Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

Este protocolo descreve um procedimento geral para o estudo de ligação aos receptores recombinantes de domínio (RBD) com base em vacinas de subunidade contra a SARS. Ele inclui métodos para transfecção e expressão da proteína em células RBD 293T, a imunização de camundongos com RBD e detecção de atividade de neutralização dos soros do mouse usando um ensaio de neutralização estabelecida SARS pseudovirus.

Com base em seu perfil de segurança e capacidade de induzir potentes respostas imunes contra as infecções, as vacinas de subunidades têm sido usados ​​como candidatos para uma ampla variedade de patógenos ^1-3. Desde que o sistema de células de mamíferos é capaz de modificação pós-traducional, formando proteínas adequadamente dobradas e glicosilada, proteínas recombinantes expressas em células de mamíferos têm demonstrado o maior potencial para manter elevada antigenicidade e imunogenicidade ^4-6.

Embora nenhum novo caso de SARS têm sido relatados desde 2004, futuros surtos são uma ameaça constante e, portanto, o desenvolvimento de vacinas contra a SARS-CoV é um passo prudente preventiva e deve ser realizada. O RBD de proteína SARS-CoV S desempenha um papel importante na ligação do receptor e indução de anticorpos neutralizantes específicos contra a infecção pelo vírus ^7-9. Portanto, neste protocolo, descrevemos novos métodos para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade RBD baseada contra SARS. Resumidamente, a proteína recombinante RBD (rRBD) foi expressa em sobrenadante de cultura de células de mamíferos 293T para obter uma proteína dobrado corretamente com conformação adequada e elevada imunogenicidade ^6. A transfecção do plasmídeo recombinante codificação RBD às células foi então realizada usando um método de transfecção de fosfato de cálcio ^6,10 com algumas modificações. Comparado com o método de transfecção lipídica ^11,12, este método modificado de cálcio fosfato de transfecção é mais barato, mais fácil de manusear, e tem o potencial para alcançar alta eficácia, uma vez um complexo de transfecção com o tamanho e forma adequadas é formado ^13,14. Finalmente, um ensaio de neutralização pseudovirus SARS foi introduzida no protocolo e usado para detectar a atividade neutralizante de soros de camundongos vacinados com a proteína rRBD. Este ensaio é relativamente seguro, não envolve um infecciosas SARS-CoV, e pode ser realizada sem a exigência de um laboratório de biossegurança-3 ^15.

O protocolo aqui descrito também pode ser usado para desenhar e estudar vacinas subunidade recombinante contra outros vírus com proteínas de classe I de fusão, por exemplo, HIV, vírus sincicial respiratório (VSR), o vírus Ebola, o vírus influenza, bem como Nipah e Handra. Além disso, os métodos para gerar um pseudovirus e, posteriormente, estabelecer um ensaio de neutralização pseudovirus pode ser aplicada a todos estes vírus.

1. Recombinante SARS-CoV Preparação Protein RBD

1. Prepare cálcio reagentes de transfecção de fosfato
   1. 2X tampão HBS preparação: Misture 16 g de NaCl, 0,4 g de Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, e 13,0 g de HEPES. Ajustar o pH a 7,00 e educação de volume total para 1000 mL em água destilada. Depois de filtrar a solução para alíquota de esterilização, e armazená-lo a -20 ° C.
      Dica: Qualquer variação do valor de pH afetaria os resultados transfecção. Assim, é aconselhável testar vários valores de pH em torno de 7,00 (por exemplo, 6,99, 7,00, ou 7,01) e encontrar o melhor para a transfecção usando o método introduzido abaixo.
   2. 2,5 M CaCl ₂ preparação: Adicionar 73,5 g de CaCl ₂ * 2H ₂ O em água destilada em um volume final de 200 mL. Filtrar a solução e armazenar a -20 ° C.
2. Transfecção do plasmídeo recombinante e proteína de purificação
   1. Dividir células 293T em 50-70% 24 h antes de confluência de transfecção. Cultivar células em T-175 cm ² frascos de cultura de tecidos em 40 mL DMEM contendo 10% inativado pelo calor (HI) FBS e 1% Penicilina / Estreptomicina (P / S) a 37 ° C em 5% CO _2.
   2. Todos os reagentes de transfecção deve ser trazido à temperatura ambiente antes de transfecção. Estes reagentes incluem 2X HBS, 2.5M CaCl _2, Dih ₂ O, e rRBD ⁶ plasmídeo.
      Dica: O plasmídeo recombinante final de construção usado para a expressão da proteína deve conter um peptídeo sinal para garantir a secreção de proteínas recombinantes expressas para o sobrenadante da cultura. A tag Sua 6x pode ser adicionado ao C-terminal da proteína expressa para a purificação fácil.
   3. Prepare uma mL 50 (A) e um 15 mL (B) BD tubo Falcon, e adicionar os reagentes aos tubos, como indicado na Tabela 1. Adicionar 2X tampão HBS para A. tubo no tubo B, adicionar 2,5 milhões de CaCl ₂ e rRBD plasmídeo, e levar o volume para a exigência da Dih ₂ O.
      

      A. Um T-175 cm 2 frasco de cultura de tecidos (4000 mL / frasco): preparar para a expressão rRBD
      Um tubo		Tubo B
      2X HBS	2000 mL	2.5M CaCl 2	200 mL
      		DNA plasmídeo rRBD	40 mcg
      		Dih 2 O para	2000 mL
      B. Um de 100 mm placa de Petri (1000 mL / prato): preparar-se para SARS produção pseudovirus
      Um tubo		Tubo B
      2X HBS	500 mL	2.5M CaCl 2	50 mL
      		DNA plasmídeo SARS-CoV S	5 mg
      		HIV-1 plasmídeo (pNL4-3.luc.RE)	5 mg
      		Dih 2 O para	500 mL

      Tabela 1. Preparação da mistura Transfection e volumes
      Os volumes listados na Tabela 1 são para uma unidade de transfecção. Se frascos mais ou pratos são utilizados para a transfecção, ajustar volumes em conformidade.
   4. Adicionar a solução de DNA de cálcio no tubo B no tubo A de uma forma gota a gota, mantendo constante e suave a mistura em um vórtice. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20-30 min. A chave para o sucesso de transfecção de fosfato de cálcio depende do tamanho e forma do precipitado formado. Assim, a mistura deve ser constantemente agitadas e, lentamente, para cumprir este requisito e, como conseqüência, melhorar a eficácia de transfecção.
   5. Adicione a mistura de uma forma gotas e até mesmo em células 293T (4000 mL / frasco). Células de cultura em estufa a 37 ° C em 5% CO _2.
   6. Substituir o meio de cultura com novas OPTI-MEM eu sem soro Médio Reduzido-Serum (50 mL / frasco) 8-10 h pós-transfecção. Continuar a células de cultura por mais dois dias na mesma condição.
   7. Recolher o sobrenadante contendo proteínas expressas rRBD 72 h pós-transfecção. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Adicionar coquetel inibidor de protease para o sobrenadante coletado e armazenar a 4 ° C durante a noite.
   8. No dia seguinte, purificar proteínas recombinantes rRBD do sobrenadante da cultura através de instruções de Ni-NTA fabricante Superflow seguinte.
   9. Concentre-se proteína purificada usando Amicon Ultra tubos concentração -15. Após a concentração de proteína,PBS adicionar aos tubos de concentração e centrifugar novamente para remover imidazol em tampão de eluição. Calcular a concentração de proteína e armazenar proteína purificada a -80 ° C até o uso.

2. Imunização mouse e Coleta de Amostra

1. Pré-aquecer Sigma sistema adjuvante (SAS) para 40-45 ° C de acordo com instruções do fabricante. Adicionar 1 mL de PBS por frasco e misturar bem.
2. Prepare a proteína adjuvante emulsão de acordo com o protocolo na Tabela 2. Pipeta calculada proteína rRBD em um tubo de 1,5 mL. Adicionar igual volume de adjuvante SAS para o tubo e vortex vigorosamente por 2-3 min para formar emulsão.
   Dica: Os volumes listados na Tabela 2 são para um mouse. Ajustar volumes de acordo com os números do mouse real usado. Para cada grupo, misture as proteínas e adjuvante necessários para cada vacina. Sempre preparar uma amostra suplementar para a vacinação para garantir a precisão.
   

   Grupo	1 ª vacina (200 mL / rato)	2 ª vacina (200 mL / rato)	3 ª vacina (200 mL / rato)
   proteína rRBD	20 g de proteína em PBS (100 mL) + 100 mL SAS	10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS	10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS
   PBS controle	100 mL PBS + 100 mL SAS	100 mL PBS + 100 mL SAS	100 mL PBS + 100 mL SAS

   Tabela 2. Protocolo de imunização do rato
3. Por via subcutânea prime-imunizar fêmeas BALB / c (4-6 semanas de idade, cinco ratos / grupo), e aumentar duas vezes com rRBD e SAS, conforme indicado na Tabela 2. Use PBS grupo como o controle. O site para injeções subcutâneas geralmente escolhido é a pele solta entre as omoplatas. Alternativamente, o abdômen ventral é comumente usado, porque é mais fácil para injetar, e pode observar qualquer vazamento dos locais de injeção. Quando repetidas doses de vacinas são usadas, é fácil selecionar os locais de injeção diferentes, prevenindo potenciais reacções cutâneas locais.
4. Sangrar camundongos via retro-orbital com anestésico antes da imunização e 10 dias após cada vacinação, soros e calor a 56 ° C por 30 min para a inativação do complemento. Loja do mouse soros a -20 ° C até o uso.

3. Detecção de neutralização usando ensaio de neutralização Pseudovirus

1. Prepare pseudovirus SARS
   1. Dividir células 293T em 100 milímetros de tecido placas de cultura de petri (2x10 ⁶ células / prato) 16 h antes da transfecção, as células crescem e como acima.
   2. Preparar reagentes de transfecção, conforme indicado na Tabela 1. Proteína co-transfecção um plasmídeo SARS-CoV S e um plasmídeo Env-defeituoso, luciferase expressando o genoma do HIV-1 (pNL4-3.luc.RE), utilizando reagentes de transfecção de cálcio fosfato.
   3. Substituir médio com 10 mL fresco DMEM contendo 10% FBS e 1% P / S 10/08 h pós-transfecção. Recolher o sobrenadante contendo SARS pseudovirus 72 h pós-transfecção.
   4. Pseudovirus filtro através de um filtro mM 0,45. Alíquotas e armazenar a -80 ° C até o uso.
2. SARS ensaio de neutralização pseudovirus
   1. Dividir células 293T expressar SARS-CoV receptor ECA2 (ACE2/293T) a 10 ⁴ cells/100 mL / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido 16 h antes da infecção.
   2. Diluir pseudovirus SARS por 2 vezes para detectar o título do vírus nas células ACE2/293T.
   3. Serialmente diluída em soro de rato placas de 96 poços de cultura de tecidos, e adicionar igual volume de titulado pseudovirus SARS. Pré-incubação das placas a 37 ° C por 1 h.
   4. Após a incubação, adicionar 100 mL da mistura de soros para as células-pseudovirus ACE2/293T, e continuam a crescer as células a 37 ° C em 5% CO _2. Adicionar nova DMEM 24 h mais tarde.
   5. Remover completamente o sobrenadante da cultura de placas de 72 h pós-infecção. Adicionar 1X luciferase reagente de lise celular cultura (60 mL / poço), e promover a lise celular com constante agitação de placas por 1-2 h à temperatura ambiente.
   6. Transferência de lisados ​​celulares (50 mL / poço) em placas luminômetro (Microfluor placas de 96 poços). Adicionar substrato luciferase (50 mL / poço), incluído no sistema de análise luciferase, e detectar a atividade luciferase relativa no luminômetro 384 Ultra.
   7. Calcule SARS título de neutralização pseudovirus e presente como título de anticorpos neutralizantes 50% (NT ₅₀₎ ^6.

Densidade celular é um fator importante que afeta a eficácia de transfecção de cálcio à base de fosfato. Em nossa experiência, menos de 70% confluência das células traz os melhores resultados. Assim, a fim de melhorar a eficiência de transfecção, recomenda-se que a densidade de células ser mantidos a cerca de 50-70% de confluência. O cálcio método de transfecção de fosfato é geralmente pensado para ser menos eficiente em comparação com os métodos de transfecção outras, tais como a transfecção lipídica ^16. No entanto, neste protocolo, foi utilizado um método modificado de cálcio fosfato de transfecção em que constante e lenta mistura da solução de transfecção em um vórtice garante a formação de um precipitado com o tamanho apropriado ea forma, melhorando assim a eficiência de transfecção.

Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) dos Estados Unidos (RO1 AI68002).