Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Nosso projeto identificou GFP rotulados estruturas glial no desenvolvimento larval sinapse neuromuscular voar. Olhar para o desenvolvimento de viver glial-nervo-músculo sinapses, desenvolvemos uma preparação do tecido larval que tinham características de larvas intactas ao vivo, mas também teve boas propriedades ópticas. Esta nova preparação também permitiu o acesso de perfusato para a sinapse. Usamos larvas de moscas, imersa-los em hemolinfa artificial, e relaxaram seus normais contrações rítmicas do corpo de arrefecimento-los. Em seguida, dissecados fora os segmentos posterior de cada animal e com um alfinete de inseto blunt empurrou a partes da boca para trás através da cavidade do corpo. Este evertido da parede do corpo larval, como transformar uma meia dentro para fora. Concluímos a dissecção com tesoura ultra-fina dissecação e, portanto, expostos ao lado visceral dos músculos da parede do corpo. As estruturas glial no MNJ expressa GFP membrana alvo sob o controle de promotores glial específico. A membrana pós-sináptica, a SSR (Reticula subsináptico) no músculo expressa sinapticamente alvo dsRed. Precisávamos aguda rótulo os terminais do neurônio motor, a terceira parte da sinapse. Para fazer isso, aplicamos anticorpos primários para HRP, conjugado a um flurophore emitindo far-vermelho. Para testar as propriedades de difusão de corante no espaço perisynaptic entre os terminais do neurônio motor e da SSR, aplicou-se uma solução de moléculas grandes Dextran conjugado com muito vermelho flurophore emissora e imagens recolhidas.

Parte 1: Preparação do tecido

1. Nosso objetivo é uma preparação de tecidos de larvas de moscas, onde o sistema nervoso está intacta, mas a superfície interior do músculo parede do corpo é exposto a uma hemolinfa artificial, e pode ser posicionada perto de uma lamínula de microscópio de ótica bom. Em outras palavras, uma de dentro para fora preparação larval.
   
   Desde preparações de tecido convencional envolvem corte, prendendo e alongamento do músculo parede do corpo e, por vezes retirando parte do sistema nervoso, precisávamos de uma abordagem diferente.
   
   Queríamos que os animais de dentro para fora, porque queríamos dar uma boa olhada em características estruturais e as mudanças estruturais ao longo do tempo na sinapse, e queríamos manter o sistema nervoso intacto. Nós também queríamos evitar esticar o tecido e ativando os receptores de estiramento, o que tornaria os músculos se contorcer e arruinar as nossas imagens.


2. Para começar, estágio os animais. Alimentando larvas terceiro e Wandering larvas terceiro são grandes e fáceis de dissecar isso vamos demonstrar na W3 larvas. Este animal é tem o fenótipo Tubby, e é grande, por isso é fácil de Evert.
   
   Nós só usamos larvas que vimos ativamente rastejando, incluindo W3 larvas.
3. Limpe a superfície de um verme com um pincel muito macio em uma placa de Petri de bidestilada H2O. Larvas limpas têm melhor óptica e limpeza reduz bactérias.
4. Transferir o animal para uma pequena placa de Petri de cerca de 3 ml de gelo frio HL-6, e hemolinfa artificial. Coloque o prato sobre o gelo até que o animal pára de se mover, e relaxa (cerca de 5 minutos).
5. Segure uma pinça ponta muito fina em uma mão e uma tesoura de primavera no outro. Eu uso a tesoura com a mão dominante. Faça um pequeno buraco na parede do corpo com a tesoura para equlibrate a pressão do outro lado da parede do corpo.
6. Mantenha o animal gentilmente com a pinça para baixo no fundo do prato e cortar o posterior dois segmentos. Dissecar fora as vísceras e gordura corporal provavelmente vai sair da cavidade do corpo. Cortar esse tecido também.
7. Segure as larvas contra o fundo prato com uma pinça fina. Segure um alfinete # 0 inseto em (com uma ponta romba) e empurrá-lo contra a partes da boca das larvas. Empurre a partes da boca através da cavidade do corpo como se estivesse virando uma meia do avesso.
8. Dentro para fora do tecido será semelhante a figura: abaixo. Com ultra-fina ferramenta de dissecação, dissecar afastado a gordura corporal e trachioles da parede do corpo. Tente REALMENTE difícil não puxar o trachioles, ou desligar o sistema nervoso. Rasgando o trachioles vai rasgar buracos na parede muscular do corpo.
   
   Remover o corpo tanto quanto a gordura como você pode. Ambas as estruturas perturbar a qualidade óptica do seu tecido. Você pode querer pular o café antes de fazer essa preparação.


9. Quando você terminar o músculo irá ser translúcido, não opaca ou branco. Se você colocar o tecido em prep HL-6 sem glutamato, à temperatura ambiente, ele provavelmente vai contrair ritmicamente, porque os geradores de padrão motor no SNC estão funcionando.
   
   Evitar o uso de preps com o músculo contraído obviamente, ou irregularmente contratados corpo parede.
   
   O interior intacto parede do corpo para fora prontamente tende a dobrar ao meio ao longo da linha média dorsal e ventral, de modo a preparação dá uma para a esquerda ou direita "hemi-animal" para visualizar.
10. 1,9 Monte do tecido em qualquer câmara de um pequeno volume comercial, tais como a câmara Warner, ou uma lâmina de microscópio com um arranjo de ponte tampa de deslizamento. Ver a parte 3 para sugestões sobre o tecido de montagem.

Parte 2: Rotulagem Bouton Neuronal fluorescente etiquetado com anticorpo primário contra a HRP.

1. Colocar 50 litros de micro fluorescente etiquetado primário anti-corpo contra a HRP em HL-6 em uma queda em uma placa de Petri. Mergulhe dentro para fora prep parede do corpo no banho de corante. Você pode ver neurônio rotulagem terminal após cerca de 5 minutos, mas incubar por 10-20 minutos, por uma etiqueta completa e brilhante.
2. Enxaguar o corante por 10-30 segundos na HL-6 em temperatura ambiente. Não-vinculados corante lavagens rapidamente, de modo que o ciclo de lavagem não precisa ser agressivo.
3. Variar a concentração de corante e tempo de incubação, conforme necessário.

Parte 3: Rotulagem espaço Perisynaptic com dextran flurophore conjugado

1. Diluir fluorescente conjugados dextran corante diluído em HL-6. Uma concentração que funcionou bem para os nossos propósitos foi:
2. Se você não está preocupado com o tempo de acesso ao corante em seu espaço extracelular, coloque uma gota 20 micro litro de corante em uma lamela "ponte" (ver parte 4) e depositar a preparação do banho de tintura.

Parte 4: Montagem do tecido para visualização (com microscopia confocal).

Se você não precisa perfundir sua preparação (observações curtas) ou você quer manter o volume de banho HL-6 pequenos, use o método de lâmina dupla em ponte

Se você quiser perfundir sua preparação, tente usar uma câmara de perfusão. Usamos um moCâmara dified de Instrumentos Warner.

Detalhes para os dois seguintes.

Montagem de preparação em um slide duplo ponte.

1. Use uma lâmina de microscópio muito limpo. Supercola dois quadrados, 18mm (# 1.5) lamínulas para o slide. Deixe um intervalo de 2 mm entre as bordas das lamínulas.
2. Deixe a cola secar completamente, ou ele vai formar uma película estranha sobre o meio aquoso em torno de sua preparação.
3. Posição dentro para fora larvas entre as bordas das lamínulas. Você pode precisar a posição da preparação em uma diagonal, se as larvas é grande e seu sistema de aquisição de imagem tem uma matriz de pixels limitada.
4. Cubra o tecido com uma lamela # 1.5, 18mm (muito limpo). Aderem a lamela "top" no slide afixada desliza tecido de acompanhamento, com vaselina mínimo.
5. Coloque uma gota de óleo Cargill objetivo personalizado com um índice de refração de 1,3379 (se você usa HL-6) sobre a lamela superior e virar esta assembléia acabou.
6. Posicione o conjunto de tecidos ao seu lado petróleo microscópio, em direção ao objetivo, e focar seu objetivo.
   Montagem do tecido em uma câmara de perfusão modificado.
7. Cola lamínula de 1,5 para formar um piso nos 20 RC câmara. Posicione o tecido na câmara como por RC-20 instruções. Use um pedaço de malha NYTEX em vez de uma lamela para formar um teto para a câmara.

Parte 5: Resultados Representante:

1. De dentro para fora do tecido seqüência dissecção preparação:
   
   W3 larvas, lavados (fenótipo "Tubby") (5.1.1). W3 larvas, posterior 2 segmentos dissecados. Você pode ver de gordura corporal empurrado para fora da cavidade do corpo pelo corpo trans-tensão de parede (seta). Tentar minimizar "erupção" visceral, fazendo um pequeno buraco na parede do corpo um minuto antes da dissecação (5.1.2). A preparação com as vísceras, dissecados antes de virar a preparação de dentro para fora (5.1.3). A preparação, a maioria evertido, com o pino (seta) no interior do lúmen do prep (5.1.4). O músculo está agora do lado de fora ea cutícula é no interior, com alguns de gordura corporal e trachioles anexado (5.1.5). A preparação dos tecidos dissecados totalmente com quase todo o corpo de gordura e trachioles dissecados (5.1.6).
   
2. Viver rotulagem usando anti-HRP no MNJ larval. Um representante W3 sinapse nervo-músculo larval com uma extensão de glial (de dentro para fora prep). O motor terminais neurônio bouton são rotulados com um primário anti-corpo contra a HRP (magenta), que é conjugado com Cy5. Os processos gliais são rotulados com GFP (verde).
   
