Polietileno Glicol eficiente Transformação Mediada (PEG) do Moss Physcomitrella patens

Um método simples e eficiente para transformar Physcomitrella pantens Protoplastos é descrito. Este método é adaptado de protocolos para Physocmitrella Protonemal protoplastos e Arabidopsis Transformação de protoplastos do mesófilo ¹.

1. Tornando o Protoplastos

1. Adicionar 9 ml de 8% manitol a uma placa de Petri.
2. Usando uma espátula, coloque sete dias de idade musgo 2-3 PPNH4 placas de 5 - na placa de Petri contendo manitol.
3. Adicionar 3 mL de Driselase 2% (Sigma D9515-25G) para a placa de Petri.
4. Incubar a placa de Petri, à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 hora.
5. Filtrar a suspensão de protoplastos através de uma malha M 100 (BD Falcon 352.350).
6. Gire a suspensão filtrada em 250 g por 5 minutos. Remover o sobrenadante.
7. Re-suspender a protoplastos muito suavemente, com 500 mL de manitol 8%.
8. Adicionar 9,5 mL de manitol 8% no tubo de cultura. Certifique-se de protoplastos são totalmente suspensos.
9. Repita a filtragem e re-suspensão etapas (1.6, 1.7 e 1.8) mais duas vezes.
10. Tomar 10 mL da solução de protoplastos e contar os protoplastos em um hemocitômetro.
11. Multiplicar o número de protoplastos em uma área de 16 quadrados por 10 mil para obter o número de protoplastos por mL (Figura 1).

2. Transformação

1. Gire a suspensão de protoplastos em 250 g por 5 minutos. Remover o sobrenadante.
2. Re-suspender de protoplastos em solução de MMG na concentração de 1,6 milhões de protoplastos / mL.
3. Incubar a suspensão de protoplastos em temperatura ambiente por 20 minutos.
4. Adicionar 600 mL da suspensão de protoplastos em um tubo de cultura contendo 60 g de DNA. Agitar o tubo cuidadosamente.
5. Adicionar 700 mL de PEG / Ca solução na mistura de protoplastos / DNA. Redemoinho suavemente o tubo até que a mistura toda é homogênea.
6. Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos.
7. Durante este período de espera, cubra PRM-B placas com papel celofane (80 círculos mm de diâmetro, AA Packaging Limited, UK); permitir celofane para hidratar na superfície da placa durante pelo menos 5 min.
8. Com uma espátula, retire as bolhas de ar presas entre o celofane eo prato.
9. Diluir a mistura com 3 mL de solução W5.
10. Girar a mistura de 250 g por 5 minutos. Remover o sobrenadante.
11. Re-suspender de protoplastos em 2 mL da PRM derreteu-T (antes de adicioná-lo ao protoplastos esta solução pode ser mantido líquido a 42 ° C). Placa de 1 mL de re-suspensão de protoplastos por PRM-B placa coberta por papel celofane. Enrole as placas com micropore (3M, Cuidados de Saúde). Mantenha as placas a 25 ° C em câmara de crescimento.
12. Alternativamente, protoplastos pode ser re-suspenso em 1 mL de meio de revestimento líquido e 0,5 mL semeadas em uma placa de PRM-B coberto com papel celofane. Isto permite acelerar a regeneração, mas o número de plantas em regeneração é menor.
13. Câmara de crescimento é definida para uma hr 16. luz e 8 horas. ciclo escuro.
14. Mover o celofane para a uma placa nova seleção quatro dias após a transformação.

3. Resultados representativos:

Um exemplo de transformação é mostrado na Figura 2. O DNA utilizado neste exemplo foi um superenrolado 7,8 kb do plasmídeo carregando uma fita resistente à higromicina. A quantidade de protoplastos banhado foi reduzida para 50% para a fotografia. As fotos foram tiradas duas semanas depois que as plantas foram transferidas para as placas de seleção. A eficiência de transformação não é afetada pela concentração de DNA até 60 mg. Maiores concentrações de DNA são prejudiciais para a eficiência de transformação. Os dados mostraram que este método proporciona resultados consistentes em uma ampla faixa de quantidades de DNA. Este método também pode gerar transformantes estáveis ​​de forma eficaz, como mostrado na Tabela 1, podemos obter cerca de 4 transformantes estáveis ​​por micrograma de DNA linearizado, que é muito maior do que o que foi relatado anteriormente ^14.

Também testamos o efeito do choque térmico sobre a eficiência de transformação, transformando um plasmídeo superenrolado carregando um gene de uma proteína fluorescente como um marcador. O choque térmico foi realizada 10 minutos após incubação à temperatura ambiente (dentro de Passo 2.6), incubando a mistura em banho-maria a 45 ° C por 3 minutos. A mistura foi incubada em banho-maria à temperatura ambiente imediatamente após o choque térmico durante 17 min. Os resultados foram registrados 22 horas após a transformação. Os rácios de transformantes obtidos com e sem choque térmico foram muito semelhantes (~ 25%), mas observamos um efeito adverso de choque térmico sobre a viabilidade da protoplastos (dados não mostrados).

Figura 1. Ver de protoplastos em hemocitômetro. A seção necessária para a contagem de protoplastos é indicado por um quadrado vermelho. Observe a 16 quadrados necessários para a contagem de protoplastos (ver 1.11), a imagem mostra uma contagem de 24 de protoplastos (240.000 células / mL).

Figura 2. Fotos de 18 dias de idade transformantes transitória. Protoplastos foram transformado com a quantidade indicada de plasmídeo superenrolado. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.

Tabela de eficiência de transformação 1. DNA em quantidades diferentes.

O método aqui apresentado permite uma transformação DNA simples e consistente em protoplastos Physcomitrella patens. Este método foi originalmente desenvolvido para Arabidopsis ^1, mas aqui nós demonstramos que ele executa bem com protoplastos de Physcomitrella patens, uma planta simples e diferente. Portanto, esse método pode ser aplicado a outras espécies vegetais com pequenas modificações. Possíveis modificações para a otimização incluem concentração de protoplastos em MMG, tempo de incubação em solução de MMG e PEG / Ca. Nós escolhemos usar 60 mg de DNA em nossos experimentos de rotina porque o número de transformantes aumenta linearmente com a concentração de DNA até este ponto (Tabela 1). Poderíamos obter aproximadamente 7.000 transformantes transitória ou 200 transformantes estáveis ​​em um único transformação DNA 60 mg, que permite a triagem e análise de uma grande população de plantas.

Os protoplastos transformados podem ser distribuídos com o meio de revestimento líquido ou PRM-T. Embora a eficiência de regeneração é menor quando o meio de revestimento líquido é usado, escolhemos este método quando os protoplastos foram transformadas com plasmídeos superenrolado. Como mostrado na Tabela 1, as transformações feitas com DNA plasmidial superenrolado transformantes gerar muitos mais e, assim, ainda podemos obter um grande número de plantas com meio de revestimento líquido. Além disso, espalhando protoplastos com o meio líquido de revestimento permite acelerar a regeneração, o que é importante para experimentos envolvendo fenótipos transitórios, tais como RNAi derrubar experimentos ^9,15. Além disso, a ausência de agar top permite o isolamento planta fácil para a imunocoloração e RT-PCR ^9,15.

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