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En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.
Total de reflexión interna de fluorescencia (TIRF) microscopía es una técnica que permite el estudio de los acontecimientos que suceden en la membrana celular, por la imagen selectiva de moléculas fluorescentes que están más cerca de una sustancia alto índice de refracción, como el vidrio
Parte 1: La disección y aislamiento de células bipolares
Parte 2: Carga de la célula bipolar y lavar
TIRF imágenes de las vesículas sinápticas se realiza mejor con un microscopio TIRFM objetivo de tipo con un objetivo muy alto NA y una cámara sensible. Para nuestros experimentos, hemos optado por utilizar un 1.65 NA objetivo (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japón) con un EMCCD (Cascade 512B, la Ciencia Roper, Tucson, AZ). El uso de la NA objetivo muy alto hace necesario el uso de alta refracción cubreobjetos de vidrio y el líquido de inmersión (di-yodometano con azufre). Bajo nuestras condiciones, la luz de excitación se limita a un campo decae de manera exponencial, con una longitud constante de aproximadamente 50 nm.
Parte 3: Revisión de sujeción e Imagen TIRFM
Figura 1: El montaje del experimento. A 488 nm láser (azul) se centra en la periferia del plano focal posterior del objetivo y sufre una reflexión interna total cuando se llega a la copa-acuosa interfaz de mediano plazo. El campo electromagnético generado por el rayo reflejado excita al fluoróforo carga en las vesículas sinápticas más cercano a la bottom de la cámara de vidrio, que luego fluorescente (verde). La luz fluorescente se guía a los ojos del observador (representados) o una cámara CCD. El potencial de membrana de las células de imágenes se controla de forma simultánea por ellos de patch-clamp. Este enfoque permite el estudio de la relación entre las señales de entrada (el voltaje de la membrana) y la salida neuronal (exocitosis).
Figura 2: Los resultados típicos. Izquierda: imagen de campo claro de una célula de peces de colores bipolar aislado. Arriba a la derecha: imagen TIRF de las vesículas sinápticas en el terminal del axón bipolar celular cargado con FM 1-43 ® y la imagen con el láser de 488 nm (FM tinte). Abajo a la derecha: imagen de la misma terminal después de un parche en el celular y la imagen de la terminal del axón con el láser de 561 nm. Cintas sinápticas son etiquetados por la rodamina basado RIBEYE de unión de péptidos (Rpep_rhod).
Tabla 1: Reactivos y equipos específicos.
Nombre | Tipo | Fabricante | Catálogo | Comentario |
- | Tabla de aire | Newport Corporation | - | - |
IX70 | Microscopio invertido | Olimpo | - | Equipado con una lámpara de tungsteno para campo claro y un puerto de apertura lateral para TIRF |
TH4-100 | Fuente de alimentación de la lámpara | Olimpo | - | - |
FF498_581-DI01 | Filtro dicroico | Semrock | - | - |
NF01-405_488_568 | Filtro de emisiones | Semrock | - | - |
Apo x100 O HR | Objetivo | Olimpo | - | NA 1,65 |
RG630 | Red de filtro de vidrio | Schott | - | - |
- | 488 nm láser | Coherente | - | Utilice la potencia mínima |
- | Obturador | Uniblitz | - | - |
VMM-D1 | Conductor del obturador | Uniblitz | - | - |
- | 561 nm láser | Melles Griot | - | - |
- | Obturador | Uniblitz | - | - |
VMM-D3 | Conductor del obturador | Uniblitz | - | - |
Kit de presión de perfusión | Superfusión sistema | Automatizar la Ciencia | 09-04 | - |
Perfusión de la pluma | Superfusión sistema | Automatizar la Ciencia | - | - |
ValveLink 8 | Superfusión controlador del sistema | Automatizar la Ciencia | - | - |
Cascada 512B | EM cámara CCD | Roper Científico | - | - |
Metamorph 7.1 | Software de imágenes | Molecular Devices | - | - |
EPC-9 | Parche amplificador Clamp | HEKA Elektronik | - | - |
Pulso | Amplificador de Software | HEKA Elektronik | - | - |
MP-285 | Micromanipulador | Sutter Instrumento | - | - |
- | Portaelectrodos | HEKA Elektronik | - | De 1,5 mm de diámetro exterior de vidrio, 2 unidades |
Kwik-Fil ® TW150-3 | Capilar de vidrio de borosilicato | WPI | - | Sin filamento |
B150-86-10 | Capilar de vidrio de borosilicato | Sutter Instrumento | - | Con filamento |
P-97 | Microelectrodo Extractor | Sutter Instrumento | - | Equipado con caja de 3x3 y filamento cámara ambiental |
- | Vacío presión del aire de la bomba | Thomas Scientific | 7893B05 | Crea un vacío para extraer líquidos de la cámara y el exceso de presión para pipetas |
MatLab R2008a | Análisis de Software | The MathWorks | - | - |
353001 | Placas de 35 mm de Cultura de plástico | Halcón | - | - |
- | De vidrio de alta refracción Índice | PlanOptik | - | Índice de refracción 488 nm = 1,78 |
Serie M | Refracción de líquidos de alta Índice | Cargille Laboratorios | - | Índice de refracción = 1,78 |
Sylgard 184 | Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | - | - |
Glutatión | Tripéptido | EMD Chemicals | Libre radical tesoro | |
Hialuronidasa | Enzima | Sigma | H6254 | Tipo V |
L-cisteína | Aminoácido | Fluka | 30090 | Activa la papaína |
Papaína | Enzima | Fluka | 76220 | De Carica papaya |
Trolox ® | Solubles de vitamina E | Sigma | 56510 | Depurador de radicales libres |
ADVASEP-7 | Sulfonados B-ciclodextrina | Sigma | A3723 | Reduce el FM 1-43 ® fluorescencia de fondo |
FM 1-43 ® | Colorante fluorescente | Invitrogen | T35356 | "Embalaje especial" |
Cera pegajosa | Pipeta agente de recubrimiento | Kerr Corporation | - | Disminuye la capacidad de pipeta |
Tabla 2: Soluciones fisiológicas utilizadas en este estudio.
Sustancia | Bajo Ca 2 + de Ringer | Control del timbre de | Alto contenido de K + de Ringer | Solución interna |
NaCl | 120 mM | 120 mM | 97,5 mM | - |
KCl | 2,5 mM | 2,5 mM | 25 mM | - |
MgCl2 | 1 mM | 1 mM | 1 mM | 4 mM |
CaCl2 | 0,5 mM | 2,5 mM | 2,5 mM | - |
HEPES | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
EGTA | 0,75 mM | - | - | 0,5 mM |
Glucosa | 10 mM | 10 mM | - | - |
Glutatión | 2 mM | 2 mM | - | 1 mM |
* CH 3 CsO 3 S | - | - | - | 100 mM |
TEACl | - | - | - | 10 mM |
ATP-Mg | - | - | - | 10 mM |
GTP-Li | - | - | - | 1 mM |
Rpep Rhod-** | - | - | - | 5 mM |
Volumen | 200 ml | 100 ml | 5 l | 100 L |
* Metanosulfonato de cesio.
** RIBEYE de unión a péptido: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).
Las ventajas de los objetivos de tipo de microscopía TIRF son: 1) que proporciona seccionamiento óptico excelente mediante la restricción de la luz de excitación a una región estrecha en el plano focal del objetivo, minimizando de esta manera fuera del foco de luz, 2) ya que la luz disminuye exponencialmente con la distancia , el movimiento en sentido vertical se puede controlar con un cambio en la intensidad de la fluorescencia, 3) la colección de bajo consumo a través del objetivo de gran apertura numérica de 1,5.
El principal inconveniente de esta técnica es que se limita a los eventos de imágenes pasando a 100 nm y de la superficie celular, lo que equivale aproximadamente a una sección ultrafina de microscopía electrónica. Por lo tanto, la visualización de estos eventos depende fundamentalmente de las células estar firmemente adheridas al vidrio, con la presencia de cintas sinápticas cerca del parche de membrana adherida al vidrio y en la carga de éxito de las vesículas. El protocolo permite la carga de sólo el 1-2% del número total de vesículas dentro de la terminal sináptica 2,6 célula bipolar. Con esto dicho, es claro que hay mucho más sucediendo los acontecimientos en la superficie celular que los que son capaces de imagen.
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención EY 14990.
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