Method Article
هذا العمل يوضح كيفية تكوين الحمض النووي الريبي الهجين / الحمض النووي على مستوى الكروموسومات وتكشف عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي لالجيني في خلايا الخميرة.
البوليمرات الاصطناعية قصيرة الحمض النووي ، [أليغنوكليوتيد] (oligos) ، هي أكثر الأدوات الفنية وعلى نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئية. يمكن أن تنتج Oligos لاحتواء أي الحمض النووي الريبي أو التسلسل المطلوب ، ويمكن أن تكون على استعداد لتشمل طائفة واسعة من التعديلات الأساسية والسكر. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تكون مصممة لتقليد oligos محددة التعديلات الحمض النووي ، وبالتالي ، يمكن أن تكون بمثابة أدوات مهمة للتحقيق في آثار الحمض النووي من التلف وآليات الإصلاح. وجدنا أن الحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon oligos بطول يتراوح بين 50 و 80 النيوكليوتيدات يمكن مناسبة بشكل خاص للدراسة ، في الوظائف ، والمجراة ونتائج الحمض النووي الريبي الكروموسومات / الهجينة من الحمض النووي وribonucleotides المضمنة في الحمض النووي. يمكن RNA / DNA الهجينة شكل بسهولة خلال إصلاح الحمض النووي ، والنسخ والنسخ ، ومع ذلك ، فإن القليل جدا هو المعروف عن الاستقرار من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي في الخلايا الهجينة وإلى أي مدى يمكن أن تؤثر هذه الهجينة سلامة الوراثية للخلايا. المحتوية على الحمض النووي الريبي oligos ، وبالتالي ، تمثل ناقلات مثالية لإدخال الحمض النووي في الكروموزومات ribonucleotides وتوليد RNA / DNA الهجينة طول اختيار وتكوين قاعدة. هنا نقدم بروتوكول لدمج ribonucleotides في جينوم الخميرة نموذج النظام حقيقية النواة / السكيراء الجعوية /. حتى الآن ، استخدمت مختبرنا الحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon oligos لتوليد RNA / DNA الهجينة على مستوى الكروموسومات في الخلية أنظمة مختلفة ، من البكتيريا إلى الخلايا البشرية.
المنطق
الاستفادة من استخدام Dharmacon الحرارية oligos العلمية ، من 50 إلى 80 السائدة ، وهنا نقدم الداخلي ، على أساس الجينات مقايسة التصحيح ، التي oligos يمكن نقل المعلومات الوراثية إلى الحمض النووي الجيني للخلايا الخميرة ، وبعد الصلب على الحمض النووي المستهدف الكروموسومات. وأحرز نجاحا استهداف oligos بظهور مستعمرات الخميرة عرض النمط الظاهري هو متوقع. إذا نفذ التعديل المطلوب الجينية داخل واحد أو أكثر ribonucleotides تدرج في التسلسل بنسبة ضئيلة ، وتدفق المعلومات الجينية مباشرة من الجهاز على الحمض النووي الريبي الهدف الكروموسومات ، وبالتالي ، وأشكال RNA / DNA الهجين على مستوى الكروموسومات أثناء عملية الاستهداف. يمكن للريبونوكليوتيد / ثانية من العلم الحرارية بنسبة ضئيلة المحتوية على الحمض النووي الريبي Dharmacon بمثابة قالب لاستهداف الجينات عبر توليف إصلاح الحمض النووي أو يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في الحمض النووي ويكون بمثابة قالب خلال تكرار الحمض النووي. في هذه التجارب نستخدم الخميرة / السكيراء الجعوية / حقيقية النواة النظام النموذجي ، ولكن يمكن أيضا أن يطبق نهج مماثل في الكائنات الحية الأخرى أو أنواع الخلايا. في هذا الفيديو ، نستخدم العلم الحرارية بنسبة ضئيلة Dharmacon مصممة مع التماثل الجيني لمكان الهدف والخميرة تحتوي على واحد في منتصف ريبونوكليوتيد لتصحيح طفرة في الجين المستهدف. بعد التحول بنسبة ضئيلة مع المحتوية على الحمض النووي الريبي ، نلاحظ تصحيح الموقع المستهدف على تردد معين ، مما يدل على أن من الممكن إدراج المسالك RNA بنسبة ضئيلة من الحمض النووي في الكروموزومات وتكون بمثابة قالب لتخليق الحمض النووي DNA أثناء النسخ المتماثل. تبث ستابلي المعلومات الجينية نفذت داخل المسالك الحمض النووي الريبي للأجيال التالية الخلية. هنا نحن تصف الخطوات للتحول خلية الخميرة من العلم الحرارية بنسبة ضئيلة المحتوية على الحمض النووي الريبي Dharmacon والنهج للكشف عن المعلومات في الحمض النووي الريبي نقل الكروموسومات.
أ. تصميم للأليغو المحتوية على الحمض النووي الريبي المستخدمة في هذه التجربة
وقد صممت لدينا خبير بنسبة ضئيلة المحتوية على الحمض النووي الريبي لتصحيح الخلل الجيني في الخميرة س. الحمض النووي الصبغي الجعوية في مكان الجريمة trp5. سلالة الخميرة المستخدمة في بروتوكول يحتوي على الجينات الطافرة trp5 مع حذف اثنين قاعدة واحدة الطفرة هراء (الشكل 1A). هذه السلالة هي الخميرة متحولة عونية التغذي التربتوفان ولا شكل مستعمرات على وسائل الإعلام دون التربتوفان. تسلسل الحمض النووي للجينات TRP5 يتوفر في قاعدة بيانات الجينوم السكيراء (http://www.yeastgenome.org/). والحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon بنسبة ضئيلة المستخدمة في هذا البروتوكول هو 65 ميه مع الإدراج الحمض النووي 2 - القاعدة ، تهدف إلى تصحيح طفرة الحذف واحد ريبونوكليوتيد مصممة لتصحيح طفرة هراء من أليل trp5 (الشكل 1A). صمم تسلسل بنسبة ضئيلة على النحو التالي :
5' - AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG - CG - GATCCCACATTCTG - RG - GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. ويتم تصنيع هذه جزئية من قبل الحرارية العلمية Dharmacon (لافاييت ، أول أكسيد الكربون) على نطاق واسع نانومتر 200 ، وغير المحلاة ، واستخدامها دون deprotected تنقية PAGE.
باء إعداد أليغو المحتوية على الحمض النووي الريبي لتحويل الخميرة (معدلة من Storici وآخرون ، 2007 1)
جيم تحويل خلايا الخميرة باستخدام الحمض النووي الريبي أليغو المحتوية
دال تحليل تصحيح الجينات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي أليغو
هاء قلوي معالجة جزئية للالمحتوية على الحمض النووي الريبي (الشكل 5)
الشكل 1. الرسم التخطيطي للجينات معيبة trp5 والأليل TRP5 تصحيح بنسبة ضئيلة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ألف) والجين الطافر trp5 يحتوي على قاعدة الحذف 2 (مثلثات سوداء) و 1 قاعدة هراء الطفرة (النجمة). وحيد الجديلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي تتحول بنسبة ضئيلة مع 2 قاعدة الإدراج (الأزرق حلقة) و 1 - RNA استبدال قاعدة (أحمر المستطيل) توليد Van91 انزيم التقييد أنا الموقع (الذي أبداه قوس) في خلايا الخميرة لتصحيح عيوب وراثية من الجين trp5. ب) بعد إصلاح الجينات TRP5 بنسبة ضئيلة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على (يشار إلى قواعد المصوبة المستطيلات الأزرق) ، يتم إنشاء موقع الأول في Van91 TRP5 الجينات. 278 ألف سنة مضت بما في ذلك جزء واحد فقط Van91 أنا التقييد في موقع TRP5 الجين هو تضخيم PCR بواسطة زوج من الاشعال (P1 و P2). غليان في 177 و 101 سنة مضت شظايا ولدت بعد هضم P1 و P2 منتج PCR بواسطة Van91 تظهر لي أيضا.
الشكل 2. نتيجة التحول بنسبة ضئيلة مع المحتوية على الحمض النووي الريبي. A) خلايا الخميرة تحول دون أي بنسبة ضئيلة لا تشكل أي مستعمرة على المتوسط SC - التربتوفان ، انظر لوحات من أساسها. ب) يتم تحويلها لوحات تظهر مستعمرات الخميرة CG المتزايد على SC - التربتوفان بعد الخلايا مع 1 nmole بنسبة ضئيلة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على. ج) يتم تحويلها لوحات تظهر مستعمرات الخميرة HL - SC المتزايد على التربتوفان بعد الخلايا مع 1 nmole من الحمض النووي فقط المناظرة بنسبة ضئيلة السيطرة.
الشكل 3. الكشف عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على الحمض النووي بنسبة ضئيلة الخميرة الكروموسومات التي الهضم تقييد للمنتج PCR تضخيم المنطقة المستهدفة الجينومية 2 ٪ هلام إستشراد agarose عينات تضخيم PCR بواسطة P1 و P2 ويتفاعل مع انزيم Van91 القيد الأول. وأشار الممرات 1 و 8 و 15 ، وسلم الحمض النووي مع أحجام 100 ، 200 ، 300 ، 400 و 500 سنة مضت على اليسار ، 2 لين ، PCR نتاج trp5 موضع تضخيمها من الحمض النووي الجيني لسلالة طافرة trp5 ؛ حارة 3 ، PCR المنتج تضخيمها من الحمض النووي الجينومي المستمدة من مستعمرة + التربتوفان التي يستهدفها بنسبة ضئيلة الحمض النووي فقط ؛ حارة 4-7 ، والمنتجات PCR تضخيمها من الحمض النووي الجينومي المستمدة من مستعمرات + التربتوفان التي يستهدفها بنسبة ضئيلة المحتوية على الحمض النووي الريبي ؛ حارة 9 إلى 14 ، أنا Van91 الهضم تقييد المنتجات PCR من الممرات 2-7. ويمكن تفسير وجود عصابات غير المصقول منتج PCR في الممرات 10-14 قبل الهضم الجزئي Van91 أنا في مكان الجريمة TRP5 (CCACATTCTGG). معتبرا ان موقع القطع لأني Van91 (CCANNNN NTGG) يمكن أن يكون تسلسل متعددة ، قد ولدت في موقع TRP5 لا يكون الهدف الأمثل لهذا الأنزيم. في الواقع ، بعد تسلسل الحمض النووي كل المنتجات المذكورة أعلاه PCR اكتشفنا أي تغييرات إضافية غير تلك التي يحملها oligos (انظر الشكل 4). الفرقة 278 PCR الغليان التي تضخمت P1 و P2 الاشعال ونطاقات المنتج الهضم بواسطة Van91 ترد الأول من غليان 177 و 101 سنة مضت بواسطة الأسهم على اليمين.
الشكل 4. نتائج الحمض النووي تظهر التسلسل الجيني لتصحيح جزئية تحتوي على الحمض النووي الريبي. مخطط رحلاني A DNA) في المنطقة التي يستهدفها الجينومية بنسبة ضئيلة المحتوية على الحمض النووي الريبي. مجموعة في تسلسل الحمض النووي (الأزرق محاصر) مستمد من النمو الحقيقي على جزئية تحتوي على الحمض النووي الريبي. كما هو محاصر من قواعد الإدراج CG. تسلسل النتائج من جميع المنتجات PCR الأخرى هي أيضا واضحة مثل هذه واحدة ، مع إشارات الفلورسنت أعلى بكثير من الخلفية. ب) تسلسل المنطقة TRP5 من transfo + التربتوفانتتم مقارنة rmants المستهدفة بنسبة ضئيلة من الحمض النووي فقط (T1) والتي تحتوي على الحمض النووي الريبي بنسبة ضئيلة (T2 - T5) تطابق في الآراء بشأن تسلسل أعلى ومع ان من الخلايا الطافرة trp5 قبل استهداف oligos (DNA الجينوم ، أحمر مظللة). إصلاح الحمض النووي الريبي التي تحتوي على الجزء السفلي بنسبة ضئيلة اثنين من قاعدة الإدراج الحمض النووي واحد قاعدة (G) RNA استبدال باللون الأحمر. في المناطق محاصر في الظل الأزرق مع الأصفر تظهر أن الحمض النووي الريبي التي تحتوي على جزئية وكذلك الحمض النووي بنسبة ضئيلة فقط تصحيح بدقة الطفرة الحذف والتغيير هراء في جميع العينات التي تم اختبارها. خطوط متقطع علامة موقف تسلسل الحمض النووي الريبي المحتوية بنسبة ضئيلة. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.
الشكل 5. القلوي علاج يمنع تصحيح الجين بنسبة ضئيلة من الحمض النووي الريبي المحتوية. يظهر التردد التحول بنسبة ضئيلة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على (R) في شريط أحمر ، وأنه بحلول جزئية فقط الحمض النووي (د) يظهر في أشرطة زرقاء. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط لمدة 3 التحولات مستقلة لكل جزئية. الحمض النووي فقط بنسبة ضئيلة يعرض مشابهة تحول دون تردد ، وهيدروكسيد الصوديوم مع العلاج. بشكل مختلف ، والتردد التحول بنسبة ضئيلة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على قطرات إلى 0 بعد العلاج مع هيدروكسيد الصوديوم. ولذلك ، لا يتم إعداد الملوثة بنسبة ضئيلة مع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على الحمض النووي مع بنسبة ضئيلة من فقط ، وبالتالي ، فإن وتيرة التحول وحظ تقتصر على جزئية تحتوي على الحمض النووي الريبي.
تم اكتشاف حقيقة أن الحمض النووي الريبي يمكن نقل المعلومات الوراثية DNA الجينومية مباشرة إلى الخلايا في الاستفادة من استخدام الحمض النووي الريبي oligos المحتوية الاصطناعية (oligos Dharmacon توليفها) 1. وكان هذا دليل على مبدأ أن الخلايا يمكن استخدامها التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي الريبي أو تسلسل الحمض النووي الريبي فقط كقوالب لتخليق الحمض النووي. استخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos لم يؤد فقط إلى المظاهرة التي يمكن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي لمباشرة الحمض النووي الجيني دون الحاجة لعكس كتب الحمض النووي نسخة وسيطة ، ولكن أيضا لإثبات أنه يمكن استخدام RNA كقالب مثلي في إصلاح الحمض النووي من التلف من 1،3. يمكن جعل oligos من الحمض النووي الريبي فقط أو تحتوي على مجرد ريبونوكليوتيد احد مضمن في تسلسل الحمض النووي ، كما في المثال قدمنا هنا. والمحتوية على الحمض النووي الريبي بنسبة ضئيلة واحد ريبونوكليوتيد جزءا لا يتجزأ من تصميم لتصحيح طفرة هراء في أليل trp5 معيبة الجيني. وكشفت عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي لريبونوكليوتيد الجينومية عن تغيير في النمط الظاهري (الخلية تنمو على المدى المتوسط تفتقر التربتوفان) من الخلايا المستهدفة. ويقاس تردد تصحيح الجينات التي تم الحصول عليها مع جزئية تحتوي على الحمض النووي الريبي ، وذلك بالمقارنة مع من الحمض النووي فقط السيطرة بنسبة ضئيلة. قبل تنفيذ هذا الاختبار تصحيح الجينات في الخلية خلفيات مختلفة ، حيث أننا تحور جينات الخميرة مختلفة ، يمكننا الكشف عن أي عامل / ثانية تؤثر على وجه التحديد استهداف oligos المحتوية على الحمض النووي الريبي. وبالتالي ، لا يمكننا الكشف عن آليات كيفية خلايا تنظيم استقرار RNA / DNA الهجينة. ببساطة عن طريق تصميم أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي oligos المحتوية يمكننا تحديد احتمال لالمسالك RNA خاص ليكون بمثابة القالب في تعديل الحمض النووي ويمكننا تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي استقرار محددة المضمنة في الحمض النووي. وعلاوة على ذلك ، يمكننا تحديد ما هي المفضلة في الجسم الحي لعوامل ركائز التفاعل مع الحمض النووي الريبي / الهجينة الحمض النووي.
في حين أجريت دراسات عدة في المختبر ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي أساسا قصيرة تحتوي على oligos ، لتوصيف وظيفة من العوامل التي يمكن التعرف على الحمض النووي الريبي في مختلطة مع الحمض النووي ، مثل الانزيمات H ريبونوكلياز 4 ، في وظائف الجسم الحي من H فضلا RNases كهوية من البروتينات الأخرى التي يمكن أن تؤثر على الحمض النووي الريبي / DNA الاستقرار الهجينة لا تزال مجهولة في معظمها. إمكانية الاستفادة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos بطول كبيرة (50 إلى 80 السائدة) وجودة أفضل (مثل الحمض النووي الريبي oligos المحتوية الحرارية العلمية Dharmacon) قد يفتح الطريق لدراسة طائفة واسعة من العمليات الجزيئية مباشرة في الجسم الحي في خلايا الفائدة. كما هو مبين في هذا التحول ، والفيديو باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos يتطلب أساسا سوى بضع خطوات إضافية بالمقارنة مع التحول باستخدام جزيئات الحمض النووي ، لمنع تدهور بواسطة RNases. وبالتالي ، يمكن تطبيق التحويل باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos لا يقتصر على نظام الخميرة ، ولكن إلى أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي حيث تحول بواسطة الحمض النووي oligos متمكنا.
في الختام ، واستهداف الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي oligos يتيح الفرصة لتوليد RNA / DNA الهجينة وribonucleotides المضمنة في الحمض النووي في الجسم الحي في الخلايا. الاستقرار والوظيفة وعواقب هذه في الجسم الحي ولدت رنا / يمكن تحليل الحمض النووي الهجينة ، وتميزت ، من المحتمل الكشف عن آليات غير معروف من إصلاح الحمض النووي والكشف عن استراتيجيات جديدة لاستهداف الجينات.
وأيد هذا العمل من جانب التحالف لمكافحة السرطان جورجيا المنح R9028.
ألف الكواشف وتحويل وسائل الإعلام (وتعديلها من Storici ريسنيك ، 2006
باء مستعمرة مواد PCR.
جيم تنقية PCR.
دال جل الكهربائي.
هاء تقييد عملية الهضم.
F. معالجة جزئية للقلوي المحتوية على الحمض النووي الريبي.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved