タンパク質調製物、動物の予防接種と中和の検出：遺伝子組換えRBDベースのSARSのワクチンのためのプロトコル

このプロトコルは、組換え受容体結合ドメイン（RBD）ベースのSARSに対するサブユニットワクチンを研究するための一般的な手順を説明します。それは、293T細胞におけるRBDタンパク質のトランスフェクションと発現、RBDおよび確立されたSARSの偽ウイルス中和アッセイを用いたマウス血清の中和活性の検出によるマウスの免疫化のためのメソッドが含まれています。

それらの安全性プロファイルと感染症に対して強力な免疫応答を誘導する能力に基づいて、サブユニットワクチンは^1-3病原体の様々な候補として使用されている。哺乳類細胞系がこのように適切に折り畳まとグリコシル化タンパク質を形成し、翻訳後修飾が可能なので、哺乳動物細胞で発現した組換えタンパク質は、高い抗原性および免疫原性^4-6を維持するために最大の可能性を示している。

SARSの新たな症例は2004年以来報告されていないものの、将来の発生が一定の脅威であるため、SARS - CoVのワクチンの開発には慎重な予防手段であり、実施されるべきである。 SARS - CoVのSタンパク質のRBDは、ウイルス感染^7から9に対する特異的中和抗体の受容体結合と誘導に重要な役割を果たしている。したがって、このプロトコルでは、我々はSARSに対するRBDベースのサブユニットワクチンを開発するための新規の方法を説明します。簡単に言えば、組換えRBDタンパク質（rRBDは）適切なコンフォメーションと高い免疫原性⁶で正しく折り畳まれたタンパク質を得るために哺乳類293T細胞の培養上清中に発現した。細胞への組換えプラスミドのエンコーディングRBDのトランスフェクションは、いくつかの修正とリン酸カルシウムトランスフェクション法^6,10を用いて行った。脂質トランスフェクション法^11,12と比較して、この変更されたリン酸カルシウムトランスフェクション法は、処理する方が簡単、安価であり、そして適切なサイズと形状を持つトランスフェクション複合体は^13,14を形成されると、高い有効性に到達する可能性を秘めています。最後に、SARSの偽ウイルス中和アッセイは、プロトコルで導入され、rRBDタンパク質をワクチン接種したマウスの血清の中和活性を検出するために使用されていました。このアッセイは比較的安全である、伝染性SARS - CoVのが関与していない、およびバイオ- 3実験室¹⁵の要件なしで行うことができます。

プロトコルはここで説明するも、クラスIの融合タンパク質、例えば、HIV、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、エボラウイルス、インフルエンザウイルスだけでなく、ニパウイルスとHandraウイルスと他のウイルスに対する組換えサブユニットワクチンを設計し、研究するために使用することができます。さらに、偽を生成し、その後、偽ウイルス中和アッセイを確立するための方法はすべて、これらのウイルスに適用することができます。

1。組換えSARS - CoVのRBDタンパク質の調製

1. リン酸カルシウムトランスフェクション試薬を準備する
   1. 2X HBSバッファーの準備：一緒に塩化ナトリウム16gの、のNa ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O 0.4gの、およびHEPESの13.0グラムを混ぜる。 7.00 pHを調整し、蒸留水で1000mLとする総量を持ち出す。滅菌用溶液を濾過した後、分注して-20℃で保存する
      ヒント：pH値の任意の変化は、トランスフェクションの結果に影響を与えるだろう。従って、それは7.00（たとえば、6.99、7.00、または7.01）の周りにいくつかのpH値をテストし、下記の導入方法を用いてトランスフェクションに最適なものを見つけることをお勧めします。
   2. 2.5 M CaCl _2の準備：200mLの最終容量に蒸留水に塩化カルシウム₂ * 2H ₂ Oの73.5グラムを追加。 -20℃で溶液とストアをフィルタリング
2. 組換えプラスミドトランスフェクションとタンパク質精製
   1. トランスフェクションの前に50〜70パーセントコンフルエント24時間で293T細胞を分割する。 40mLのDMEMにFBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）で37 10％熱不活性化（HI）を含む° Cを5％CO ₂でのT - 175cm ^2の組織培養フラスコで細胞を成長させる。
   2. すべてのトランスフェクション試薬、トランスフェクションの前に室温に立ち上げることが必要。これらの試薬 ​​は、2X HBS、2.5MのCaCl _{2、DIH 2} O、及びrRBDプラスミド^6を含む。
      ヒント：タンパク質発現に使用される最終的な組換えプラスミド構築物は、培養上清中に発現した組換えタンパク質の分泌を確保するためのシグナルペプチドが含まれている必要があります。 6X Hisタグを簡単に精製するための発現タンパク質のC末端に追加されることがあります。
   3. 1つの50 mLの（A）と1つの15 mLの（B）BDファルコンチューブを準備し、表1に示されている試験管に試薬を加える。チューブBでチューブAに2X HBSバッファーを追加し、2.5M CaCl _2を追加し、プラスミドrRBD、およびDIH _{2 O}の要件にボリュームをもたらす
      

      A. One T - 175cm 2の組織培養フラスコ（4000μL/フラスコ）：rRBD表現するための準備
      チューブ		チューブB
      2X HBS	2000μL	2.5MのCaCl 2	200μL
      		rRBDプラスミドDNA	40μgの
      		DIH 2 Oへ	2000μL
      B. One 100 mmのペトリ皿（1000μL/皿）：SARSの偽の生産準備
      チューブ		チューブB
      2X HBS	500μL	2.5MのCaCl 2	50μL
      		SARS - CoVのSプラスミドDNA	5μgの
      		プラスミドHIV - 1（pNL4 - 3.luc.RE）	5μgの
      		DIH 2 Oへ	500μL

      表1。トランスフェクション混合物の準備とボリューム
      表1に記載されているボリュームは一トランスフェクションユニット用です。より多くのフラスコや皿をトランスフェクションに使用されている場合は、それに応じてボリュームを調整します。
   4. 渦の定数と、穏やかに混合維持しながら、チューブ滴下方法で中にチューブのBのDNA -カルシウム溶液を加える。混合物は20〜30分間室温で放置します。成功したリン酸カルシウムトランスフェクションのためのキーが形成された沈殿物の大きさと形状に依存する。このように、混合物は、結果として、トランスフェクション効率を向上させる、この要件を満たすために絶えずゆっくりとボルテックスとすべきである。
   5. 293T細胞（4000μL/フラスコ）にさえ滴下し、方法で混合物を追加。 37℃インキュベーターで培養細胞を℃、5％CO ₂でC。
   6. 新鮮な無血清OPTI - MEM I削減血清培地（50mLの/フラスコ）80から10時間後にトランスフェクション培地を交換してください。同じ条件でさらに2日間、培養細胞に進みます。
   7. を含む上清に発現rRBDタンパク質の72時間のトランスフェクション後を収集する。細胞破片を除去するために15分間6000rpmで遠心する。 4℃で一晩上清を回収し、ストアにプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加。
   8. 次の日に、製造元の指示に従ってのNi - NTA Superflowを使用して培養上清よりrRBD組換えタンパク質を精製する。
   9. アミコンウルトラ-15濃度のチューブを使用してタンパク質を精製した集中。タンパク質濃度の後、濃度のチューブにPBSを追加し、溶出バッファーにイミダゾールを削除するには、もう一度遠心してください。 ° C使用時まで-80タンパク質を精製タンパク質の濃度とストアを計算する。

2。マウスの免疫化およびサンプル採集

1. プレ暖かいシグマアジュバントシステム（SAS）40から45℃までは、製造元の指示に従って。バイアル当たり1mLのPBSを加えてよく混ぜる。
2. 表2のプロトコルに従って、タンパク質-アジュバントエマルジョンを準備します。ピペットで1.5 mlチューブにrRBDタンパク質を算出。チューブとエマルジョンを形成するために2〜3分間激しくボルテックスするSASアジュバントの等量を追加。
   ヒント：表2にリストされているボリュームは、つのマウス用です。実際に使用されるマウスの数に応じてボリュームを調整します。各グループについて、それぞれのワクチンに必要なタンパク質とアジュバントを一緒に混ぜる。常に正確さを確保するためにワクチン接種が1回余分のサンプルを準備する。
   

   グループ	第1回ワクチン （200μL/マウス）	第2回のワクチン （200μL/マウス）	第3 回ワクチン （200μL/マウス）
   rRBDタンパク質	PBSで20μgのタンパク質 （100μL）+ 100μLSAS	PBS中の10μgのタンパク質（100μL）+ 100μLSAS	PBS中の10μgのタンパク質（100μL）+ 100μLSAS
   PBS制御	100μLのPBS + 100μLSAS	100μLのPBS + 100μLSAS	100μLのPBS + 100μLSAS

   表2。マウスの免疫化プロトコール
3. 皮下プライム接種雌のBALB / cマウス（4-6週齢、5匹/群）、およびrRBDとSASで二回ブーストは、表2に示した。コントロールとしてPBS群を使用してください。通常、選択された皮下注射のためのサイトは、肩甲骨の間のたるんだ皮膚になります。また、腹側腹部は、それは注入することが簡単なので、一般的に、使用されており、注射部位からの漏れが観察される場合があります。ワクチンの反復投与が使用されている場合、それは潜在的な地元の皮膚反応を防止するため、様々な注射部位を選択することは簡単です。
4. ° Cで30分間補数を失活させる56の各ワクチン接種後にワクチン接種し、10日の前に麻酔薬による眼窩、そして熱血清を経由してマウスをブリード。使用するまで-20℃で保存するマウス血清。

3。偽ウイルス中和アッセイを使用して中和検出

1. SARSの偽を準備
   1. 16時間は、トランスフェクションの前に100mmの組織培養ペトリ皿（2 × 10 ⁶細胞/ディッシュ）で293T細胞を分割し、上記のように細胞を成長させる。
   2. 表1に示されるトランスフェクション試薬を準備します。同時トランスフェクションをコードするプラスミドSARS - CoVのSタンパク質とをコードするプラスミドEnvの欠損、ルシフェラーゼを発現するHIV - 1ゲノム（pNL4 - 3.luc.RE）リン酸カルシウムトランスフェクション試薬を使用する。
   3. 10mLの新鮮なDMEMを含む10％FBSと1％P / S 80から10時間後にトランスフェクション培地を交換してください。偽72時間トランスフェクション後上清を含むSARSを収集する。
   4. 0.45μmのフィルターを通してフィルター偽。 -80℃で分注し、店舗℃で使用するまで。
2. SARSの偽ウイルス中和アッセイ
   1. 16時間は感染する前に、96ウェル組織培養プレートに⁴ cells/100μL/ウェル10でSARS - CoVの受容体ACE2（ACE2/293T）を発現する293T細胞を分割する。
   2. ACE2/293T細胞でウイルス力価を検出するために、2倍でSARSの偽ウイルスを希釈する。
   3. シリアル96ウェル組織培養プレートにマウス血清を希釈し、滴定SARSの偽の等量を追加します。 1時間37℃でプレートをPreinc​​ubate
   4. インキュベーション後、ACE2/293T細胞に血清-偽の混合物の100μLを追加し、37℃で細胞を成長し続ける° Cを5％CO ₂で。後で新鮮なDMEM 24時間を追加。
   5. 完全にプレート72時間後の感染から培養上清を取り除く。 1Xルシフェラーゼの細胞培養溶解試薬（60μL/ウェル）を追加し、一定の室温で1-2時間プレートを振盪しながら細胞溶解を促進する。
   6. ルミノメーターのプレート（Microfluor 96ウェルプレート）に、細胞溶解物（50μL/ウェル）を転送する。ルシフェラーゼアッセイ系に含まれるルシフェラーゼ基質（50μL/ウェル）を追加し、ウルトラ384ルミノメーターでの相対的なルシフェラーゼ活性を検出する。
   7. 50パーセント中和抗体価（NT _^50）6としてSARSの偽の中和力価と現在を計算する。

細胞密度は、リン酸カルシウムベースのトランスフェクションの有効性に影響を与える重要な要因です。我々の経験では、細胞のコンフルエンシーが70％未満では、最良の結果をもたらします。このように、トランスフェクション効率を向上させるためには、それは細胞密度がコンフルエントの50〜70％前後に維持することをお勧めします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、一般的にこのような脂質トランスフェクション¹⁶のような他のトランスフェクション法に比べ非効率的であると考えられている。しかし、このプロトコルでは、我々はこのようにトランスフェクション効率を向上させる、渦のトランスフェクション溶液の混合定数、遅いが適切なサイズと形状の沈殿物の形成を確保することにより修正されたリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用。

この研究は、米国の国立衛生研究所（NIH）（RO1 AI68002）によってサポートされていました。