Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

Sintéticos curto polímeros de ácido nucléico, oligonucleotides (oligos), são as ferramentas mais funcional e generalizada da biologia molecular. Oligos podem ser produzidos para conter qualquer DNA ou RNA desejada seqüência e pode ser preparado para incluir uma ampla variedade de base e modificações açúcar. Além disso, oligos podem ser projetados para imitar alterações específicas de ácidos nucléicos e, portanto, podem servir como importantes ferramentas para investigar os efeitos de danos no DNA e mecanismos de reparação. Descobrimos que Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligos com um comprimento entre 50 e 80 nucleotídeos pode ser particularmente adequado para estudar, in vivo, as funções e conseqüências de RNA cromossômicas / híbridos de DNA e de ribonucleotídeos incorporadas ao DNA. RNA / DNA híbridos podem facilmente se formam durante o reparo do DNA, replicação e transcrição, no entanto, muito pouco se sabe sobre a estabilidade do RNA / DNA híbrido em células e em que medida estes híbridos podem afetar a integridade genética das células. RNA contendo oligos, portanto, representam um vetor perfeito para apresentar em ribonucleotídeos DNA cromossômico e gerar RNA / DNA híbridos de comprimento escolhido e composição base. Aqui apresentamos o protocolo para a incorporação de ribonucleotídeos no genoma da levedura eucariótica modelo de sistema / Saccharomyces cerevisiae /. No entanto, nosso laboratório utilizou Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligos para gerar RNA / DNA híbridos ao nível cromossômico em sistemas de células diferentes, de bactérias a células humanas.

Fundamentação

Explorando o uso da Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 a 80-mers, aqui apresentamos um procedimento, baseado em um ensaio de gene de correção, pelo qual oligos podem transferir informações genéticas de DNA genômico de células de levedura, seguindo annealing para o DNA-alvo cromossômicas. Bem sucedida segmentação por oligos é marcado pelo aparecimento de colônias de leveduras exibir o fenótipo esperado. Se a modificação genética desejada é realizada dentro de um ou mais ribonucleotídeos incorporadas na seqüência oligo, a informação genética flui diretamente do trato RNA para o DNA-alvo cromossômicas, assim, uma forma de RNA / DNA híbrido em nível cromossômico durante o processo de segmentação. O ribonucleotídeo / s de um Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo pode servir como modelo para gene targeting via síntese de reparação do DNA, ou podem ser incorporados ao DNA e servir como modelo durante a replicação do DNA. Nestes experimentos utilizamos o fermento / Saccharomyces cerevisiae / eucariótica sistema modelo, no entanto, uma abordagem semelhante também pode ser aplicado em outros organismos ou tipos de células. Neste vídeo, nós usamos um Thermo Scientific Dharmacon oligo projetado com homologia a um gene-alvo genômico de levedura e contendo um ribonucleotídeo no meio para corrigir uma mutação no gene alvo. Depois de transformação com o oligo-RNA contendo, observa-se a correção do site orientado para uma determinada freqüência, o que indica que o trato RNA do oligo poderia ser incorporada no DNA cromossômico e servir como modelo para a síntese de DNA durante a replicação do DNA. A informação genética realizada no trato RNA é estável transmitida às gerações seguintes celular. Aqui, descrevemos as etapas de transformação de células de levedura pela Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo ea abordagem para detectar as informações RNA transferência no DNA cromossômico.

A. Estrutura da RNA Oligo contendo utilizadas neste experimento

Nós projetamos um oligo-RNA contendo para corrigir um defeito genético na levedura S. DNA cromossômico cerevisiae no locus trp5. A cepa de levedura utilizada no protocolo contém um gene mutante trp5 com uma deleção de dois de base e uma mutação nonsense (Figura 1A). Cepa de levedura como é um mutante auxotróficas triptofano e não formam colônias na mídia sem triptofano. A seqüência de DNA do gene TRP5 está disponível no Banco de Dados do Genoma cerevisiae (http://www.yeastgenome.org/). A Thermo Scientific Dharmacon oligo-RNA contendo utilizado neste protocolo é um 65-mer com uma inserção de DNA 2-base, concebidos para corrigir a mutação exclusão e um ribonucleotídeo concebidos para corrigir a mutação nonsense do alelo trp5 (Figura 1A). A seqüência dos oligo é concebido como segue:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Este oligo é sintetizada pela Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO), 200 nM escala, e é dessalinizada, deprotected e usados ​​sem purificação PAGE.

