פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

פרוטוקול זה מתאר הליך כללית לחקר קולטן מחייבים תחום רקומביננטי (RBD) מבוססי למקטע חיסונים נגד מחלת הסארס. היא כוללת שיטות transfection וביטוי של חלבונים בתאים מזוכך 293T, חיסון של עכברים עם RBD וזיהוי פעילות נטרול של העכבר סרה באמצעות נטרול הסארס הוקמה assay pseudovirus.

בהתבסס על פרופיל הבטיחות שלהם ואת היכולת להשפיע על המערכת החיסונית חזק נגד זיהומים, חיסונים למקטע שימשו מועמדים למגוון רחב של פתוגנים ^1-3. מאז מערכת תא יונקים מסוגל שינוי שלאחר translational, ובכך ליצור חלבונים מקופלים כראוי glycosylated, חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאי יונקים הראו את הפוטנציאל הגדול ביותר לשמור antigenicity גבוהה immunogenicity ^4-6.

למרות שאין מקרים חדשים של סארס דווחו מאז 2004, התפרצויות בעתיד הם איום מתמיד, ולכן פיתוח של חיסון נגד מחלת הסארס-CoV היא צעד מניעתי זהיר צריך להתבצע. מזוכך של חלבון S-SARS CoV משחק תפקידים חשובים מחייב גיוס של הקולטן נוגדנים מנטרלים ספציפיים מפני הידבקות בווירוסים ^7-9. לפיכך, פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות חדשניות לפיתוח חיסון מזוכך מבוססי למקטע נגד הסארס. בקצרה, חלבון רקומביננטי מזוכך (rRBD) באה לידי ביטוי supernatant התרבות של תאים 293T יונקים לקבל חלבון מקופל כראוי עם קונפורמציה נכונה immunogenicity גבוה ^6. Transfection של הקידוד רקומביננטי מזוכך הפלסמיד לתאי בוצעה מכן באמצעות סידן פוספט transfection שיטה ^6,10 עם שינויים מסוימים. לעומת השיטה השומנים transfection ^11,12, פוספט זה שונה סידן שיטה transfection הוא זול יותר, קל יותר לטפל, ויש לו פוטנציאל להגיע ליעילות גבוהה פעם מורכבים transfection עם גודל וצורה המתאימים נוצר ^13,14. לבסוף, assay נטרול הסארס pseudovirus הוצג פרוטוקול בשימוש כדי לזהות את הפעילות נטרול של סרה של העכברים שחוסנו עם חלבון rRBD. Assay זה בטוח יחסית, אינו כרוך זיהומיות הסארס-CoV, והוא יכול להתבצע ללא דרישה של biosafety-3 מעבדה ^15.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כדי לתכנן מחקר למקטע רקומביננטי חיסונים נגד וירוסים אחרים עם חלבונים אני בכיתה היתוך, למשל, איידס, וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), נגיף אבולה, נגיף השפעת, כמו גם וירוסים Nipah ו Handra. בנוסף, שיטות להפקת pseudovirus ובהמשך להקים assay נטרול pseudovirus יכול להיות מיושם על כל אלה וירוסים.

1. רקומביננטי הסארס-CoV מזוכך הכנה חלבון

1. הכן סידן זרחתי מגיב transfection
   1. 2X הכנה בהרוורד חיץ: מערבבים 16 גרם של NaCl, 0.4 גרם של Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, ו - 13.0 גרם של HEPES. התאם את ה-pH 7.00 ולהביא את הנפח הכולל עד 1000 מ"ל במים מזוקקים. לאחר סינון הפתרון aliquot עיקור, ולאחסן אותו ב -20 ° C.
      רמז: כל וריאציה של ערך ה-pH תשפיע על תוצאות transfection. לפיכך, רצוי לבדוק מספר ערכים סביב 7.00 pH (לדוגמה, 6.99, 7.00, או 7.01) ו למצוא את הטוב ביותר עבור transfection בשיטת הציג להלן.
   2. 2.5 מ 'CaCl ₂ הכנה: הוסף 73.5 גרם של CaCl ₂ * 2H ₂ O ל מים מזוקקים בנפח סופי של 200 מ"ל. סנן הפתרון ולאחסן ב -20 ° C.
2. פלסמיד רקומביננטי transfection וחלבון טיהור
   1. פיצול תאים 293T ב% 50-70 שעות confluency 24 לפני transfection. לגדל תאים T-175 ² ס"מ רקמות צלוחיות תרבות 40 מ"ל DMEM המכיל 10% חום מומת (HI) FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) בשעה 37 ° C ב 5% CO _2.
   2. ריאגנטים כל transfection יחונכו לטמפרטורת החדר לפני transfection. ריאגנטים אלה כוללים 2X בהרוורד, 2.5M CaCl _2, DiH ₂ O, ו - ⁶ פלסמיד rRBD.
      רמז: פלסמיד רקומביננטי הסופי לבנות המשמש ביטוי החלבון צריכה להכיל פפטיד האות כדי להבטיח הפרשת חלבונים רקומביננטי הביע את supernatant התרבות. תג 6x שלו ניתן להוסיף הטרמינל-C של החלבון הביע לטיהור קל.
   3. הכן one 50 מ"ל (א) ואחד 15 מ"ל (ב) צינור BD פלקון, ולהוסיף ריאגנטים את צינורות כמפורט בטבלה 1. הוסף חוצץ 2X בהרוורד א 'צינור צינור B, להוסיף 2.5M CaCl ₂ ו rRBD פלסמיד, ולהביא את עוצמת הדרישה של DiH ₂ O.
      

      א אחת T-175 2 ס"מ רקמה תרבות צפחת (4000 μL / בקבוק): להתכונן ביטוי rRBD
      Tube		Tube B
      2X בהרוורד	2000 μL	2.5M CaCl 2	200 μL
      		פלסמיד דנ"א rRBD	40 מיקרוגרם
      		DiH 2 O ל	2000 μL
      אחת ב 100 מ"מ צלחת פטרי (1000 μL / תבשיל): להתכונן הייצור pseudovirus הסארס
      Tube		Tube B
      2X בהרוורד	500 μL	2.5M CaCl 2	50 μL
      		פלסמיד דנ"א הסארס CoV-S	5 מיקרוגרם
      		HIV-1 פלסמיד (pNL4-3.luc.RE)	5 מיקרוגרם
      		DiH 2 O ל	500 μL

      1. טבלת transfection תערובת הכנה כרכים
      הכרכים המפורטים בטבלה 1 הן עבור יחידה אחת transfection. אם צלוחיות או יותר מנות משמשים transfection, להתאים כמויות בהתאם.
   4. מוסיפים את פתרון ה-DNA סידן B צינור לתוך צינור באופן dropwise, תוך שמירה מתמדת ערבוב עדין במערבולת. תנו לתערובת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. המפתח עבור transfection סידן פוספט מוצלח תלוי בגודל ובצורה של המשקע שנוצר. לפיכך, התערובת צריכה להיות vortexed הזמן ולאט לאט בדרישה זו, וכתוצאה מכך, לשפר את היעילות transfection.
   5. הוסף תערובת באופן dropwise ואפילו לתוך תאים 293T (4000 μL / בקבוק). התרבות התאים החממה ב 37 ° C ב 5% CO _2.
   6. החלף את התרבות בינוני עם בינוני טרי סרום ללא OPTI-ממ מופחתת אני סרום (50 מ"ל / בקבוק) 80-10 שעות שלאחר transfection. המשך התרבות תאים עוד יומיים באותו המצב.
   7. איסוף supernatant ובו הביע חלבון rRBD 72 שעות שלאחר transfection. צנטריפוגה בסל"ד 6000 במשך 15 דקות כדי להסיר פסולת התא. הוסף מעכבי הפרוטאז כדי קוקטייל supernatant שנאסף ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה.
   8. למחרת, לטהר חלבון רקומביננטי rRBD מ supernatant התרבות באמצעות הוראות Ni-נ.ת. ע יצרן Superflow של הבאים.
   9. תתרכז מטוהרים באמצעות חלבון Amicon Ultra צינורות -15 הריכוז. לאחר ריכוז חלבון,להוסיף PBS על צינורות ריכוז צנטריפוגות שוב להסיר imidazole במאגר elution. חישוב ריכוז חלבון ולאחסן מטוהרים חלבון ב -80 ° C עד השימוש.

2. עכבר חיסון ואיסוף דוגמאות

1. טרום חם Sigma משלים למערכת (SAS) ל 40-45 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות היצרן. הוסף 1 מ"ל PBS לכל הבקבוקון ומערבבים היטב.
2. הכינו חלבון משלים אמולסיה לפי הפרוטוקול בטבלה 2. פיפטה מחושב חלבון rRBD לתוך צינור 1.5 מ"ל. מוסיפים נפח שווה של SAS adjuvant כדי הצינור מערבולת במרץ 2-3 דקות כדי ליצור אמולסיה.
   רמז: כרכים המפורטים בטבלה 2 מיועדים עכבר אחד. התאם כרכים על פי המספרים העכבר משמש בפועל. עבור כל קבוצה, מערבבים יחד את החלבונים ו adjuvant נדרש חיסון אחד. תמיד להכין דגימה אחת נוספת עבור החיסון כדי להבטיח דיוק.
   

   קבוצה	1 st חיסון (200 μL / עכבר)	2 nd חיסון (200 μL / עכבר)	3 rd חיסון (200 μL / עכבר)
   rRBD חלבון	20 מיקרוגרם חלבון PBS (100 μL) + 100 μL SAS	10 מיקרוגרם חלבון ב PBS (100 μL) + 100 μL SAS	10 מיקרוגרם חלבון ב PBS (100 μL) + 100 μL SAS
   PBS מלאה	100 μL PBS + 100 μL SAS	100 μL PBS + 100 μL SAS	100 μL PBS + 100 μL SAS

   2. טבלה עכבר פרוטוקול חיסון
3. תת עורי בפריים לחסן נשים BALB / c עכברים (4-6 שבועות, 5 עכברים / קבוצה), וכן להגביר פעמיים עם rRBD ו-SAS, כמצוין בטבלה 2. השתמש PBS קבוצה כמו שליטה. האתר של זריקות תת עורית נבחר בדרך כלל היא עור רפוי בין השכמות. לחלופין, הבטן הגחון הוא נפוץ, כי קל יותר להזריק, ועשוי לבחון כל דליפה מאתרי ההזרקה. כאשר מנות חוזרות של חיסונים רגילים, קל לבחור אתרים הזרקה שונים, מניעת פוטנציאל תגובות עור מקומיות.
4. Bleed עכברים באמצעות רטרו מסלולית עם הרדמה לפני חיסון ו 10 ימים לאחר החיסון כל, חום סרה על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית משלימים. חנות העכבר סרה ב -20 ° C עד השימוש.

3. נטרול איתור באמצעות נטרול Assay Pseudovirus

1. הכן pseudovirus הסארס
   1. פיצול תאים 293T ב 100 ברקמת מ"מ צלחות פטרי תרבות (2x10 ⁶ תאים / תבשיל) 16 שעות לפני transfection, ולגדל תאים לעיל.
   2. הכן ריאגנטים transfection כמפורט בטבלה 1. Co-transfect קידוד פלסמיד-SARS CoV S חלבון קידוד פלסמיד Env-פגום, בלוציפראז-לבטא HIV-1 הגנום (pNL4-3.luc.RE) באמצעות סידן זרחתי מגיב transfection.
   3. החלף בינוני עם 10 מ"ל טרי DMEM המכיל 10% FBS ו -1% P / S 80-10 שעות שלאחר transfection. איסוף supernatant הסארס המכיל 72 pseudovirus שעות שלאחר transfection.
   4. Pseudovirus סינון דרך המסנן 0.45 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
2. נטרול הסארס pseudovirus assay
   1. פיצול תאים 293T להביע הסארס-CoV קולטן ACE2 (ACE2/293T) בשעה 10 cells/100 μL ⁴ / 96-היטב היטב צלחות תרבית רקמה 16 שעות לפני ההדבקה.
   2. מדולל pseudovirus הסארס על ידי 2-לקפל כדי לזהות את כייל הנגיף בתאים ACE2/293T.
   3. סדרתי לדלל עכבר סרה ב 96-היטב צלחות תרבית רקמה, ולהוסיף נפח שווה של pseudovirus הסארס טיטרציה. Preincubate צלחות ב 37 ° C עבור 1 ח
   4. לאחר דגירה, להוסיף 100 μL של תערובת סרה-pseudovirus לתאי ACE2/293T, וממשיכים לגדול בתאים ב 37 ° C ב 5% CO _2. הוסף טרי DMEM 24 שעות מאוחר יותר.
   5. להסיר לחלוטין supernatants תרבות של הצלחות 72 שעות לאחר ההדבקה. הוסף 1X תא בלוציפראז תרבות תמוגה מגיב (60 μL / טוב), ולקדם תמוגה התא קבוע עם רעד של צלחות עבור 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
   6. תא העברת lysates (50 μL / טוב) לתוך צלחות luminometer (96-Microfluor גם הצלחות). הוסף המצע בלוציפראז (50 μL / טוב) הכלולים במערכת assay בלוציפראז, וכדי לזהות פעילות בלוציפראז יחסית luminometer 384 Ultra.
   7. חישוב נטרול הסארס pseudovirus titer ובהווה כמו titer 50% נוגדנים מנטרלים (NT ₅₀₎ ^6.

צפיפות התאים הוא גורם חשוב המשפיע על יעילות transfection פוספט מבוססי סידן. מניסיוננו, פחות מ 70% confluency התאים מביא את התוצאות הטובות ביותר. לפיכך, על מנת לשפר את יעילות transfection, מומלץ כי צפיפות התאים להישמר% סביב 50-70 של confluency. פוספט סידן שיטה transfection נחשב בדרך כלל להיות פחות יעיל בהשוואה לשיטות transfection אחרים, כגון transfection השומנים ^16. עם זאת, בפרוטוקול זה, השתמשנו פוספט שונה סידן transfection שיטה לפיה קבוע ואיטי ערבוב של הפתרון transfection במערבולת מבטיח היווצרות המשקע עם גודל וצורה המתאימים, ובכך לשפר את יעילות transfection.

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) של ארצות הברית (RO1 AI68002).