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Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).
Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro
Parte 1: Dissecção e isolamento de células Bipolar
Parte 2: Bipolar Carregando Celular e Wash Out
TIRF imagens das vesículas sinápticas é melhor realizado através de um microscópio TIRFM objetivo do tipo com um objetivo NA muito alta e uma câmera sensível. Para nossos experimentos, optamos por usar um 1,65 NA objetivo (x100 Apo O HR, NA 1,65, Olympus, Japão) com um EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). O uso do objectivo NA muito elevado exige a utilização de lamínulas de vidro de alta refração e fluido de imersão (di iodometano com enxofre). Nas nossas condições, luz de excitação está limitado a um campo de decaimento exponencial com um comprimento constante de aproximadamente 50 nm.
Parte 3: Patch de fixação e TIRFM Imagem
Figura 1: A configuração experimental. Um laser de 488 nm (azul) é voltado para a periferia do plano focal posterior da objetiva e sofre reflexão interna total quando ele atinge o vidro aquoso interface de médio porte. O campo eletromagnético gerado pelo feixe refletido excita o fluoróforo carregado no vesículas sinápticas mais próximo do bottom da câmara de vidro, que então fluorescência (verde). A luz fluorescente é então guiado ao olho do observador (representado) ou a uma câmera CCD. O potencial de membrana das células imaged é controlado simultaneamente por patch-aperto-los. Esta abordagem permite o estudo da relação entre os sinais de entrada (a tensão de membrana) ea saída neuronal (exocitose).
Figura 2: Resultados típicos. Esquerda: Imagem de campo claro de uma célula isolada goldfish bipolar. Superior direito: image TIRF das vesículas sinápticas no terminal axonal célula bipolar carregado com FM 1-43 ® e fotografada com o laser de 488 nm (FM corante). Parte inferior direita: imagem do terminal mesmo depois remendar o celular e as imagens do terminal axonal com o laser nm 561. Fitas sinápticas são rotulados pela rodamina baseado em peptídeo de ligação de olho de lombo (Rpep_rhod).
Tabela 1: Reagentes e equipamentos específicos.
Nome | Tipo | Fabricante | Catálogo | Comentário |
- | Air Tabela | Newport Corporation | - | - |
IX70 | Microscópio invertido | Olimpo | - | Equipado com uma lâmpada de tungstênio para campo claro e uma porta de abertura lateral para TIRF |
TH4-100 | Fonte de energia da lâmpada | Olimpo | - | - |
FF498_581-DI01 | Dichroic Filtro | Semrock | - | - |
NF01-405_488_568 | Filtro de emissão | Semrock | - | - |
X100 Apo O HR | Objetivo | Olimpo | - | NA 1,65 |
RG630 | Red Filtro de Vidro | Schott | - | - |
- | Laser 488 nm | Coerente | - | Use o mínimo de energia |
- | Obturador | Uniblitz | - | - |
VMM-D1 | Driver de obturador | Uniblitz | - | - |
- | Laser 561 nm | Melles Griot | - | - |
- | Obturador | Uniblitz | - | - |
VMM-D3 | Driver de obturador | Uniblitz | - | - |
Kit de pressão de perfusão | Sistema superfusão | Automatizar Scientific | 04/09 | - |
Pen perfusão | Sistema superfusão | Automatizar Scientific | - | - |
ValveLink 8 | Controlador do Sistema superfusão | Automatizar Scientific | - | - |
Cascade 512B | EM CCD Camera | Roper Scientific | - | - |
Metamorph 7,1 | Software de imagem | Os dispositivos moleculares | - | - |
EPC-9 | Amplificador de patch clamp | Heka Elektronik | - | - |
Pulso | Software amplificador | Heka Elektronik | - | - |
MP-285 | Micromanipulador | Instrumento Sutter | - | - |
- | Titular eletrodo | Heka Elektronik | - | Por 1,5 mm de diâmetro externo de vidro, 2 unidades |
Kwik-Fil ® TW150-3 | Capilar de vidro de borosilicato | WPI | - | Sem filamento |
B150-86-10 | Capilar de vidro de borosilicato | Instrumento Sutter | - | Com filamento |
P-97 | Puller microeletrodo | Instrumento Sutter | - | Equipado com filamento caixa 3x3 e câmara ambiental |
- | Pressão da bomba de ar de vácuo | Thomas Scientific | 7893B05 | Cria vácuo para remover líquidos de câmara e sobrepressão para pipetas |
MatLab R2008a | Software de análise | MathWorks | - | - |
353001 | 35 milímetros de plástico Pratos Cultura | Falcão | - | - |
- | Vidro alto índice de refração | PlanOptik | - | Índice de refração 488 nm = 1,78 |
Série M | Líquido de elevado índice de refração | Cargille Labs | - | Índice de refração = 1,78 |
Sylgard 184 | Kit de silicone elastômero | Dow Corning | - | - |
Glutationa | Tripeptídeo | Merck Química | Radica livrescavenger l | |
Hialuronidase | Enzima | Sigma | H6254 | Tipo V |
L-cisteína | Aminoácidos | Fluka | 30090 | Ativa papaína |
Papaína | Enzima | Fluka | 76220 | De Carica papaya |
Trolox ® | Vitamina E solúvel | Sigma | 56510 | Scavenger de radicais livres |
ADVASEP-7 | Sulfonado B-Ciclodextrina Derivativos | Sigma | A3723 | Reduz FM 1-43 ® fluorescência de fundo |
FM 1-43 ® | Corante fluorescente | Invitrogen | T35356 | "Embalagem Especial" |
Cera pegajosa | Pipeta agente de revestimento | Kerr Corporação | - | Diminui a capacitância pipeta |
Tabela 2: soluções fisiológicas utilizadas neste estudo.
Substância | Ca 2 + baixo Ringer | Controle de Ringer | Alto K + Ringer | Solução interna |
NaCl | 120 mM | 120 mM | 97,5 mM | - |
KCl | 2,5 mM | 2,5 mM | 25 mM | - |
MgCl 2 | 1 mM | 1 mM | 1 mM | 4 mM |
CaCl 2 | 0,5 mM | 2,5 mM | 2,5 mM | - |
HEPES | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
EGTA | 0,75 mM | - | - | 0,5 mM |
Glicose | 10 mM | 10 mM | - | - |
Glutationa | 2 mM | 2 mM | - | 1 mM |
* CH 3 CSO 3 S | - | - | - | 100 mM |
TEACl | - | - | - | 10 mM |
ATP-Mg | - | - | - | 10 mM |
GTP-Li | - | - | - | 1 mM |
Rpep-Rhod ** | - | - | - | 5 mM |
Volume | 200 mL | 100 mL | 5 mL | 100 L |
* Metanossulfonato Césio.
** Peptídeo de olho de lombo de ligação: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).
As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica 1,5.
A principal desvantagem da técnica é que ela está limitada a eventos imagem acontecendo dentro de 100 nm e da superfície celular, que é aproximadamente equivalente a uma seção ultrafina em microscopia eletrônica. Portanto, a visualização destes eventos depende criticamente sobre as células sendo firmemente aderido ao vidro, na presença de fitas sinápticas perto do remendo da membrana aderida ao vidro e sobre o carregamento de sucesso de vesículas. Nosso protocolo permite o carregamento de apenas 1-2% do número total de vesículas dentro da célula terminal bipolar sináptica 2,6. Com isso dito, é claro que existem muito mais eventos acontecendo na superfície da célula do que os que são capazes de imagem.
Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant EY 14.990.
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