JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لتحويل Physcomitrella pantens protoplasts. ويتم تكييف هذا الأسلوب من بروتوكولات Physocmitrella protonemal والجبلة المجردة Arabidopsis التحول mesophyll الجبلة المجردة 1.

Abstract

وصفت طريقة بسيطة وفعالة لتحويل Physcomitrella protoplasts pantens. ويتم تكييف هذا الأسلوب من بروتوكولات لPhysocmitrella protonemal الجبلة المجردة وArabidopsis التحول الجبلة المجردة mesophyll 1. نظرا لقدرتها على الخضوع لالإنقسامية كفاءة إعادة التركيب مثلي ، فقد برزت Physcomitrella patens كنظام نموذجا هاما في السنوات الأخيرة 2. هذه القدرة تسمح للترددات عالية من استهداف الجينات 3-9 ، الذي لا ينظر في محطات أخرى مثل نموذج Arabidopsis. للاستفادة الكاملة من هذا النظام ، ونحن في حاجة الى طريقة فعالة وسهلة لإيصال الحمض النووي في خلايا الطحلب. الطرق الأكثر شيوعا لتحويل هذا الطحلب والقصف الجسيمات (10) والربط بوساطة الحمض النووي امتصاص 11. على الرغم من القصف الجسيمات يمكن أن يؤدي إلى كفاءة عالية التحول 12 ومدافع الجينات ليست متاحة بسهولة إلى العديد من المختبرات والبروتوكول من الصعب توحيد. من ناحية أخرى ، PEG التحول توسط لا يتطلب معدات متخصصة ، ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع غطاء العقيمة. هنا ، وتبين لنا طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحويل protoplasts الطحلب. هذا الأسلوب يمكن أن تولد أكثر من 120 ميكروغرام لكل عابر transformants من الحمض النووي ، وهو ما يشكل تحسنا من البروتوكول الأكثر كفاءة ذكرت سابقا 13. بسبب كفاءته ، والبساطة ، واستنساخ ، يمكن تطبيق هذه الطريقة للمشاريع التي تتطلب عددا كبيرا من transformants فضلا عن التحول الروتينية.

Protocol

1. جعل Protoplasts

  1. إضافة 9 مل من 8 ٪ مانيتول إلى طبق بتري.
  2. باستخدام ملعقة ، وطرح الطحلب العمر 7 أيام 2-3 PPNH4 لوحات من 5 -- في طبق بتري تحتوي مانيتول.
  3. أضف 3 مل من Driselase 2 ٪ (سيغما D9515 - 25G) إلى طبق بتري.
  4. احتضان طبق بيتري في درجة حرارة الغرفة لطيف مع الهز لمدة 1 ساعة.
  5. تصفية تعليق الجبلة المجردة من خلال شبكة ميكرومتر 100 دينار بحريني (352350 فالكون).
  6. تدور تعليق تصفيتها في 250 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
  7. إعادة تعليق protoplasts بلطف شديد مع 500 ميكرولتر من مانيتول 8 ٪.
  8. إضافة 9.5 مل مانيتول 8 ٪ في أنبوب الثقافة. تأكد من أن يتم تعليق protoplasts تماما.
  9. تكرار الترشيح وإعادة تعليق الخطوات (1.6 ، 1.7 و 1.8) مرتين أخريين.
  10. يستغرق 10 ميكرولتر من الحل الجبلة المجردة وحساب protoplasts في عدادة الكريات.
  11. ضرب عدد من الجبلة المجردة في منطقة مربع بحلول 16 10000 للحصول على عدد من protoplasts لكل مليلتر (أنظر الشكل 1).

2. تحول

  1. تدور تعليق الجبلة المجردة في 250 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
  2. اعادة تعليق protoplasts في حل مجموعة محمد المعجل في تركيز قدرها 1.6 مليون protoplasts / مليلتر.
  3. احتضان تعليق الجبلة المجردة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  4. إضافة 600 ميكرولتر من تعليق الجبلة المجردة في أنبوب ثقافة تحتوي على 60 ميكروغرام الحمض النووي. دوامة أنبوب بلطف.
  5. إضافة 700 ميكرولتر من PEG / كا حل في خليط الجبلة المجردة / الحمض النووي. دوامة أنبوب الخليط برفق حتى كلها متجانسة.
  6. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  7. خلال فترة الانتظار هذه ، وتغطية PRM - B مع لوحات السيلوفان (80 دوائر قطرها ملم ، AA التغليف المحدودة ، المملكة المتحدة) ؛ السيلوفان تسمح لهيدرات على سطح لوحة لا يقل عن 5 دقائق.
  8. مع ملعقة ، وإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس بين السيلوفان وبليت.
  9. تمييع الخليط مع 3 مل من W5 الحل.
  10. تدور الخليط في 250 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
  11. اعادة تعليق protoplasts في 2 مل من ذاب PRM - T (قبل إضافته إلى protoplasts يمكن الاحتفاظ بهذا المحلول السائل عند درجة 42). لوحة 1 مل من اعادة تعليق protoplasts PRM - B في لوحة تغطيها السيلوفان. التفاف على لوحات مع Micropore (3M ، والرعاية الصحية). الحفاظ على لوحات في 25 درجة مئوية في غرفة النمو.
  12. بدلا من ذلك ، يمكن إعادة protoplasts مع وقف التنفيذ في 1 مل من السائل والمتوسطة الطلاء مطلي 0.5 مل على طبق PRM - B مغطاة السيلوفان. هذا يسمح أسرع التجدد ، ولكن عدد من محطات تجديد أقل.
  13. يتم تعيين الغرفة النمو عن 16 ساعة. ضوء وساعة 8. دورة الظلام.
  14. نقل السيلوفان على طبق من ذهب لاختيار الطازجة 4 أيام بعد التحول.

3. ممثل النتائج :

ويرد مثال على التحول في الشكل 2. كان الحمض النووي المستخدمة في هذا المثال على supercoiled 7.8 كيلوبايت بلازميد يحمل الكاسيت هيغروميسين مقاومة. تم تخفيض مبلغ protoplasts مطلي إلى 50 ٪ للتصوير الفوتوغرافي. تم التقاط الصور بعد أسبوعين تم نقل النباتات لاختيار لوحات. لا تتأثر كفاءة التحول من تركيز الحمض النووي يصل إلى 60 ميكروغرام. تركيزات أعلى من الحمض النووي تضر كفاءة التحول. وأظهرت البيانات أن هذه الطريقة توفر نتيجة متسقة عبر طائفة واسعة من كميات الحمض النووي. هذا الأسلوب يمكن أن تولد أيضا transformants مستقرة على نحو فعال كما هو مبين في الجدول رقم 1 ، ويمكننا الحصول على حوالي 4 transformants مستقرة في خطي ميكروغرام من الحمض النووي ، وهو أعلى بكثير من ما كان ذكر سابقا 14.

اختبرنا أيضا تأثير الصدمة الحرارية على كفاءة التحول من خلال تحويل البلازميد supercoiled يحمل الجين لبروتين فلوري كعلامة. تم تنفيذ الصدمة الحرارية من 10 دقائق بعد حضانة درجة حرارة الغرفة (ضمن الخطوة 2.6) التي يحتضنها الخليط في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. وقد حضنت الخليط في درجة حرارة الغرفة حمام الماء مباشرة بعد الصدمة الحرارية لمدة 17 دقيقة. وسجلت النتائج بعد 22 ساعة التحول. وكانت نسب transformants حصل مع وبدون حرارة صدمة مشابهة جدا (~ 25 ٪) ، ولكن لاحظنا تأثير ضار من الصدمة الحرارية على صلاحية protoplasts (لا تظهر البيانات).

figure-protocol-5252
الشكل 1. في ضوء protoplasts عدادة الكريات يشار إلى المقطع اللازمة لفرز الجبلة المجردة من قبل مربع أحمر. لاحظ المربعات اللازمة لفرز 16 protoplasts (انظر 1.11) ، والصورة تظهر على عدد من 24 protoplasts (240000 خلية / مل).

figure-protocol-5626
الشكل 2. وكانت صور 18 transformants يوم عابر القديمة. Protoplasts العابرةشكلت مع المبلغ المشار إليه من البلازميد supercoiled. ج : 15μg ؛ B : 30μg ؛ C : 60μg ؛ D : 120μg.

كمية من الحمض النووي (ميكروغرام) الكفاءة (tranformants / ميكروغرام DNA)
15 ، supercoiled البلازميد 120 ± 24
30 ، supercoiled البلازميد 145 ± 54
60 ، supercoiled البلازميد 121 ± 60
120 ، supercoiled البلازميد 71 ± 38
60 ، خطي البلازميد 4 ± 1

كفاءة تحويل الجدول 1. الحمض النووي في كميات مختلفة.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا يمكن تحويل الحمض النووي واضحة ومتسقة في protoplasts patens Physcomitrella. وضعت أصلا لهذا الأسلوب Arabidopsis 1 ، ولكن نحن هنا أثبت أنه يؤدي بشكل جيد مع protoplasts من patens Physcomitrella ، وهو نبات أبسط ومختلفة. ولذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنواع النباتية الأخرى مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة. التعديلات الممكنة لتحسين وتشمل تركيز الجبلة المجردة في مجموعة محمد المعجل ، فترة حضانة في الحل والربط MMG / كا. اخترنا لاستخدام الحمض النووي 60 ميكروغرام في تجاربنا الروتينية لأن عدد transformants الزيادات خطيا مع تركيز الحمض النووي حتى هذه النقطة (الجدول 1). يمكن أن نحصل على ما يقرب من 7000 transformants عابرة أو 200 transformants مستقرة على 60 ميكروغرام واحد تحول الحمض النووي ، التي تسمح لمزيد من الفحص والتحليل لعدد كبير من النباتات.

يمكن أن تكون إما تحولت protoplasts مع انتشار المتوسطة الطلاء السائل أو PRM تي. على الرغم من أن كفاءة التجدد هو أقل عندما يتم استخدام الطلاء السائل المتوسطة ، ونحن اخترت هذا الأسلوب عندما تحولت protoplasts مع البلازميدات supercoiled. وأظهرت كما في الجدول رقم 1 ، التحولات فعلت مع DNA البلازميد supercoiled توليد المزيد من transformants وبالتالي ، يمكننا الحصول على ما زالت أعداد كبيرة من النباتات المتوسطة مع الطلاء السائل. وعلاوة على ذلك ، ونشر protoplasts المتوسطة مع الطلاء السائل يسمح أسرع التجدد ، وهو أمر مهم للتجارب التي تنطوي على الظواهر العابرة ، مثل [رني نهدم التجارب 9،15. بالإضافة لعدم وجود أجار أعلى يسمح لعزل محطة سهلة للimmunostaining وRT - PCR 9،15.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

معتمد من قبل جبهة الخلاص الوطني LV (IOS 1002837)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف عنصر
PPNH 4 1.84 ملي KH 2 PO 4
3.4 ملي كا (NO 3) 2
1 ملم MgSO 4
2.72 ملي طرطرات ثنائي الأمونيوم
54 ميكرومتر FeSO 4 0.7 H 2 O
9.93 ميكرومتر H 3 BO 3
1.97 ميكرومتر MnCl 0.4 2 H 2 O
0.23 ميكرومتر كوكلي 2 0.6 H 2 O
0.19 ميكرومتر ZnSO 4. 7H 2 O
0.22 ميكرومتر كبريتات النحاس 4. 5H 2 O
0.10 ميكرومتر نا 2 مو 4 0.2 H 2 O
0،168 ميكرومتر KI
إضافة آغار 0.7 ٪ لمتوسطة الصلبة.
PRM - B 4 PPNH مانيتول مع 6 ٪ و 0.8 ٪ أجار. إضافة 10 مل 1M CaCl 2-1 لام قبل صب لوحات.
PRM - T 4 PPNH مانيتول مع 6 ٪ و 0.6 ٪ أجار. إضافة 0.5 مل 1M CaCl 2-50 مل قبل الاستخدام.
السائل التصفيحات متوسطة 4 PPNH مانيتول مع 8.5 ٪ دون آغار. إضافة 0.5 مل 1M CaCl 2-50 مل قبل الاستخدام.
2 ٪ Driselase إضافة 4 غرام من Driselase (سيغما D9515 - 25G) إلى 200 مل من مانيتول 8 ٪. يحرك برفق لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، واحتضان 30 دقيقة. عند 4 درجات مئوية ، ويحرك برفق لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة. تدور ز 2500 لمدة 10 دقيقة ، وتجاهل بيليه. فلتر مع 0.22 ميكرون ، وتخزينها مجمدة في 10 مل aliquots. ذوبان الجليد في ماء الاستحمام درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
MMG 0.4 M مانيتول
15 ملم MgCl 2
4 ملم زارة التربية والعلم (الرقم الهيدروجيني 5.7)
PEG / CA 4 ز PEG4000
3 مل من H 2 O
2.5 مل مانيتول 0.8 M
1 مل 1M CaCl 2
W5 154 ملي كلوريد الصوديوم
125 ملم CaCl 2
5 ملم بوكل
2 مم زارة التربية والعلم (الرقم الهيدروجيني 5.7)

References

  1. Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
  2. Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -. P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
  4. Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
  6. Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
  7. Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
  8. Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
  9. Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
  10. Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
  11. Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
  12. Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
  13. Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
  14. Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

50 Physcomitrella patens protoplasts

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved