Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

Questo lavoro mostra come a formare un DNA / RNA ibrido a livello cromosomico e rivelare il trasferimento di informazioni genetiche da RNA a DNA genomico in cellule di lievito.

Polimeri sintetici breve acido nucleico, oligonucleotidi (oligo), sono gli strumenti più funzionali e diffusa della biologia molecolare. Oligo possono essere prodotti a contenere DNA o RNA desiderato sequenza e possono essere preparati per includere una vasta gamma di base e modifiche zucchero. Inoltre, oligo possono essere progettati per simulare specifiche alterazioni degli acidi nucleici e, quindi, possono servire come strumenti importanti per studiare gli effetti dei danni al DNA e meccanismi di riparazione. Abbiamo scoperto che Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi con una lunghezza compresa tra 50 e 80 nucleotidi può essere particolarmente adatto per studiare, in vivo, le funzioni e le conseguenze di RNA cromosomiche / ibridi DNA e di ribonucleotidi incorporati nel DNA. RNA / DNA ibridi può facilmente formare durante la replicazione del DNA, la riparazione e la trascrizione, tuttavia, molto poco si sa circa la stabilità del DNA / RNA ibridi nelle cellule e in che misura questi ibridi possono compromettere l'integrità genetica delle cellule. Oligo-RNA contenenti, quindi, rappresentare un vettore ideale per introdurre ribonucleotidi nel DNA cromosomico e generare ibridi RNA / DNA di lunghezza scelta e la composizione di base. Qui vi presentiamo il protocollo per l'incorporazione di ribonucleotidi nel genoma del lievito eucariote sistema modello / Saccharomyces cerevisiae /. Eppure, il nostro laboratorio ha utilizzato Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi per generare RNA / DNA ibridi a livello cromosomico in sistemi cellulari diversi, dai batteri alle cellule umane.

Fondamento logico

Sfruttando l'uso di Thermo Scientific Dharmacon oligos, da 50 a 80-mers, qui vi presentiamo una procedura, basata su un test di correzione gene, con la quale oligo possibile trasferire le informazioni genetiche del DNA genomico di cellule di lievito, a seguito di ricottura al DNA bersaglio cromosomico. Successo targeting per oligo è segnato dalla comparsa di colonie di lievito visualizzare il fenotipo atteso. Se la modifica desiderata genetica avviene in una o più ribonucleotidi incorporato nella sequenza oligo, l'informazione genetica fluisce direttamente dal tratto RNA al DNA cromosomico obiettivo, quindi, un RNA / DNA forme ibride, a livello dei cromosomi durante il processo di targeting. La ribonucleotide / s di un comitato scientifico Thermo Dharmacon RNA contenenti oligo può servire come modello per gene targeting mediante sintesi di riparazione del DNA o possono essere incorporati nel DNA e fungono da modello durante la replicazione del DNA. In questi esperimenti si usa il lievito / Saccharomyces cerevisiae / sistema modello eucariotico, tuttavia, un approccio simile può essere applicato anche in altri organismi o di tipi di cellule. In questo video, usiamo un Thermo Scientific Dharmacon oligo progettato con omologia di un locus genomico obiettivo lievito e contenente uno ribonucleotide nel mezzo per correggere una mutazione del gene bersaglio. Dopo la trasformazione con l'RNA contiene oligo, osserviamo la correzione del sito mirato ad una certa frequenza, che indica che il tratto di RNA di oligo potrebbero essere inserite nel DNA cromosomico e servire da modello per la sintesi del DNA durante la replicazione del DNA. L'informazione genetica effettuata all'interno del tratto RNA è stabilmente trasmesso alle generazioni seguenti cellulari. Qui sono descritte le fasi di trasformazione di lieviti dal comitato scientifico Thermo Dharmacon RNA contenenti oligo e l'approccio per rilevare il trasferimento di informazioni RNA in DNA cromosomico.

A. Progettazione del RNA contenenti oligo utilizzati in questo esperimento

Abbiamo progettato un RNA che contiene oligo per correggere un difetto genetico nel lievito S. Saccharomyces DNA cromosomico a livello del locus trp5. Il ceppo di lievito utilizzato nel protocollo contiene un gene mutante trp5 con due-base cancellazione e una mutazione nonsense (Figura 1A). Tale ceppo di lievito è un mutante auxotrophic triptofano e non formano colonie su supporti senza triptofano. La sequenza di DNA del gene TRP5 è disponibile presso il Genome Database cerevisiae (http://www.yeastgenome.org/). L'RNA contenenti Thermo Scientific Dharmacon oligo utilizzati in questo protocollo è un 65-mer con un 2-base di inserimento del DNA, progettata per correggere la mutazione cancellazione e uno ribonucleotide progettato per correggere la mutazione nonsense dell'allele trp5 (Figura 1A). La sequenza dei oligo è concepito come segue:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Questo oligo è sintetizzato da Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) a 200 nM scala, ed è dissalati, deprotetto e utilizzati senza purificazione PAGINA.

B. Preparazione del RNA contenenti Oligo per la trasformazione del lievito (modificato da Storici et al., 2007 ¹⁾

1. Pulire i materiali che verranno utilizzati per l'esperimento compresi i tubi oligo, pipette, vortice, rack, area sperimentale e guanti indossati dallo sperimentatore con la soluzione di decontaminazione da RNasi per rimuovere il potenziale contaminazione RNasi prima inizia tutto. Utilizzare acqua priva di RNasi, reagenti chimici, tubi e puntali in tutte le fasi. Ogni passo in questo esperimento dovrebbe essere RNasi-free.
2. Risospendere il Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligo ricevuto da parte della società a 250 pmoli / soluzione madre microlitri con RNase-free vortice d'acqua e vigorosamente per dissolvere il pellet. Conservare a -80 ° C.
3. Immediatamente prima della trasformazione, il disgelo RNA contenenti oligo su ghiaccio e diluire a 50 pmoli / mL con acqua RNase-free in RNasi-free tubi. Ogni trasformazione richiede 1 nmole del RNA contenenti oligonucleotidi.
4. Denaturare una quantità scelta del RNA contenenti oligonucleotidi sul 100 ° blocco di calore C per 2 minuti per eliminare le strutture secondarie di oligo.
5. Immediatamente dopo denaturazione posto il tubo sul ghiaccio. Tenere sul ghiaccio fino trasformazione.
6. Come controllo nell'esperimento un DNA sola corrispondente oligo viene utilizzato. Questo oligo è scongelato da -20 ° C e preparate per la trasformazione come l'RNA contenenti oligo, come descritto sopra.

C. Trasformazione di cellule di lievito con l'RNA contenenti Oligo

1. Inoculare 5 ml di liquido ricco YPD con il trp5 cellule di lievito mutanti e crescere a 30 ° C durante la notte (vedi Materiali).
2. Trasferire 1,5 ml della cultura durante la notte in 50 ml di YPD mezzo liquido.
3. Incubare cellule di 30 ° C shaker (225 rpm) per 4 ore.
4. Preparare Soluzione 1Soluzione 2 e immediatamente prima della trasformazione in RNasi-free tubi (vedi Materiali).
5. Trasferire la coltura cellulare ad una da 50 ml RNasi-free tubo e far girare a 3000 giri, corrispondenti a 1562 g, per 2 minuti. Il pellet della precipitazione cellula è di ca. 0,3 centimetri ^3.
6. Rimuovere le cellule surnatante e lavare con 50 ml di acqua RNase-free e far girare a 3000 rpm per 2 minuti.
7. Ripetere il passaggio 6 per 5 volte per sbarazzarsi del terreno di coltura e RNasi che potrebbero essere presenti nel terreno il più possibile.
8. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di soluzione 1 e far girare a 3000 rpm per 2 minuti.
9. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 250 microlitri di Soluzione 1. Questa quantità di cellule sufficiente per 7-8 trasformazioni.
10. Aliquota 50 ml di sospensione di cellule in RNasi-free microprovette, aggiungere 20 ml di RNA contenenti soluzione di oligo di lavoro (1 nmole), o 20 ml di DNA unica soluzione oligo di lavoro (1 nmole), o 20 ml di acqua sterile senza oligo per il controllo negativo. Poi aggiungere 300 ml di soluzione di 2 per ogni reazione di trasformazione. Non c'è bisogno di aggiungere DNA spermatico salmone nel processo di trasformazione, come l'atto oligo come vettore se stessi.
11. Energicamente per miscelare i componenti in maniera omogenea.
12. Incubare reazioni di trasformazione a 30 ° C per 30 minuti in uno shaker.
13. Shock termico a 42 ° C per 15 minuti.
14. Spin down celle a 5000 giri, corrispondenti a 2236 g, per 4 min.
15. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 100 ml di acqua sterile.
16. Prelevare un 'aliquota di questa sospensione cellulare e diluirlo con acqua sterile per 100.000 volte e cellule piastra su un piatto YPD con ca. 15 perle di vetro sterile e incubare a 30 ° C per 2 giorni.
17. Piastra di tutte le cellule risospese da ogni reazione trasformazione su una piastra di Petri di terreno completo sintetico solido senza triptofano (SC-Trp) con ca. 15 perle di vetro sterile e incubare a 30 ° C per 4-5 giorni (Figura 2).

D. Analisi della correzione genica del RNA contenenti Oligo

1. Contare il numero di colonie cresciute sul terreno selettivo (Figura 2) e sul medio YPD per calcolare la frequenza di correzione del gene per la RNA contenenti oligo, il DNA solo oligo e per il no-oligo di controllo. Confrontare il numero ottenuto. Tasso di regressione spontanea del trp5 alleli con i due-base cancellazione e la mutazione nonsense è inferiore a 09/10 nel ceppo di lievito utilizzato, quindi ci aspettiamo nessuna formazione di colonie sul terreno selettivo in assenza di oligonucleotidi vengono aggiunti alle cellule.
2. Streak eseguire diversi scelto a caso trasformante colonie su terreno YPD ricevere gli isolati singola colonia. Aspettare due giorni per la crescita colonia, poi prendere diverse (almeno 5) singole colonie e fare patch su YPD e sul terreno selettivo.
3. Progettare un paio di primer per amplificare la regione (250-1,000 bp) destinatari del RNA contenenti oligo da colonia PCR (Figura 1B). La procedura per la colonia PCR è la seguente (modificato da Storici e Resnick, 2006 ^2).
   1. Risospendere le cellule (circa 1 mm3) tratto dalla singole patch in 50 ml di acqua e aggiungere 1 unità di liticasi. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, seguita da incubazione in un blocco di calore a 100 ° C per 5 minuti per rompere le cellule e il DNA genomico rilascio in soluzione.
   2. Condizioni di PCR: La reazione di PCR comprende 10 microlitri della soluzione del risospensione delle cellule, 50 pmoli ciascuno dei primers forward e reverse, 1 ml di 10 mM dNTPs, 1 unità di Taq polimerasi, 5 ml di tampone 10x e viene regolata con acqua sterile ad una volume finale di 50 microlitri. Il programma di PCR è di 3 minuti a 95 ° C, 30 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 1 min a 72 ° C, un tempo l'estensione finale di 7 minuti a 72 ° C, poi i campioni sono tenute a 4 ° C. Un tempo l'estensione di 1 min / kb si assume per questa reazione.
   3. A seguito di PCR, campioni vengono analizzati su un gel 1% o 2% (a seconda della dimensione prevista del prodotto PCR) agarosio per l'osservazione del prodotto della PCR (Figura 3).
4. Se l'informazione genetica trasferito dal RNA contenenti oligo genera un nuovo sito di restrizione della regione bersaglio lievito genomica (Figura 1B), è possibile verificare il corretto trasferimento di informazioni da digerire il prodotto di PCR con l'enzima di restrizione appropriato. Se nessun sito di restrizione è generato dal RNA contenenti oligo, passare al punto 6. Digest prodotti PCR utilizzando uno specifico enzima di restrizione. La reazione di digestione comprende 6 ml di prodotto PCR, tampone, BSA (potrebbe non essere necessario per alcuni enzimi, vedere le istruzioni per l'enzima utilizzato), 0,5 l di enzima di restrizione, e l'acqua sterile a 15 microlitri. I campioni sono incubati per 1 ora a temperatura specifica per l'enzima utilizzato.
5. Eseguire un campione non digerito assieme ai campioni digeriti sulla stessa riga di un gel di agarosio al 2% perosservare la modificazione genetica trasferiti dal tratto RNA del RNA contenenti oligo (Figura 3).
6. Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR e prepararli per il sequenziamento del DNA. Sottoporre i campioni per il sequenziamento con il primer stesso utilizzato per amplificare il prodotto.
7. Analizzare i risultati sequenziamento del DNA utilizzando un software che permette l'allineamento di sequenze multiple con una sequenza di riferimento scelto (Figura 4).

E. Trattamento alcalini del RNA contenenti oligo (Figura 5)

1. Per ogni reazione, aggiungere 1 nmole (4 l di 250 pmoli / soluzione madre microlitri) di RNA contenenti oligo, o DNA-oligo in una provetta da 1,5 ml.
2. Aggiungere 4 ml di 1 M NaOH per idrolisi, o in alternativa aggiungere 4 microlitri H ₂ O come controllo negativo, e incubare a 65 ° C a bagnomaria per 1 ora Poi passare dal bagno d'acqua in ghiaccio.
3. Neutralizzare con 2 ml di HCl 1,2 M, 4 ml di 1 ml M Tris-HCl, e 4 di H ₂ O, o, in alternativa 6 ml di H ₂ O e 4 ml di 1 M Tris-HCl per il controllo negativo. Tenere sul ghiaccio fino trasformazione.

