저희 연구실에서는 식품 산업에서 중요한 발효 박테리아인 락티플란티바실러스 플란타룸(lactiplantibacillus plantarum)과 같은 박테리아에서 세포 외 전자 전달(EET)을 조사합니다. EET에서 세포는 생체 전기 화학 시스템의 전극과 같은 세포 외 전자 홀로 전자를 전달합니다. 우리는 바이오센싱, 바이오 촉매 및 식품 발효 분야의 응용 분야를 위한 EET를 이해하고 엔지니어링하고자 합니다.
우리는 알파인 터널이 DHNA와 같은 퀴논이 있는 상태에서 EET를 통해 전류를 구매할 수 있음을 발견했습니다. 이 과정은 NAD plus를 재생하고 1차 발효 경로의 전반적인 손실을 가속화하며 세포 성장을 촉진합니다. 또한, DHNA 이외의 다양한 퀴논 유도체도 L 플란타럼에서 EET를 매개할 수 있음을 발견했습니다.
매개 EET를 조사하려면 전문화된 생화학적 설정이 필요합니다. 특히, 우리는 양극 반응과 음극 반응 사이의 누화를 방지하기 위해 3 전극, 2 챔버 생체 전기 화학 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 전자 매개체로부터의 전자 전달을 향상시키기 위해 표면적이 큰 탄소장, 작동 전극을 사용합니다.
L 플란타럼의 EET 경로와 이러한 경로가 발효 대사와 어떻게 상호 작용하는지 탐구하는 우리의 연구는 식품 산업에서 유용한 응용 분야를 가질 수 있습니다. 우리는 EET와 L 플란타럼이 발효를 통해 대사 플럭스를 변경한다는 것을 알고 있으며, 이는 유용한 응용 분야를 위해 조작되고 식품 풍미를 변경하고 전기 발효에서 귀중한 화학 물질을 생산할 수 있다는 것을 알고 있습니다. 앞으로도 우리는 EET에 대한 기초 지식을 계속 늘리고 L plantarum과 같은 유기체에서 새로운 EET 응용 분야를 추구할 것입니다.
우리는 EET 경로에서 단백질을 엔지니어링할 계획이며, 이를 통해 전기 발효 및 바이오센싱 응용 분야에서 EET를 추가로 제어할 수 있습니다. 시작하려면 반대 전극 작업을 위해 직경 1mm의 티타늄 와이어를 고르게 광택이 날 때까지 산화알루미늄 사포로 미리 절단합니다. 펜치를 사용하여 각 작업 전극 와이어의 한쪽 끝을 작은 고리로 구부립니다.
16제곱센티미터 탄소 펠트를 각 작동 전극 와이어에 둥글게 밀어 넣고 탄소 펠트 안팎으로 와이어를 한 번 엮고 후크에 고정될 때까지 와이어를 아래로 당깁니다. 고무 격막을 와이어로 뚫고 몇 센티미터 당겨 작업 만남 전극을 GL 45 캡에 고정합니다. 쌍을 이루는 반응기를 구축하려면 O-링을 조립하고 물에 미리 적신 미리 절단된 양이온 교환 멤브레인을 조립된 O-링에 배치합니다.
두 쌍의 반응기 병의 큰 바닥 구멍 사이에 멤브레인이 있는 O-링을 놓습니다. 반응기 쌍 병과 링을 너클 클램프로 멤브레인과 고정합니다. 고무 격막이 장착된 GL14 캡으로 각 병 상단의 모든 작은 구멍을 닫기 전에 마그네틱 교반 막대를 각 양극 챔버에 떨어뜨립니다.
각 반응기 병에 110ml의 탈이온수를 채웁니다. 탄소 펠트 원형 작동 전극이 장착된 캡을 삽입하고 펠트 원형 상단을 부드럽게 눌러 후크에 고정합니다. 전극이 장착된 적절한 GL45 캡으로 병을 닫습니다.
물이 채워진 반응기 및 GL14 전극 캡을 오토클레이브합니다. 무균 상태에서 글리세롤 스톡의 상단에서 락토플랜트 아바실리스크 플란타럼 배양액을 긁어내고 3ml의 상업용 수요 rugosa sharp 또는 MRS 배지를 접종합니다. 섭씨 37도에서 흔들리지 않고 밤새 배양물을 배양하십시오.
먼저 멸균 생물 안전 캐비닛에서 바이오 전기화학 시스템 반응기에서 오토클레이브된 물을 폐기합니다. 음극 챔버를 110ml의 오토클레이브 M9 중형 및 양극 챔버로 새로 준비된 110ml의 MCDM으로 채웁니다. 양극 챔버에서 GL14 캡 하나를 실리콘 천장 링이 있는 오토클레이브 GL14 캡으로 교체합니다.
전극 캡을 통해 각 양극 챔버에 배치하기 전에 준비된 기준 전극에 70% 에탄올을 분사합니다. 모든 캡과 cl을 조입니다.amp누출을 방지하기 위해. 반응기를 워터 펌프 시스템에 연결하려면 먼저 각 반응기를 적절한 교반 막대 플랫폼에 놓습니다.
그런 다음 고무 튜브를 사용하여 각 반응기의 워터 재킷 꼭지를 다음 반응기에 연결하고 끝 반응기를 워터 펌프의 유입 및 유출 튜브에 연결합니다. 펌프에 물을 채우고 물 조절기 4-6방울을 넣으십시오. 펌프 시스템을 켜고 온도를 섭씨 30도로 설정합니다.
펌프를 시작하고 모든 반응기 워터 재킷을 통한 물의 흐름을 관찰하여 누출이 없는지 확인합니다. 교반 플랫폼을 켜고 220RPM으로 연속 교반하도록 설정합니다. 반응기를 질소 절약 가스 라인에 부착하려면 먼저 공기 필터를 22 게이지 바늘에 부착하고 반응기 양극 챔버의 상단 격막을 통해 바늘을 매체에 삽입합니다.
반응기 양극 챔버의 상단 격막에 18 게이지 바늘을 삽입한 다음 질소 공급원의 가스 라인을 공기 필터에 연결하고 밸브를 열어 가스가 반응기를 통해 부드럽게 거품이 일도록 합니다. 생물반응기를 전위차 조절기 리드에 부착하려면 전위차 조절기의 작업 계수기와 기준 전극 앨리게이터 클립 리드를 해당 전극에 연결합니다. 모든 매개변수를 입력한 후 녹색 시작 삼각형을 눌러 실행을 시작합니다.
모든 반응기가 긍정적으로 읽히는지 확인하기 위해 몇 분 동안 개방 회로 전압 트레이스를 관찰합니다. 그리고 꾸준한 신호로 함께 닫습니다. 무균 조건에서 이전에 성장한 L 플란타럼 배양을 50밀리리터의 MMRS에서 1-200개로 하소배양합니다.
섭씨 37도에서 하룻밤 동안 흔들리지 않고 세포를 성장시킵니다. 먼저 인큐베이터에서 MMRS에서 자란 L 플란타럼 배양액을 제거합니다. 멸균 상태에서 배양물을 50ml 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
4, 000 G에 4 섭씨 온도에 5 분 동안 배양을 원심 분리하십시오. 펠릿을 PBS 50밀리리터에 재현탁하기 전에 상등액을 제거합니다. 두 번째 세척 후, 차가운 PBS에서 세포를 600 나노 미터의 11에서 광학 밀도로 재현 탁시킵니다.
2ml의 재현유 세포를 바늘이 장착된 3ml 주사기에 넣습니다. 반응기 스테이션에서 세포 주사기의 뚜껑을 제거하고 바늘을 반응기 양극 챔버 상단에 삽입합니다. 모든 주사기가 제자리에 놓이면 플런저를 눌러 세포를 주입합니다.
크로노암페로메트리 트레이스에서 주입 시간을 기록합니다. 전류가 2-4시간 동안 트레이스에서 안정화되도록 합니다. 생전기화학 시스템에서 실험용 반응기는 플러스 DHNA로, 용매 제어 반응기는 마이너스 DHNA로 표시합니다.
DHNA 110마이크로리터에 20밀리그램이 들어 있는 주사기의 뚜껑을 제거하고 플러스 DHNA로 지정된 양극 챔버 상단에 삽입합니다. 110마이크로리터의 DMSO가 장전된 주사기를 마이너스 DHNA로 지정된 양극 챔버에 삽입합니다. 21 게이지 바늘이 장착된 3ml 주사기를 사용하여 사용하지 않는 스몰 캡 격막을 통해 각 양극 챔버에서 2ml의 매체를 제거합니다.
샘플을 24 깊이의 웰 플레이트로 옮겨 0시 시점의 pH를 측정합니다. DHNA 및 DMSO 주사기의 플런저를 눌러 반응기에 주입합니다. 크로노암페로메트리 트레이스에서 주입 시간을 기록합니다.
모든 주사기와 바늘을 버리십시오. 24시간 후, 앞서 설명한 대로 각 양극 챔버에서 2ml의 매체를 제거하고 24시간 pH 측정을 위해 24 딥 웰 플레이트로 옮깁니다. 24시간 시점에 대해 순환 전압전류법을 실행합니다.
각 반응기에서 24시간 샘플의 pH를 측정하고 기록합니다. 세포 외 전자 전달로 인한 전류 밀도는 DHNA 주입 후 8시간 후에 평방 센티미터당 약 132마이크로암페어의 피크에 도달했습니다. 대조적으로, DMSO 주입은 무시할 수 있는 전류 밀도를 생성했습니다.
순환 전압주사법 데이터는 DMSO가 있는 L 플란타럼과 비교하여 DHNA가 있는 L 플란타럼이 있는 경우 50밀리볼트에서 산화 전류의 뚜렷한 증가를 보여주었으며 비생물적 DHNA 추적과 비교하여 300밀리볼트에서 전류 밀도가 256% 증가했음을 보여주었습니다. 세포 외 전자 전달은 L 플란타럼 및 DHNA가 있는 샘플에서 24시간 동안 pH가 평균 3.33으로 현저하게 떨어진 반면, L 플란타럼 및 DMSO가 있는 샘플의 평균 pH는 6.50이었습니다.