3. Espaço Perisynaptic fluorescente visualizado com Alexa 680 dextran em uma de dentro para fora prep. O processo glial (verde) é rotulado com GFP membrana alvo. O SSR pós-sinápticos na superfície muscular (azul) é rotulado com dsRed. O Alexa dextran (vermelho) formas concentra em áreas extracelular. O corante dextran formas piscinas em forma de anel nos espaços perisynaptic. A rotulagem dextran e dsRed SSR marcados são mostrados em escala de cinza. Observe a várias piscinas donut em forma de corante destacando os espaços perisynaptic (seta).

Este procedimento permite a longo prazo de imagens ao vivo de proteínas etiquetadas e processos celulares. O tecido em prep situ descrevemos tem um SNC intacto e em funcionamento, PNS e circuitos reflexos. Esta preparação do tecido tem vantagens sobre protocolos padrão voar larval muscular, onde o músculo da parede do corpo larval é esticada (quando ele é preso para fora). Alongamento pode distorcer a morfologia sináptica e desencadear reflexo contrações based. Nossa preparação foi dentro para fora mecanicamente estável, e tinha óptica excepcionalmente bom que facilitaram a análise de alta resolução de alterações celulares em tempo real. Além disso, a preparação de dentro para fora sobreviveu por até uma hora e visualização permitido de mudanças sinápticas mais de um curso de longo tempo.

Durante a dissecção, tome cuidado para não danificar o PNS ou CNS. Além disso, evite rasgar ou puxando o traquéias, pois isso danifica as células do músculo. Manter o músculo parede do corpo o mais relaxado possível. Refrigeração do HL-6 e do tecido relaxa os músculos da parede do corpo e reduz a trans-corpo da tensão da parede. Cálcio (2mm) na na hemolinfa artificial é essencial para a saúde e morfologia das células gliais.

Imagem deve ser executada em tecido muscular estável, não contratante. Enquanto 5 mM glutamato eficiente blocos contrações musculares neuralmente evocado, o cálcio nifedipina bloqueador dos canais pode ser uma alternativa útil. Nifedipina em 10 blocos de micromolar mais nervosas (mas não todos) evocou a contração muscular. Blocos nifedipina tensão canais de cálcio gated na membrana da célula muscular mais eficaz do que os canais associados com a liberação do neurotransmissor, bloqueando assim a contração muscular, enquanto permitindo a função normal de MNJ sináptica (Morrales et al 1999).

Utilizando o procedimento de rotulagem de anticorpos, que robustamente rotulados os resíduos de carboidratos extracelulares expressas em terminais de neurônios, que são reconhecidos pelo anticorpo anti-HRP primária. Obtivemos excelentes rotulagem usando o anticorpo anti-HRP de Jackson laboratórios, disponíveis pré-conjugada com uma variedade de fluoróforos (Cy5 em nossos estudos). Esta abordagem pode ser adaptada para uso com qualquer anticorpo primário que reconhece um epítopo extracelular, por exemplo rotulagem moléculas da matriz extracelular.

A in situ "de dentro para fora" de preparação dos tecidos, juntamente com uma modificação do protocolo usado por Stork et al 2008, é útil para sondar barreiras de difusão celular. Fluorescentes dextran difusão dye também pode ser útil para o sincronismo e visualizar perfusato e drogas entrada em inter-celular espaços, tais como fendas sinápticas.

Com corantes fluorescentes dextran, é fundamental usar uma câmara de perfusão de pequeno volume. Se houver demasiado "grosso" de uma camada limite da solução corante cobrindo a estrutura que você procura para a imagem, a solução corante pode obscurecer a característica de interesse, devido à falta de contraste entre espaços corante infundido e as estruturas circunvizinhas.

Finalmente, as nossas técnicas rotulagem estruturais requerem um sistema de imagem de alta resolução adequada para o tecido vivo. Usamos spinning microscópios confocal de disco (Quorum tecnologias e sistemas de Perkin-Elmer) em conjunto com software Volocity (Improvisação), um comprimento de trabalho longo, de alta abertura numérica da lente de imersão 63X de água, e lasers e filtros apropriados para visualizar GFP, dsRed e muito vermelho fluoróforos. Para geração de imagens que usamos óleo objetivo personalizado formulado microscópio da Cargill laboratórios para coincidir com o índice de refração da hemolinfa artificial, HL-6, em conjunto com a lente 63X de imersão em água. Sem este petróleo, erro refrativo foi significativa e resultou em imagens distorcidas. Nossa em preparação in situ pode ser usado com outros sistemas 3-D de imagem, como o sistema de Restauração API DeltaVision digitalização. No entanto, os cuidados devem ser tomadas para superar os altos níveis de dispersão de luz da espessura de preparação dos tecidos, ao vivo.

Este projeto foi financiado pelo CIHR e NSERC. Gostaríamos de agradecer Jusiak Barb para contribuir para a criação das cepas voar expressar dsRed SSR marcados (linha BJ), eo UBC Facility Bio-imagem.