JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء دراسة عامة لمستقبلات ملزمة المؤتلف المجال (RBD) القائم على إنتاج لقاحات الوحيدات ضد السارس. وهي تشمل أساليب ترنسفكأيشن والتعبير عن بروتين في الخلايا RBD 293T ، وتحصين الفئران مع RBD وكشف النشاط تحييد الأمصال باستخدام الماوس pseudovirus السارس أنشئت مقايسة التعادل.

Abstract

استنادا الى البيانات الشخصية للسلامتهم وقدرتهم على إحداث استجابة مناعية قوية ضد الالتهابات ، وقد استخدمت لقاحات الوحيدات كمرشحين لطائفة واسعة من مسببات الأمراض 1-3. لأن النظام خلايا الثدييات غير قادرة على مرحلة ما بعد متعدية التعديل ، وبالتالي تشكيل البروتينات مطوية بشكل صحيح والغليكوزيلاتي ، وقد أظهرت البروتينات المؤتلف وأعرب في الخلايا الثديية أكبر إمكانية للحفاظ على استضداد عالية واستمناع 4-6.

على الرغم من أنه لم تسجل أي حالات جديدة من مرض السارس منذ عام 2004 ، تفشي المرض في المستقبل تشكل تهديدا مستمرا ، وبالتالي ، فإن تطوير لقاحات ضد السارس COV خطوة حكيمة وقائية وينبغي الاضطلاع بها. وRBD من البروتين بالسارس COV S يلعب أدوارا مهمة في ربط مستقبل وتحريض الأضداد تحييد محددة ضد عدوى فيروس 7-9. لذا ، في هذا البروتوكول ، ونحن تصف أساليب جديدة لتطوير لقاح الوحيدات RBD المستندة ضد السارس. لفترة وجيزة ، أعرب عن البروتين RBD المؤتلف (rRBD) طاف في ثقافة خلايا الثدييات 293T للحصول على البروتين مطوية بشكل صحيح مع التشكل الصحيح واستمناع عالية 6. ثم أجري ترنسفكأيشن من RBD ترميز البلازميد المؤتلف إلى الخلايا باستخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن 6،10 مع بعض التعديلات. بالمقارنة مع الدهن ترنسفكأيشن 11،12 الأسلوب ، وهذا الأسلوب فوسفات الكالسيوم تعديل ترنسفكأيشن هو أرخص وأسهل من التعامل معها ، ولديه القدرة للوصول إلى كفاءة عالية حالما يتم تشكيل مجمع ترنسفكأيشن مع حجم المناسبة والشكل 13،14. أخيرا ، فرضت التعادل pseudovirus السارس مقايسة في البروتوكول واستخدامها للكشف عن النشاط تحييد الأمصال لتطعيم الفئران مع بروتين rRBD. هذا الاختبار هو آمن نسبيا ، لا ينطوي على السارس COV المعدية ، ويمكن القيام بها دون اشتراط وجود مختبر بالسلامة الأحيائية 3 15.

وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة تصميم وإنتاج لقاحات الوحيدات المؤتلف ضد الفيروسات الأخرى مع بروتينات الدرجة الانصهار الأول ، على سبيل المثال ، فيروس نقص المناعة البشرية ، وفيروس المخلوي التنفسي (RSV) ، فيروس إيبولا ، فيروس الأنفلونزا ، وكذلك نيباه Handra والفيروسات. بالإضافة ، يمكن تطبيق أساليب لتوليد pseudovirus ووضع في وقت لاحق مقايسة تحييد pseudovirus لجميع هذه الفيروسات.

Protocol

1. بروتين المؤتلف RBD بالسارس COV التحضير

  1. تحضير كاشف الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن
    1. 2X إعداد العازلة HBS : مزيج معا 16 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.4 غرام من الصوديوم 2 هبو 4 * 7H 2 O ، و 13.0 غرام من HEPES. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.00 وإحضار الحجم الكلي الى 1000 مل في الماء المقطر. بعد تصفية حل للقسامة ، والتعقيم وتخزينه في -20 درجة مئوية.
      تلميح : أي اختلاف من قيمة الرقم الهيدروجيني شأنه أن يؤثر على نتائج ترنسفكأيشن. وبالتالي ، فإنه من المستحسن لاختبار قيم درجة الحموضة عدة حول 7.00 (على سبيل المثال ، 6.99 ، 7.00 ، 7.01 أو) للعثور على أفضل واحد لترنسفكأيشن باستخدام طريقة عرض أدناه.
    2. 2.5 م 2 CaCl إعداد : إضافة 73.5 غرام من CaCl 2 * 2H 2 O في الماء المقطر في الحجم النهائي 200 مل. تصفية المحل في الحل و-20 درجة مئوية.
  2. المؤتلف ترنسفكأيشن البلازميد وتنقية البروتين
    1. انقسام الخلايا 293T على 50-70 ٪ confluency 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن. تنمو الخلايا الموجودة في T - 175 2 القوارير زراعة الأنسجة في 40 مل تحتوي على 10 ٪ DMEM الحرارة المعطل (مرحبا) ، و 1 ٪ FBS البنسلين / الستبرتوميسين (P / S) عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2.
    2. وينبغي تقديم جميع الكواشف ترنسفكأيشن يصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل ترنسفكأيشن. وتشمل هذه الكواشف 2X HBS ، 2.5M CaCl 2 ، DIH O 2 ، و 6 البلازميد rRBD.
      تلميح : استخدام البلازميد بناء النهائي المؤتلف للتعبير البروتين ينبغي أن يحتوي على إشارة الببتيد لضمان إفراز البروتينات المؤتلف وأعرب لطاف الثقافة. ويمكن إضافة 6X صاحب العلامة لمحطة سي من البروتين وأعربت لتنقية سهلة.
    3. تعد واحدة 50 مل (A) وواحدة 15 مل (B) أنبوب فالكون دينار بحريني ، وإضافة الكواشف للأنابيب كما هو مبين في الجدول رقم 1. إضافة 2X HBS عازلة لألف باء في أنبوب أنبوب ، إضافة 2.5M CaCl 2 و rRBD البلازميد ، وجعل وحدة التخزين إلى الشرط الوارد في DIH 2 O.
      ألف واحد T - 175 قارورة زراعة الأنسجة 2 (4000 ميكرولتر / القارورة) : الاستعداد للتعبير rRBD
      أنبوب أنبوب B
      2X HBS 2000 ميكرولتر 2.5M CaCl 2 200 ميكرولتر
      DNA البلازميد rRBD 40 ميكروغرام
      DIH 2 O ل 2000 ميكرولتر
      باء واحد 100 ملم طبق بتري (1000 ميكرولتر / طبق) : التحضير لإنتاج pseudovirus السارس
      أنبوب أنبوب B
      2X HBS 500 ميكرولتر 2.5M CaCl 2 50 ميكرولتر
      بالسارس COV S DNA البلازميد 5 ميكروغرام
      HIV - 1 البلازميد (pNL4 - 3.luc.RE) 5 ميكروغرام
      DIH 2 O ل 500 ميكرولتر
      الجدول خليط ترنسفكأيشن 1. إعداد وحدات التخزين
      وحدات التخزين المدرجة في الجدول 1 تخص ترنسفكأيشن حدة واحدة. إذا تم استخدام أكثر من قوارير أو أطباق لترنسفكأيشن ، وضبط حجم وفقا لذلك.
    4. إضافة محلول الحمض النووي الكالسيوم في B أنبوب إلى أنبوب بطريقة قطرة قطرة ، مع الحفاظ على ثابت ولطيف الاختلاط في دوامة. السماح للخليط الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. المفتاح لنجاح الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن يعتمد على حجم وشكل متهور تشكيلها. وبالتالي ، ينبغي vortexed الخليط باستمرار وببطء لتلبية هذا المطلب ، ونتيجة لذلك ، وتحسين فعالية ترنسفكأيشن.
    5. إضافة خليط بطريقة قطرة قطرة ، وحتى في الخلايا 293T (4000 ميكرولتر / القارورة). الثقافة في الخلايا الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2.
    6. استبدال مستنبت مع الطازجة الخالية من المصل OPTI - MEM متوسطة منخفضة المصل الأول (50 مل / قارورة) 80-10 بعد ترنسفكأيشن ح. تواصل الخلايا الثقافة لمدة يومين آخرين في نفس الحالة.
    7. جمع طاف أعرب rRBD تحتوي على بروتين 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. الطرد المركزي عند 6000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلية. إضافة مثبط البروتياز كوكتيل لطاف جمعها وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    8. في اليوم التالي ، تنقية البروتين المؤتلف rRBD من طاف به ثقافة تعليمات ني NTA الصانع Superflow التالية.
    9. تركيز البروتين النقي باستخدام أنابيب -15 Amicon تركيز فائق. بعد تركيز البروتين ،إضافة إلى برنامج تلفزيوني أنابيب الطرد المركزي والتركيز مرة أخرى لإزالة إيميدازول العازلة في شطف. حساب تركيز البروتين وتخزين البروتين النقي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. التحصين الماوس وجمع العينات

  1. قبل الدافئة سيغما مساعد نظام (SAS) إلى 40-45 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة 1 مل فيال في برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا.
  2. يعد البروتين مساعد المستحلب وفقا للبروتوكول في الجدول 2. ماصة حساب البروتين rRBD في أنبوب مل 1.5. إضافة حجم مساو من مساعد SAS إلى دوامة أنبوب وبقوة لمدة 2-3 دقيقة لشكل مستحلب.
    تلميح : إن الكميات المذكورة في الجدول رقم 2 هي واحدة الماوس. ضبط حجم وفقا للأرقام الفعلية المستخدمة الماوس. لكل مجموعة ، مزيج معا والبروتينات والمواد المساعدة المطلوبة لكل لقاح. تحضير عينة واحدة دائما اضافية لتحصين لضمان الدقة.
    مجموعة 1 ش قاح
    (200 ميكرولتر / الماوس)     		2 الثانية لقاح
    (200 ميكرولتر / الماوس)     		3 الثالثة واللقاح
    (200 ميكرولتر / الماوس)
    rRBD البروتين 20 ميكروغرام في البروتين PBS
    (100 ميكرولتر) + 100 ساس ميكرولتر     		10 ميكروغرام في البروتين برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر) + 100 ساس ميكرولتر 10 ميكروغرام في البروتين برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر) + 100 ساس ميكرولتر
    PBS السيطرة 100 PBS ميكرولتر +
    SAS 100 ميكرولتر     		100 PBS ميكرولتر +
    SAS 100 ميكرولتر     		100 PBS ميكرولتر +
    SAS 100 ميكرولتر
    جدول التحصين ماوس 2. البروتوكول
  3. تحت الجلد ، رئيس تحصين الإناث BALB / ج الفئران (4-6 أسابيع من العمر ، 5 الفئران / المجموعة) ، ومرتين مع زيادة rRBD ساس وكما هو مبين في الجدول رقم 2. استخدام برنامج تلفزيوني باسم مجموعة التحكم. موقع لالحقن تحت الجلد وعادة ما يتم اختيار الجلد فضفاض بين لوحي الكتف. بدلا من ذلك ، يستخدم عادة في البطن بطني ، لأنه من الأسهل لحقن ، ويمكن مراقبة أي تسرب من مواقع الحقن. عند استخدام جرعات متكررة من اللقاحات ، فإنه من السهل تحديد مواقع الحقن المختلفة ، ومنع ردود الفعل المحتملة الجلد المحلية.
  4. تنزف الفئران عن طريق المدار الرجعية مع تخدير قبل التحصين ، وبعد كل 10 أيام التلقيح ، والأمصال الحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى تعطيل المتممة. تخزين الأمصال في الماوس -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. كشف تحييد Pseudovirus الفحص باستخدام تحييد

  1. إعداد السارس pseudovirus
    1. انقسام الخلايا 293T 100 ملم في نسيج الثقافة أطباق بتري (2x10 6 خلية / طبق) 16 ساعة قبل ترنسفكأيشن ، وتنمو الخلايا على النحو الوارد أعلاه.
    2. إعداد الكواشف ترنسفكأيشن كما هو مبين في الجدول رقم 1. شارك في transfect ترميز البلازميد بالسارس COV S البروتين وترميز البلازميد ENV - المعيبة ، التي تعرب عن luciferase. HIV - 1 الجينوم (pNL4 - 3.luc.RE) باستخدام كاشف الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن
    3. استبدال المتوسطة مع 10 مل الطازجة DMEM تحتوي على 10 ٪ و 1 ٪ FBS P / S 80-10 ساعة بعد ترنسفكأيشن. جمع طاف pseudovirus السارس تحتوي على 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
    4. تصفية pseudovirus من خلال مرشح 0.45 ميكرون. قسامة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. السارس مقايسة pseudovirus تحييد
    1. انقسام الخلايا 293T معربا عن السارس COV مستقبلات ACE2 (ACE2/293T) في 10 4 cells/100 ميكرولتر / جيد في 96 - جيدا لوحات زراعة الأنسجة قبل 16 ساعة من العدوى.
    2. تمييع السارس pseudovirus بواسطة أضعاف - 2 للكشف عن الفيروس في خلايا عيار ACE2/293T.
    3. مخفف تسلسليا الماوس الأمصال في 96 - جيدا لوحات زراعة الأنسجة ، وإضافة كمية متساوية من pseudovirus معاير السارس. يحضن مسبقا لوحات على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. بعد حضانة ، إضافة 100 ميكرولتر من خليط الأمصال - pseudovirus إلى خلايا ACE2/293T ، والاستمرار في زراعة خلايا في 37 في 5 ٪ CO 2 درجة مئوية. إضافة جديدة DMEM 24 ساعة في وقت لاحق.
    5. إزالة supernatants الثقافة من لوحات 72 ساعة بعد الاصابة. إضافة 1X خلية ثقافة luciferase كاشف تحلل (60 ميكرولتر / جيد) ، وتعزيز تحلل الخلية مع الهز المستمر لوحات لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    6. lysates الخلية نقل (50 ميكرولتر / أيضا) في لوحات luminometer (Microfluor 96 - جيدا لوحات). إضافة الركيزة luciferase (50 ميكرولتر / جيد) المضمنة في نظام مقايسة luciferase ، وكشف النشاط النسبي في luciferase luminometer 384 الترا.
    7. حساب السارس عيار تحييد pseudovirus والحاضر إلى 50 ٪ عيار الأضداد تحييد (NT 50) 6.

Discussion

كثافة الخلية هو عامل مهم يؤثر على فعالية ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم على أساس. في تجربتنا ، وأقل من 70 ٪ من الخلايا confluency يجلب أفضل النتائج. وبالتالي ، من أجل تحسين كفاءة ترنسفكأيشن ، فمن المستحسن أن تبقى كثافة الخلية بنحو 50-70 ٪ من confluency. ويعتقد عموما ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم طريقة لتكون أقل كفاءة بالمقارنة مع الطرق ترنسفكأيشن أخرى ، مثل ترنسفكأيشن الدهون 16. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، استخدمنا طريقة تعديل فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن ثابتة وبطيئة حيث خلط الحل ترنسفكأيشن في دوامة يضمن تشكيل يعجل مع حجم المناسبة والشكل ، وبالتالي تحسين كفاءة ترنسفكأيشن.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في الولايات المتحدة (RO1 AI68002).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigma-AldrichS7653
Na2HPO4*7H2OSigma-AldrichS2429
HEPESSigma-AldrichH3375
CaCl2*2H2OSigma-AldrichC5080
DMEMInvitrogen12430
HI FBSInvitrogen10438
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140
OPTI-MEM I MediumInvitrogen31985
Protease inhibitor cocktailRoche Group11836170001
Ni-NTA SuperflowQiagen30450
Sigma adjuvant systemSigma-AldrichS6322
Luciferase assay systemPromega Corp.E1501
Luciferase cell culture lysis reagent (5X)Promega Corp.E1531
Amicon Ultra - 15EMD MilliporeUFC901024
Microfluor 96-well platesThermo Fisher Scientific, Inc.7905
Ultra 384 luminometerTecan Group Ltd.

References

  1. Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
  2. Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
  3. Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
  4. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  5. Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
  6. Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
  7. Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
  8. Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
  9. He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
  10. Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
  11. Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
  12. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  13. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  14. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  15. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
  16. Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

51

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved