypan 파란색으로 10분의 1 희석을 준비하는 세포의 5 μL를 사용하십시오. hemocytometer를 사용하여 라이브 세포를 세어보세요.
6. 2 × 10 ⁶ / ML의 세포 농도를 구하는 ^25cm이 조직 문화 플라스크에 완료 RPMI를 사용하여 볼륨을 조정합니다.

3. EBV로 감염

1. 2.6 20 NM의 최종 농도로 세포 현탁액에 FK506을 (AG 과학) 추가합니다. 37 CO ₂ 배양기에 넣어 플라스크 ° 한 시간 만이라도 C.
2. 신속 EBV의 나누어지는을 녹여. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 10분의 1 희석에있는 세포에 EBV를 추가합니다. 일반적으로이 희석은 방어 50-100을 제공합니다. 37 믹스와 CO ₂ 배양기에서 똑바로 그것을 배치 소용돌이 플라스크 ° C.

참고 일성공적인 결과를 예측 수행 4 단계에서 단계는 선택 사항입니다. 4 단계는 수행할 수있다면, 당신은 통제로이 X 10 ⁶ 세포 / ML에서 취소 감염 PBMC의 추가 휴대용 술병을 품어해야합니다.

4. 세포 proliferating 인구 (선택 단계)를 식별

1. PBS + 5퍼센트 FBS : FACS 버퍼를 준비합니다. 4 저장 ° C.
2. 다음과 같은 항체 단계 4.6에서 세포를 얼룩 50 μL 부피 각 혼합합니다. 항체 dilutions는 마우스 IgG (시그마)의 1mg/ml이 항체에 의한 비 특정 바인딩을 억제하기 위해 포함 FACS 버퍼에하여야한다.
   1. PE 복합 백신 CD23 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진
   2. FITC 복합 백신 CD58 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진
   3. PE - Cy5 복합 백신 CD19 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진
   4. CD23, CD58, CD19 및 (50분의 1 희석 각)의 트리플 얼룩진
   5. PE 복합 isotype 컨트롤과 함께 단일 얼룩진항체가 (안티 CD23 항체와 같은 농도에서) CD23 - PE와 일치
   6. (안티 CD58 항체와 같은 농도에서) CD58 - FITC FITC와 일치 복합 isotype 제어 항체와 단일 얼룩진
   7. 로 단일 PE - Cy5 묻은 복합 isotype 제어 항체는 일치 CD19 - PE - Cy5 (안티 CD19 항체와 같은 농도에서)
   8. 세 isotype 제어 항체와 트리플 얼룩.
   임시 어둠의 4 ° C에서 믹스를 저장합니다.
3. EBV에 3 일이 후 노출에 부드럽게 소용돌이 플라스크는보다 균일한 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 2ml Eppendorf 튜브에 플라스크에서 2ml를 제거합니다. 3 분 상온에서 3,000 rpm으로 microcentrifuge에 튜브를 돌려.
4. 5 X ^10월 6일부터 1일까지 X 10 ⁷ 세포 / ML에서 FACS 버퍼에 뜨는 및 resuspend 세포를 기음.
5. 여덟 50μl 개별 Eppendorf 튜브에 aliquots 또는 96 - 웰 V - 바닥 플레이트를 제거합니다. 스핀 튜브 또는 1,500 X g에서 판3 분.
6. 뜨는 및 와동 튜브 / 접시를 폐기하십시오. 각각의 튜브에 Resuspend 세포 / 음 4.2 준비 적절한 항체 dilutions을 포함 FACS 버퍼 50 μL 인치
7. 30 분 어둠 속에서 얼음 튜브 / 플레이트를 품어. 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기 세포는 표면에 뜨는 제거 및 FACS 버퍼 200 μL를 추가합니다. 또 세포를 원심 분리기와 세척을 완료 뜨는 제거합니다. 두 번 더 씻는다를 반복합니다.
8. 200 μL FACS에서 Resuspend 세포가 20,000 사건 / 튜브를 취득 흐름 cytometer를 사용하여 데이터를 버퍼와 취득.
9. WinMDI를 (PC에서 FACS 데이터 분석을위한 프리웨어)를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란 프로파일을 사용하여 라이브 세포 게이트. 그런 다음, 안티 CD19 항체에 일치하는 isotype 제어 항체 물들일 세포와 비교 후 CD19 ⁺ (B 세포 마커)의 표현을위한 게이트 살 세포. 플롯 CD19 ⁺ B 사는 Y 축에 대한 X 축 및 CD58에 대한 형광 강도에 CD23에 대한 형광 강도와 세포. 결정 CD23 ⁺ 및 CD58 ⁺ 일치 isotype 제어 항체 물들일 EBV 노출 세포에 비교하여 세포. EBV 노출 문화에 CD23 CD58 ⁺ 세포 ^{안녕하세요} (그림 2C)의 존재는 EBV에 감염된 세포 성장 변화의 성공적인 파생물을 예측합니다. 세포 EBV (그림 2A)에 노출 또는 EBV (그림 2B)의 비 immortalizing 변형에 노출되지 않은 경우 반대로, CD23 CD58 ^{+ 안녕하세요} 전지는 등장하지 않습니다. CD23 ^안녕 CD58 ⁺ 세포가 실험적으로 확산을 받아야 시연 및 이후 LCL (14)을 수립하고 있습니다.

5. LCL의 확장 및 cryopreservation

1. 가벼운 현미경에 의한 세포의 시각화 : EBV 감염 후 일주일함으로써, 세포의 클러스터는 가벼운 현미경으로 볼 수 있습니다. 그림 3은 플라스크에 초기 미세한 클러스터 (그림 3B)의 예를 보여줍니다.
2. 시간이 진행되면서 미세한 클러스터는 큰 그러한 것을 대단히 짧은 시간이 표시되는가macroscopically 술병 인치 그림 3C는 가벼운 현미경에 의해 설립된 LCL의 세포의 큰 클러스터를 보여줍니다.
3. 세포를 먹이 : 일 12 일 문화 플라스크에 배지의 볼륨을 두 번. 그 후, 전체 RPMI를 사용하여 볼륨을 2-3 배 증가하여 문화를 확장합니다.
4. 먹이 세포의 주기성은 세포 성장 속도에 따라 결정되어야합니다. 문화 매체가 노란색 켜면, 일반적으로 위와 같이 미디어를 대체하는 시간이다. 일반적으로이 한번 주당 발생합니다. 그러나, 일부 세포 라인은 더 많거나 적은 빈도로 공급해야 할 수 있습니다. 다음 몇 주 동안 75-100 ML에 문화를 확장합니다.
5. Cryopreservation : 세포를 냉동하면 상온에서 10 분 동안 600 X g에서 원심 세포. 1 X 10 ⁷ 세포 / ML 90 % FBS를 포함하는 차가운 냉동 미디어와 10 % dimethylsulfoxide에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 액체 질소에 넣어 튜브.

6. 대표 결과 :

성공적인 결과는 CD23 CD58 ⁺ 세포 ^안녕의 존재가 예측됩니다. EBV에 노출된 후 3-4일에 살고 세포의 약 2-3 %가이 프로필 (그림 2C)가한다. 기타 CD23의 하위 인구 ^+, CD23 ^- CD58 ^+, CD58과 ^- 전지는 EBV에 노출된 후 최소한의 확산 ¹⁴ 보여주 관찰했다. EBV의 비 immortalizing 부담을 품고 HH514 - 16 세포 (그림 2B)에서 EBV에 노출된 취소 감염된 세포 (그림 2A)와 세포는 CD23 CD58 ⁺ 세포 ^안녕을 설명하지 않습니다.

일주일 이내에, 앞서 언급한 EBV 감염 후 플라스크에 세포의 작은 클러스터 조명 현미경 (그림 3B)에서 볼 수 있습니다 : 당신은 또한 성공적인 결과를 모니터링하는 가벼운 현미경으로 세포를 시각화 수 있습니다. 시간 진행과 세포가 LCL로 발전로서 미세한 클러스터는 대단히 짧은 시간은 술병에 macroscopically 볼 수 있습니다 그러한 (3C 그림) 큰됩니다.

그림 1. lymphoblastoid 세포 라인의 생성 및 cryopreservation을위한 워크플로. 주변 혈액 Ficoll 기울기를 통해 centrifuged입니다. 설립 그라디언트의 버피 코트를 입고 PBMC 선물은 EBV의 또한 다음 FK506에 노출되어 있습니다. EBV - 노출된 세포는 37 ° C 수립 이후 cryopreservation에 대한 LCL을 확대하여 5 % CO _2의 존재에 재배하고 있습니다.

그림 2. EBV에 노출 후 확산을 받아야 것으로 예상 B 세포의 하위 인구의 식별. 취소 감염된 PBMC (A) 또는 PBMC가 HH514 - 16 세포 (B) 또는 FK506의 존재에 B95 - 8 세포 (C)에서 파생된 EBV에 노출하는 것은 일 3 수확했다. 세포는 CD19, CD23, CD58에 대한 감독 및 fluorochrome - 복합 항체로 얼룩진했다. 라이브 세포에 게이팅 후의, 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B와 C) CD19 ⁺ B 세포는 CD23과 CD58의 표현을위한 검사되었습니다. CD23의 CD58와 높은 수준 (CD23 CD58 ^{+ 하이)를} 표현하는 B 세포의 하위 인구가 그려져 있습니다, 오직 능력 변환 EBV (B95 - 8 세포에서 파생된)에 노출 세포에서 관찰했다.

그림 3. EBV에 감염된 세포에서 세포 클러스터의 시각화. PBMC는 FK506과 치료 및 EBV에 감염되었습니다. 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B) 세포 위상 콘트라스트 현미경 (10X 배율)로 일주 후 감염 검사되었습니다. 다섯 주 오래된 lymphoblastoid 전지 라인은 C로 표시됩니다

이 문서에서 설명하는 방법은 빠른 불멸화 및 cryopreservation 시간으로 기증자 말초 혈액에서 LCL를 생성합니다. FK506의 사용을 통해, T 세포 면역 반응 억제제를, 그리고 전염성 바이러스의 높은 titers 우리는 주변 혈액 mononuclear 세포에서 EBV에 감염된 B 세포의 증식을 촉진 할 수 있습니다. 이러한 개입은 후속 실험을 위해 세포의 급속한 확대의 결과로, 설명한 방법보다 효율적으로합니다.

전통적으로 성장 변화는 EBV ^{6 15} 노출 후 주일 가벼운 현미경에 의한 세포의 클러스터의 시각화에 의해 감시되었다. 그러나, 세포의 클러스터링은 EBV - 인한 성장 변환의 특정 표시되지 않습니다. 우리는 이전에 삼일 후미 빠르면 성공적인 결과를 결정하기 위해 정확하고 구체적인 방법을 제공 유동세포계측법 ^14를 통해 proliferating 세포 인구의 지속적인 신분을 증명하고있다EBV에 B 세포의 보틀 노출.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 연구는 NIH 보조금 K08 AI062732, K12 HD001401 및 1UL1RR024139 - 02과 SB - M에 찰스 H. 후드 재단의 아동 건강 연구소 부여에 의해 투자되었다. 와 스토니 브룩 뉴욕 주립 대학의에서 연구 재단.