Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene

Un metodo semplice ed efficace per trasformare Physcomitrella pantens Protoplasti è descritto. Questo metodo è adattato da protocolli per Physocmitrella Protonemal protoplasti e Arabidopsis Mesofillo trasformazione di protoplasti ¹.

1. Rendere il protoplasti

1. Aggiungere 9 ml di mannitolo 8% a una piastra di Petri.
2. Con una spatola, mettere 7 giorni muschio vecchio 2-3 PPNH4 lastre di 5 - nella capsula di Petri contenente mannitolo.
3. Aggiungere 3 ml del 2% Driselase (Sigma D9515-25G) per la piastra di Petri.
4. Incubare la piastra Petri a temperatura ambiente agitando delicatamente per 1 ora.
5. Filtrare la sospensione di protoplasti attraverso una maglia di 100 micron (BD Falcon 352350).
6. Spin la sospensione filtrata a 250 g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
7. Risospendere il protoplasti molto delicatamente con 500 ml di mannitolo 8%.
8. Aggiungere 9,5 ml di mannitolo 8% nel tubo di cultura. Assicurarsi protoplasti sono completamente sospesi.
9. Ripetere la filtrazione e la risospensione passi (1,6, 1,7 e 1,8) altre due volte.
10. Prendere 10 microlitri della soluzione del protoplasti e contare i protoplasti in un emocitometro.
11. Moltiplicare il numero di protoplasti in una zona con 16 quadrati da 10.000 a ottenere il numero di protoplasti per ml (vedi figura 1).

2. Trasformazione

1. Spin la sospensione di protoplasti a 250 g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
2. Risospendere protoplasti MMG in soluzione alla concentrazione di 1,6 milioni di protoplasti / mL.
3. Incubare la sospensione di protoplasti a temperatura ambiente per 20 minuti.
4. Aggiungere 600 ml di sospensione di protoplasti in un tubo cultura del DNA contenente 60 mcg. Agitare delicatamente il tubo.
5. Aggiungere 700 ml di PEG / Ca soluzione nel protoplasti / DNA miscela. Agitare delicatamente fino a quando il tubo miscela è omogenea.
6. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.
7. Durante questo periodo di attesa, copertura PRM-B piatti con cellophane (80 mm di diametro cerchi, AA Packaging Limited, UK); permettono cellophane per idratare sulla superficie della piastra per almeno 5 minuti.
8. Con una spatola, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra il cellophane e la piastra.
9. Diluire il composto con 3 ml di soluzione W5.
10. Spin la miscela a 250 g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
11. Risospendere protoplasti nel fuso 2 ml di PRM-T (prima di aggiungerlo al protoplasti questa soluzione può essere mantenuta liquida a 42 ° C). Tavola 1 ml di risospendere protoplasti per PRM-B piatto coperto da cellophane. Avvolgere le piastre con Micropore (3M, Health Care). Tenere le piastre a 25 ° C in una camera di crescita.
12. In alternativa, protoplasti può essere risospeso in 1 ml di terreno liquido e placcato placcatura 0,5 ml su un PRM-B piatto coperto da cellophane. Questo permette una più veloce rigenerazione, ma il numero di impianti di rigenerazione è più basso.
13. Camera di crescita è impostato per un ore 16. luce e 8 ore. ciclo scuro.
14. Spostare il cellophane su di una piastra nuova selezione 4 giorni dopo la trasformazione.

3. Rappresentante dei risultati:

Un esempio di trasformazione è mostrato nella Figura 2. Il DNA utilizzato in questo esempio è stato un superavvolto 7,8 kb plasmide porta una cassetta resistente Hygromycin. La quantità di protoplasti placcato è stata ridotta al 50% per la fotografia. Le foto sono state scattate due settimane dopo che le piante sono state spostate le piastre di selezione. L'efficienza di trasformazione non è influenzata dalla concentrazione di DNA fino a 60 mcg. Concentrazioni più elevate di DNA sono dannose per l'efficienza della trasformazione. I dati hanno mostrato che questo metodo fornisce risultati coerenti in un ampio intervallo di quantità di DNA. Questo metodo può anche generare trasformanti stabili in modo efficace, come illustrato nella tabella 1, possiamo ottenere circa 4 trasformanti stabili per microgrammo di DNA linearizzato, che è molto più alta di quanto è stato riportato in precedenza ^14.

Abbiamo anche testato l'effetto dello shock termico sulla efficienza della trasformazione, trasformando un plasmide superavvolto portatrice di un gene per una proteina fluorescente come marcatore. Lo shock termico è stata effettuata 10 minuti dopo l'incubazione a temperatura ambiente (entro Passo 2.6) incubando la miscela in un bagno d'acqua a 45 ° C per 3 minuti. La miscela è stata incubata in un bagno di acqua a temperatura ambiente subito dopo la scossa di calore per 17 min. I risultati sono stati registrati 22 ore dopo la trasformazione. I rapporti di trasformanti ottenuti con e senza shock termico erano molto simili (~ 25%), ma abbiamo osservato un effetto negativo di shock termico sulla redditività dei protoplasti (dati non riportati).

Figura 1. Vista di protoplasti in emocitometro. La sezione necessaria per il conteggio di protoplasti è indicata da un quadrato rosso. Si noti il ​​16 quadrati necessari per il conteggio protoplasti (vedi 1.11), l'immagine mostra un conteggio di 24 protoplasti (240.000 cellule / ml).

Figura 2. Foto di 18 giorni trasformanti vecchio transitori. Protoplasti sono stati transformato con la quantità indicata di plasmide superavvolto. A: 15μg; B: 30 mcg; C: 60μg; D: 120μg.

Tabella 1. Efficienza di trasformazione del DNA in quantità diverse.

Il metodo presentato qui permette una trasformazione del DNA lineare e coerente in Physcomitrella protoplasti patene. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per Arabidopsis ^1, ma qui abbiamo dimostrato che si comporta bene con protoplasti di Physcomitrella patene, un impianto più semplice e diverso. Pertanto, questo metodo può essere applicato ad altre specie di piante, con piccole modifiche. Possibili modifiche per l'ottimizzazione comprendono concentrazione di protoplasti in MMG, tempo di incubazione in soluzione MMG e PEG / Ca. Abbiamo scelto di utilizzare il DNA 60 mg nei nostri esperimenti di routine perché il numero di trasformanti cresce linearmente con la concentrazione di DNA fino a questo punto (Tabella 1). Potremmo avere circa 7000 trasformanti transitori o 200 trasformanti stabili su un singolo 60 mcg trasformazione del DNA, che permette per lo screening e analisi di una vasta popolazione di piante.

Il protoplasti trasformato può essere diffuso con il mezzo liquido o placcatura PRM-T. Sebbene l'efficienza di rigenerazione è più bassa quando medie placcatura liquida è utilizzato, abbiamo scelto questo metodo quando il protoplasti sono stati trasformati con plasmidi superavvolto. Come mostrato nella tabella 1, le trasformazioni fatto con superavvolto DNA plasmidico generare trasformanti molti altri e, quindi, possiamo ancora ottenere un gran numero di impianti di media placcatura liquido. Inoltre, la diffusione protoplasti con placcatura medio liquido permette una più veloce rigenerazione, che è importante per gli esperimenti che coinvolgono fenotipi transitoria, come RNAi abbattere esperimenti ^9,15. Inoltre l'assenza di agar in alto permette di isolamento pianta facile per immunoistochimica e RT-PCR ^9,15.

LV è supportato dalla NSF (IOS 1002837)