B. Preparação do RNA Oligo contendo fermento para a Transformação (modificado de Storici et al., 2007 ¹⁾

1. Limpe os materiais que serão utilizados para o experimento, incluindo tubos de oligo, pipetas, vortex, racks, área experimental e as luvas usadas pelo investigador com RNase solução de descontaminação para remover a contaminação RNase potencial antes do início de tudo. Use RNase água, reagentes químicos, tubos e ponteiras em todas as etapas. Cada passo neste experimento deve ser RNase-free.
2. Ressuspender o Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo recebeu da empresa a 250 pmoles / mL solução estoque com RNase água e vortex vigorosamente para dissolver o sedimento. Armazenar a -80 ° C.
3. Imediatamente antes da transformação, descongelar o oligo-RNA contendo no gelo e diluir para 50 pmoles / mL com RNase água livre de RNase em tubos. Cada transformação exige uma nmole dos oligos RNA contendo.
4. Desnaturar uma quantidade escolhida do oligos RNA contendo no bloco de aquecimento 100 ° C por 2 min para eliminar as estruturas secundárias do oligos.
5. Imediatamente após a desnaturação colocar o tubo no gelo. Manter em gelo até a transformação.
6. Como controle no experimento um DNA somente correspondente oligo é usado. Este oligo é descongelado de -20 ° C e preparados para a transformação como a oligo-RNA que contenham, como descrito acima.

C. Transformação de células de levedura usando o RNA Oligo contendo

1. Inocular 5 ml de meio líquido rico YPD com o trp5 células de levedura mutante e crescer a 30 ° C durante a noite (veja Materiais).
2. Transferência de 1,5 ml da cultura durante a noite em 50 ml de meio líquido YPD.
3. Incubar as células em um shaker 30 ° C (225 rpm) por 4h.
4. Preparar a solução de umSolução 2 e imediatamente antes da transformação em RNase tubos (veja Materiais).
5. Transferir a cultura de células em um tubo de 50 ml RNase-free e girar a 3000 rpm, correspondente a 1.562 g, durante 2 min. O pellet de células a precipitação é de aprox. 0,3 cm ^3.
6. Remover as células sobrenadante e lavar com 50 ml de RNase água e giram a 3000 rpm por 2 min.
7. Repita o passo 6 para 5 vezes para se livrar do meio de cultura e RNases que podem estar presentes no meio, tanto quanto possível.
8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de solução 1 e girar a 3000 rpm por 2 min.
9. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 250 ml de solução 1. Esta quantidade de células é suficiente para 7-8 transformações.
10. Alíquota de 50 mL da suspensão de células em tubos de microcentrífuga RNase-free, adicionar 20 mL de RNA contendo oligo solução de trabalho (1 nmole), ou 20 l de DNA somente oligo solução de trabalho (1 nmole), ou 20 l de água estéril sem oligo para o controle negativo. Em seguida, adicione 300 ml de solução 2 para cada reação de transformação. Não há necessidade de acrescentar DNA de esperma de salmão no processo de transformação, como o ato oligos como portador si.
11. Vortex vigorosamente para misturar os componentes de forma homogênea.
12. Incubar reações de transformação a 30 ° C por 30 min em um agitador.
13. Choque térmico a 42 ° C por 15 min.
14. Spin down células a 5000 rpm, correspondente a 2.236 g, durante 4 min.
15. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 100 ul de água estéril.
16. Tomar uma alíquota desta suspensão de células e dilui-lo com água estéril por 100.000 vezes e as células da placa em uma placa YPD usando aprox. 15 contas de vidro estéril e incubar a 30 ° C por 2 dias.
17. Placa de todas as células ressuspendidas de cada reação de transformação em uma placa de Petri de meio completo sintética sólida sem triptofano (Trp-SC), usando aprox. 15 contas de vidro estéril e incubar a 30 ° C por 4-5 dias (Figura 2).

D. Análise de Correção Gene pela RNA Oligo contendo

1. Contar o número de colônias crescidas no meio seletivo (Figura 2), bem como em meio YPD para calcular a freqüência de correção gene para o RNA-oligo contendo, o DNA oligo-only e para o controle não-oligo. Compare o número obtido. Taxa de reversão espontânea do trp5 alelos com as exclusões dois-base ea mutação nonsense é inferior a 09/10 na cepa de levedura utilizada, portanto, esperamos que nenhuma formação colónias no meio seletivo quando não oligos são adicionadas às células.
2. Expelido vários escolhido aleatoriamente colônias transformantes em meio YPD obter isolados única colônia. Esperar dois dias para o crescimento da colônia, em seguida, tomar várias (pelo menos 5) colônias única e fazer correções em YPD e em meio seletivo.
3. Projetar um par de primers para amplificar a região (250-1,000 pb) alvo do oligo-RNA, contendo, em colônia PCR (Figura 1B). O procedimento para a colônia PCR é a seguinte (modificado de Storici e Resnick, 2006 ^2).
   1. Ressuspender as células (aproximadamente 1 mm3) retirado os patches individuais em 50 ul de água e adicionar uma unidade de lyticase. Incubar a temperatura ambiente por 10 min seguido de incubação em um bloco de aquecimento a 100 ° C por 5 min para quebrar as células e DNA genômico de liberação em solução.,
   2. Condições de PCR: A reação de PCR inclui 10 ml da solução de ressuspensão de células, 50 pmoles cada um dos primers frente e verso, 1 ml de 10 mM dNTPs, 1 unidade de Taq polimerase, 5 mL de tampão 10x e é ajustado com água estéril a um volume final de 50 l. O programa de PCR é de 3 min a 95 ° C, 30 ciclos de 30 s em 95 ° C, 30 s, a 55 ° C e 1 min a 72 ° C; um tempo de extensão final de 7 min a 72 ° C, em seguida, amostras são mantidos a 4 ° C. Uma extensão de tempo de 1 min / kb é assumida por esta reação.
   3. Após PCR, as amostras são executados em um gel de agarose 1% ou 2% (dependendo do tamanho esperado do produto da PCR) para a observação do produto da PCR (Figura 3).
4. Se a informação genética transferidos pelo oligo-RNA contendo um sítio de restrição gera novos na região-alvo do genoma de leveduras (Figura 1B), é possível verificar a correta transferência de informação através da digestão do produto da PCR com a enzima de restrição apropriada. Se nenhum sítio de restrição é gerada pelo oligo-RNA contendo, vá para a etapa 6. Produtos Digest PCR usando uma enzima de restrição específica. A reação de digestão inclui 6 mL de PCR produto, buffer, BSA (pode não ser necessário para algumas enzimas, ver instruções para a enzima usada), 0,5 l da enzima de restrição, e água estéril a 15 mL. As amostras são incubadas por 1 h na temperatura específica para a enzima utilizada.
5. Executar uma amostra não digerida juntamente com as amostras digeridas na mesma linha de um gel de agarose 2% aobservar a modificação genética transferidos pelo trato RNA do oligo-RNA que contém (Figura 3).
6. Purificar produtos de PCR usando um kit de purificação de PCR e prepará-los para o seqüenciamento de DNA. Enviar amostras para seqüenciamento com a mesma primers utilizados para amplificar o produto.
7. Analisar os resultados de seqüenciamento de DNA usando um software que permite o alinhamento de várias seqüências com uma seqüência de referência escolhido (Figura 4).

E. Tratamento Alkali do oligo-RNA contendo (Figura 5)

1. Para cada reação, adicionar 1 nmole (4 mL de 250 pmoles / solução estoque mL) do oligo-RNA que contenham ou DNA-oligo em um tubo de 1,5 ml.
2. Adicionar 4 mL de NaOH 1 M de hidrólise, ou, alternativamente, adicionar 4 mL H ₂ O como controle negativo, e incubar a 65 ° C em banho-maria por 1 h. Então mover-se do banho de água em gelo.
3. Neutralize com 2 mL de 1,2 M HCl, 4 mL de 1 ml M Tris-HCl, e 4 de H ₂ O, ou, alternativamente, 6 mL de H ₂ O e 4 mL de 1 M Tris-HCl para o controle negativo. Manter em gelo até a transformação.