Figura 1. Rappresentazione schematica del gene difettoso trp5 e dell'allele TRP5 corretto dalla RNA contenenti oligo. A) Il trp5 gene mutante contiene un 2-base di cancellazione (triangoli neri) e 1-base di mutazioni nonsense (asterisco). Il singolo filamento di RNA contenenti oligo con 2-base di inserimento (anello blu) e 1-RNA sostituzione di base (rettangolo rosso), generando un Van91 ho sito enzima di restrizione (indicato da staffa) si trasforma in cellule di lievito per correggere i difetti genetici del gene trp5. B) Dopo il TRP5 gene è riparato dal RNA contenenti oligo (basi corrette sono indicate come rettangoli blu), il sito Van91 mi viene generato nel gene TRP5. Un frammento di 278 bp tra cui un solo sito di restrizione Van91 io in TRP5 PCR gene è amplificato da una coppia di primer (P1 e P2). Il 177 bp e 101 bp frammenti generati dopo la digestione del P1 e P2 prodotto di PCR da Van91 io sono mostrati.

Figura 2. Risultato della trasformazione con l'RNA contiene oligo. A) Le cellule di lievito trasformate senza oligo non fanno colonia sul SC-Trp media, vedi le tavole ab. B) Piastre cg colonie di lievito dimostrano crescente SC-Trp dopo che le cellule si trasformano con 1 nmole del RNA contenenti oligo. C) Piastre hl colonie di lievito dimostrano crescente SC-Trp dopo che le cellule si trasformano con 1 nmole del corrispondente DNA solo oligo di controllo.

Figura 3. Rilevazione di trasferimento delle informazioni genetiche dal RNA al DNA che contiene oligo lievito cromosomiche tramite digestione restrizione del prodotto della PCR amplificando la regione di destinazione genomica. Elettroforesi su gel 2% agarosio di campioni PCR amplificati da P1 e P2 e digerito con Van91 io enzima di restrizione. Corsie 1, 8 e 15, scala del DNA con dimensioni di 100, 200, 300, 400 e 500 bp indicata sulla sinistra, corsia 2, prodotto di PCR del locus trp5 amplificato dal DNA genomico del ceppo mutante trp5, corsia 3, PCR prodotto amplificato dal DNA genomico derivato da una colonia Trp + destinatari del DNA solo oligo; corsia 4-7, prodotti della PCR amplificati dal DNA genomico derivato da Trp + colonie destinatari del RNA contenenti oligo; corsia 9 a 14, Van91 ho la digestione di restrizione dei prodotti di PCR di corsie 2 a 7. La presenza del prodotto di PCR non tagliato bande nelle corsie 10-14 può essere spiegata dalla digestione parziale Van91 I al locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considerando che il sito di taglio per Van91 I (CCANNNN NTGG) può avere più sequenze, il sito ha generato in TRP5 non può essere l'obiettivo ottimale per l'enzima. Infatti, dopo il sequenziamento del DNA di tutti i prodotti sopra PCR si rileva alcun cambiamento supplementari rispetto a quelle svolte dal oligos (vedi figura 4). I 278 bp banda PCR amplificato da primer P1 e P2 e le bande digestione prodotto Van91 io di 177 bp e 101 bp sono indicati dalle frecce sulla destra.

Figura 4. Sequenziamento del DNA, i risultati mostrano correzione genica mediante RNA contenenti oligo. A) elettroferogramma DNA della regione genomica bersaglio l'RNA contenenti oligo. Il G nella sequenza del DNA (scatola blu) deriva dal rG sul RNA contenenti oligo. Anche in scatola è l'inserimento delle basi CG. Risultati di sequenziamento da tutti gli altri prodotti di PCR sono anche CLEar come questo, con segnali fluorescenti ben al di sopra lo sfondo. B) Le sequenze della regione TRP5 del + trasformanti Trp destinatari del DNA solo oligo (T1) e l'RNA contenenti oligo (T2-T5) corrispondenza nella sequenza consenso sulla parte superiore e sono confrontati con quello della trp5 cellule mutanti prima di targeting dal oligos (DNA genomico, colorata in rosso). La riparazione RNA contenenti oligo sul fondo ha due-base di inserimento del DNA e una base (G) sostituzione di RNA marcato in rosso. Le regioni in scatola blu con tonalità gialle mostrano che l'RNA contenenti oligo così come il DNA sola oligo proprio corretto la mutazione cancellazione e la mutazione nonsense in tutti i campioni testati. Le linee tratteggiate segnano la posizione del RNA contenenti sequenze oligo.

Figura 5. Trattamento alcalino impedisce di correzione genica mediante RNA contenenti oligo. La frequenza di trasformazione dal RNA contenenti oligo (R) viene mostrato nella barra rossa e che dal DNA oligo-only (D) viene mostrato nella barra blu. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media per 3 trasformazioni indipendenti per ogni oligo. Il DNA di solo oligo visualizza frequenza simile trasformazione senza e con trattamento di NaOH. Diversamente, la frequenza trasformazione dal RNA contenenti oligo scende a 0 dopo il trattamento con NaOH. Pertanto, la preparazione con l'RNA contiene oligo non è contaminato con DNA oligo-solo, quindi, la frequenza di trasformazione osservata è specifico per l'RNA contiene oligo.

Il fatto che l'RNA in grado di trasferire informazioni genetiche direttamente al DNA genomico è stato scoperto nelle cellule sfruttando l'uso di RNA sintetici contenenti oligonucleotidi (oligo Dharmacon sintetizzato) ^1. E 'stata la prova di principio che le cellule possono utilizzare contenenti molecole di RNA o RNA solo sequenze come modelli per la sintesi del DNA. L'uso di RNA contenenti oligonucleotidi non solo ha portato alla dimostrazione che le informazioni genetiche possono essere trasferiti direttamente da RNA a DNA genomico, senza la necessità di una trascrizione inversa di copie di DNA intermedio, ma anche per la prova che l'RNA può essere utilizzato come modello nella omologhi la riparazione di un danno al DNA ^1,3. L'oligo può essere fatto di RNA-only o contengono solo un singolo ribonucleotide incorporato in una sequenza di DNA, come nell'esempio che abbiamo presentato qui. L'RNA contenenti oligo ha un ribonucleotide incorporato progettato per correggere la mutazione nonsense nella genomica trp5 allele difettoso. Il trasferimento di informazioni genetiche dal ribonucleotide al DNA genomico è rivelato da un cambiamento nel fenotipo (cellule che crescono sulle medie manca triptofano) delle cellule bersaglio. La frequenza del gene correzione ottenuta con l'RNA contenenti oligo è misurata e confrontata con quella di un DNA controllo con solo oligo. Con il dosaggio di correzione genica in contesti differenti delle cellule, dove si mutano i geni del lievito diversi, siamo in grado di rilevare quale fattore / s influenzano specificatamente mira dalla RNA contenenti oligonucleotidi. Quindi, possiamo svelare i meccanismi come le cellule regolano la stabilità del DNA / RNA ibridi. Con la semplice progettazione di diverse varianti del RNA contenenti oligonucleotidi possiamo determinare la probabilità per un tratto particolare di RNA a servire come modello di modificazione del DNA e siamo in grado di determinare la stabilità di specifiche sequenze di RNA in DNA incorporato. Inoltre, siamo in grado di identificare quali sono i preferiti in substrati in vivo per i fattori che interagiscono con l'RNA / ibridi DNA.

Mentre diversi studi in vitro, utilizzando principalmente breve RNA contenenti oligonucleotidi, sono stati condotti per caratterizzare la funzione di fattori in grado di riconoscere l'RNA in un ibrido con il DNA, come ad esempio gli enzimi RNasi H ^4, le funzioni in vivo di RNasi H e come l'identità di altre proteine ​​che potrebbero influenzare DNA / RNA ibrido stabilità rimangono per lo più sconosciuti. La possibilità di utilizzare l'RNA contenenti oligonucleotidi di lunghezza significativa (50 a 80-mers) e di ottima qualità (come il Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi) ha aperto la strada ad esaminare una vasta gamma di processi molecolari direttamente in vivo nel cellule di interesse. Come mostrato in questa trasformazione video, utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi richiede essenzialmente a pochi passi ulteriori rispetto alla trasformazione utilizzando molecole di DNA, per impedirne la degradazione per RNasi. Così, la trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi non si limita al sistema di lievito, ma può essere applicato a qualsiasi organismo o tipo cellulare in cui la trasformazione dal DNA oligo è competente.

In conclusione, il targeting di cellule RNA contenenti oligonucleotidi offre la possibilità di generare ibridi RNA / DNA e ribonucleotidi incorporati nel DNA in vivo nelle cellule. La stabilità, la funzione e le conseguenze di queste generati in vivo di RNA / ibridi DNA può essere analizzato e caratterizzato, potenzialmente alla scoperta dei meccanismi di riparazione del DNA sconosciuto e rivelare nuove strategie per il gene targeting.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Cancer Coalition Georgia grant-R9028.