Figura 1. Diagrama esquemático do gene defeituoso e trp5 do alelo TRP5 corrigido pelo oligo-RNA que contém. A) O gene mutante trp5 contém uma deleção 2-base (triângulos pretos) e 1-base mutação nonsense (asterisco). A única fita de RNA contendo oligo com 2 base de inserção (azul loop) e 1-RNA substituição de base (retângulo vermelho) gerando um Van91 Eu site da enzima de restrição (indicado por um suporte) é transformado em células de levedura para corrigir os defeitos genéticos do gene trp5. B) Após o gene TRP5 é reparado pela oligo-RNA contendo (bases corrigidas são indicados como retângulos azuis), o Van91 site que é gerado no gene TRP5. Um fragmento de 278 pb, incluindo apenas um sítio de restrição Van91 I em TRP5 gene é amplificado PCR por um par de primers (P1 e P2). O bp 177 e bp 101 fragmentos gerados após a digestão da P1 e P2 produto PCR por Van91 eu também são mostrados.

Figura 2. Resultado de transformação com o oligo-RNA que contém. A) As células de levedura transformada sem oligo não fazem qualquer colônia no meio SC-Trp, ver placas ab. B) Placas cg colônias de leveduras mostram que crescem em SC-Trp depois que as células são transformadas com um nmole do oligo-RNA que contém. C) Placas hl colônias de leveduras mostram que crescem em SC-Trp depois que as células são transformadas com um nmole do DNA somente correspondente oligo controle.

Figura 3. Detecção de transferência de informação genética do RNA contendo oligo de DNA cromossômico de leveduras por digestão de restrição do produto da PCR de amplificação da região genômica alvo. Eletroforese em gel de agarose 2% das amostras de PCR amplificados por P1 e P2 e digerido com enzima de restrição Van91 I. Raias 1, 8 e 15, escada de DNA com tamanhos de 100, 200, 300, 400 e 500 bp indicado à esquerda; pista 2, produto de PCR amplificado a partir de trp5 lócus do DNA genômico da cepa mutante trp5; pista 3, PCR produto amplificado do DNA genômico derivado de uma colônia + Trp alvo do DNA oligo-only; lane 4-7, produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico derivado de Trp + colônias alvo do oligo-RNA contendo; lane 9-14, Van91 eu digestão de restrição dos produtos de PCR de faixas 2-7. A presença do uncut bandas produto de PCR em pistas 10-14 pode ser explicado pela digestão parcial por Van91 eu no locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considerando que o local de corte para Van91 I (CCANNNN NTGG) pode ter várias seqüências, o site gerada em TRP5 pode não ser o alvo mais ideal para a enzima. De fato, o DNA seguinte seqüência de todos os produtos acima PCR não detectamos nenhuma alteração adicional além daquelas realizadas pela oligos (ver Figura 4). O 278 bp banda PCR amplificado por P1 e P2 primers e as bandas produto da digestão por Van91 I de 177 bp e 101 bp são mostrados pelas setas à direita.

Figura 4. Resultados de seqüenciamento de DNA mostrando correção gene pela RNA-oligo contendo. Electrofograma A DNA) da região genômica alvo do oligo-RNA que contém. O G na seqüência do DNA (azul caixa) deriva do rG na oligo-RNA que contém. Também em caixa é a inserção das bases CG. Resultados de sequenciamento de todos os outros produtos da PCR são também como clear como este, com sinais fluorescentes bem acima do fundo. B) Seqüências da região TRP5 do + Trp transformantes alvo do oligo DNA-only (T1) e os oligo RNA contendo (T2-T5) correspondem na seqüência consenso no topo e são comparados com o do trp5 células mutantes antes de segmentação pela oligos (DNA genômico, vermelho sombreado). A reparação RNA contendo oligo no fundo tem dois-base de inserção de DNA e uma base (G) RNA substituição marcados em vermelho. As regiões em caixa no azul com sombra amarela mostram que o RNA que contêm oligo, bem como os oligo DNA somente precisamente corrigido a mutação deleção e mutação nonsense em todas as amostras testadas. As linhas tracejadas marcar a posição da seqüência de RNA contendo oligo.

Figura 5. Tratamento alcalino impede a correção gene pela RNA-oligo contendo. A freqüência de transformação pelo oligo-RNA contendo (R) é mostrado na barra vermelha e que pelo DNA oligo-only (D) é mostrado nas barras azuis. As barras de erro representam o erro padrão da média para três transformações independentes para cada oligo. O DNA somente oligo exibe freqüência transformação semelhante sem e com tratamento NaOH. Diferentemente, a freqüência de transformação pela oligo-RNA contendo cai para 0 após o tratamento com NaOH. Portanto, a preparação, com o oligo-RNA contendo não está contaminado com DNA somente oligo, assim, a freqüência de transformação observada é específica para o oligo-RNA que contém.

O fato de que RNA pode transferir informações genéticas diretamente ao DNA genômico em células foi descoberto explorando o uso de RNA sintético contendo oligos (oligos Dharmacon sintetizado) ^1. Foi a prova do princípio de que as células podem usar RNA contendo moléculas de RNA ou somente seqüências como modelos para a síntese de DNA. O uso de RNA contendo oligos não só levou à demonstração de que a informação genética pode ser transferida diretamente de RNA para DNA genômico sem a necessidade de um reverso transcrito DNA cópia intermediária, mas também para a prova de que RNA pode ser usado como modelo no homólogo a reparação de um dano ao DNA ^1,3. Os oligos podem ser feitas de RNA-only ou conter apenas uma única ribonucleotídeo incorporado em uma seqüência de DNA, como no exemplo que apresentamos aqui. Os oligo-RNA tem um ribonucleotídeo que contém embutidos projetados para corrigir a mutação nonsense no genômica trp5 alelo defeituoso. A transferência de informação genética da ribonucleotídeo para o DNA genômico é revelado por uma mudança no fenótipo (células que crescem em meio falta de triptofano) das células-alvo. A freqüência de correção gene obtido com o oligo-RNA contendo é medido e comparado com a de um DNA-somente o controle oligo. Ao realizar este ensaio correção gene em fundos de células diferentes, onde mutar genes de levedura vários, podemos detectar qual o fator / s afectam especificamente dirigida pelo oligos RNA contendo. Assim, podemos revelar os mecanismos de como as células regulam a estabilidade de RNA / DNA híbridos. Simplesmente projetar diferentes variantes do oligos RNA contendo podemos determinar a probabilidade de um trato especial RNA para servir como modelo na modificação do ADN e podemos determinar a estabilidade de seqüências específicas de RNA incorporadas ao DNA. Além disso, podemos identificar quais são os preferidos em substratos vivo para fatores de interação com RNA / DNA híbridos.

Apesar de vários estudos in vitro, principalmente utilizando curtas de RNA contendo oligos, têm sido realizados para caracterizar a função de fatores que podem reconhecer RNA em um híbrido com o DNA, tais como as enzimas RNase H ^4, a vivo em funções de RNases H bem como a identidade de outras proteínas que podem afetar RNA / DNA estabilidade híbrido permanecem quase desconhecidas. A possibilidade de utilizar RNA contendo oligos de um período significativo (50 a 80-mers) e ótima qualidade (como oligos RNA contendo Thermo Scientific Dharmacon) tem aberto o caminho para examinar uma ampla variedade de processos moleculares in vivo diretamente na células de interesse. Como mostra este vídeo de transformação, usando RNA contendo oligos exige, essencialmente, apenas alguns passos adicionais em relação à transformação usando moléculas de DNA, para prevenir a degradação de RNases. Assim, a transformação usando RNA contendo oligos não é limitado ao sistema de levedura, mas pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou organismo onde a transformação pelo DNA oligos é proficiente.

Em conclusão, tendo como alvo as células de RNA contendo oligos fornece a oportunidade de gerar RNA / DNA híbridos e ribonucleotídeos embutido no DNA in vivo nas células. A estabilidade da função, e as conseqüências desses in vivo gerado RNA / DNA híbridos podem ser analisadas e caracterizadas, potencialmente descobrir mecanismos desconhecidos de reparo do DNA e revelando novas estratégias para o gene alvo.

Este trabalho foi apoiado pela Coligação Cancer Georgia conceder-R9028.