이 연구는 미국 심장 학회 설립자 제휴사 (12GRNT12060233)와 로체스터 대학의 Strong Children &#39;s Research Center의 연구비 지원으로 이루어졌습니다.

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기능적 ETC는 미토콘드리아 ATP 생성에 필요합니다. ETC의 복합체는 respirasomes (Cx-I, -III 및 -IV) 1 과 신타 소솜 (Cx-V) 2의 두 가지 유형의 수퍼 콤플렉스를 형성 할 수 있습니다. ETC를 supercomplexes로 편성하는 것은 전반적인 ETC 효율성을 증가시키는 것으로 생각되는 반면, 각 복합체의 조립은 손상되지 않은 ETC에 필요하다. 이러한 수퍼 콤플렉스가 어떻게 조립 및 분해되는지는 잘 알려져 있지 않지만 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 프로세스를 더 잘 이해할 수 있습니다. ETC 어셈블리 연구의 주요 과제는 이러한 단백질 복합체의 크기입니다. 예를 들어, 미토콘드리아 호흡기는 Cx-I (약 880 kDa)와 하나 이상의 Cx-III 분자 (460 kDa) 및 Cx-IV (200 kDa, 이량 체로 활성)로 구성되어 분자와의 복합체를 형성 할 수있다 약의 무게2,000 kDa. 또한, Cx-V는 약 600 kDa의 분자량을 가지지 만, 이량 체, 사량 체, 올리고머 및 이량 체 7,23의 리본으로 조립되어 분자량 2,000 kDa 이상의 초 콤플렉스를 생성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 수퍼 콤플렉스의 엄청난 크기를 고려할 때,이 실험실과 다른 사람들이이 수퍼 콤플렉스를 식별하고 특성화하기 위해 전통적으로 몇 가지 부분적으로 관련한 접근법이 사용되었습니다 ( 8 , 14 , 24) . 이 연구는 활성 단백질 복합체가 약한 세제를 사용하여 미토콘드리아 막에서 부드럽게 추출되는 고유의 겔 PAGE 기술을 입증했습니다. 복합체는 주로 크기와 고유 전하 (CN PAGE) 또는 단백질 바인딩 된 쿠마시 블루 (BN PAGE)의 크기 및 음전하 때문에 젤에서 이동합니다. 이 젤들은 C로 염색 될 수 있습니다.oomassie blue ( 예 : CN 젤) 또는 silver stain ( 예 : BN 및 CN PAGE). Lauryl maltoside는이 세제가 가장 안정적으로 작용했기 때문에 여기에 설명 된 실험에 사용되었습니다. 또는 digitonin을 사용하여 단백질 복합체 12 를 추출 할 수 있습니다. 성인 심장, 간 및 뇌에서 분리 된 미토콘드리아 데이터가 여기에 표시되었지만 이러한 기술은 배아 및 성인 심장 균질 물질에 대해 수행되었습니다 8 . 다른 사람들은 배양 된 세포에서 분리 된 미토콘드리아를 사용하여이 기술을 수행했습니다. 그러나 높은 DNA 함량을 가진 조직 균질 액 또는 배양 된 세포를 사용하는 경우 전기 영동 중 줄기를 방지하기 위해 핵산 분해 효소를 첨가하는 것이 유용 할 수 있습니다 25 . 다른 복합체의 활성은 Cx-I 및 Cx-V 및 tec에 대해 여기에서 설명 된 것처럼 겔에서 직접 분석 할 수 있습니다또한 Cx-II, -III 및 -IV 12 의 활동을 조사 할 수 있습니다. 그러나 이러한 IGA 분석은주의 깊게 수행해야합니다. 첫째, 효소 반응은 비 ETC 효소 또는 불완전하게 조립 된 복합체 때문일 수있다. 예를 들어, 원래의 Cx-V를 억제하기 위해 oligomycin으로 처리 된 평행 겔로 Cx-V IGA를 수행하는 것은 일상적입니다 ( 그림 3 ). 또한, 다른 NADH oxidases는 Cx-1 in-gel activity를 설명 할 수 있습니다. 하나는 로테 논과 같은 Cx-I 억제제가있는 상태에서 병렬 IGA를 수행 할 수 있습니다. 그러나 그림 1 에서 분리 된 미토콘드리아가 사용되었으므로 세포질 NADH oxidases는 존재하지 않았다. 따라서, 데이터는 Cx-I- 함유 단량체 및 수퍼 콤플렉스를 나타낼 가능성이 가장 높다. 또한 이러한 결과의 정량화는 사진 또는 스캔에서 밴드의 신호 강도를 측정하여 가능합니다. 이 접근법의 단점은반응 생성물의 이동성, 겔의 깊이에 걸쳐 생성물을 적절하게 정량화 할 수 없으며, 반응의 잠재적 인 비선형 성을 나타낸다. 후자를 극복하기 위해 일련의 사진을 사용하여 반응 속도를 얻으려는 제안이 있지만 여기에서는 시도하지 않았습니다. 고유 젤의 단백질은 또한 막으로 옮겨 질 수 있으며, 밴드의 단백질 조성은 면역 블로 팅 (여기에서 설명) 또는 2D PAGE (참조 13 에서 입증)로 검사 할 수 있습니다. ETC 복합체의 단량체는 전통적으로 분리 된 미토콘드리아의 고유 겔, 젤에서의 위치 및 분자 표지 단백질에 대한 위치 ( 그림 1 )로 풍부하게 식별되었습니다. 또한, 다른 복합체의 서브 유닛에 특이적인 항체로 후속 면역 블롯을 표지하는 것은 복합체 및 조성물을 확인하는 것을 돕는다supercomplexes의. 따라서, 항 -NDUFB6 및 -ATP5A는 여기에서 설명 된 바와 같이 Cx-1 및 Cx-V를 각각 함유하는 단량체 및 수퍼 콤플렉스를 식별한다. Cx-II에서 IV에 항체는 동일한 목적으로 사용될 수 있습니다. 경우에 따라, 일부 항체가 변성 된 단백질에 특이 적이거나 또는 에피토프가 천연 복합체에서 다른 단백질에 의해 감추어 질 수 있기 때문에, 변성 겔에서 잘 작동하는 항체는 네이티브 겔에서 잘 작동하지 않을 수있다. 대부분의 이용 가능한 분자량 마커가 Cx-V 단량체의 크기보다 낮기 때문에 이러한 supercomplex의 정확한 분자량 결정은 어렵습니다. 천연 겔에서 단백질 복합체의 이동은 크기, 내재 전하 및 세제가 28 에 따라 달라집니다. 여기의 예에서, 복합체의 단량체는 겔, 마커 및 면역 블로 팅에 기초하여 동정되었다. Cx-V의 이량 체는 Cx-I 및 -V의 단량체에 비해 상대적 이동 및 면역계블로 팅. 겔, IGA 및 면역 블롯의 단량체와 이량 체 위의 다른 모든 것들은 수퍼 콤플렉스로 간주됩니다. 네이티브 면역 블롯은 또한 표준 기술을 사용하여 밴드 밀도를 분석함으로써 수퍼 콤플렉스에 대해 정량화 될 수 있습니다. 이 방법은 여기에 표시되지 않았지만 최근의 출판물에서는이 기술을 보여줍니다 8 . 단백질 로딩의 정상화는 레인의 Ponceau red 염색을 사용하거나 변성 면역 블롯상의 VDAC 밴드의 밀도를 측정하기 위해 미토콘드리아 추출물의 샘플을 저장하여 수행 할 수 있습니다 ( 그림 2A 및 D ). 또한, 같은 immunoblot에서 단량체에 대한 supercomplexes의 비율을 조사하는 것은 band density를 정량화하는 또 다른 방법이지만, blot development 동안 서로 다른 시간에 사진을 찍어 밴드가 과다 노출되지 않도록주의해야합니다. 마지막으로, 천연 겔의 밴드를 전기 분해하여 purifie를 생성 할 수 있습니다d는 고차원 복합체로 조립 될 수 있고 복잡한 기능의 추가 연구에 사용될 수있는 활성 단백질 복합체입니다. 예를 들어 Cx-V 단량체는 이전에 전기 영동되어 리포좀으로 재구성되어 전기적 기능성 29을 입증했습니다. 네이티브 전기 분해에 대한 또 다른 접근법은 주변 버퍼 ( 16 ) 로의 수동 확산에 의한 용출이지만, 이는 네이티브 전기 분해에 비해 느립니다. 마지막으로, 전기 분해의 주요 문제점은 복합체가 정제 과정에서 해리 될 수 있기 때문에 전기 분해 된 단백질 복합체의 효소 기능을 유지하는 것입니다. 따라서이 기술로 분리 한 후 기능 분석은 엄격하게 테스트해야합니다. 이들 프로토콜을 효소 분석 및 산소 소비 측정과 결합하여 개별적인 ETC 복합체의 기능 및 전체 ETC 30 의 활성 및 다른 메타ods, crystalles 31 및 복합체와 supercomplexes의 구조에 대한 전자 현미경 32 평가와 같은 ETC의 내부 작용의 완성 된 그림이 나타났습니다. 우리는 복합체의 조립 방법, 전자가 사슬을 따라 흐르는 방법, 그리고 양성자가 멤브레인을 통해 펌핑되어 그래디언트를 생성 한 다음 Cx-V를 통해 매트릭스로 역류하여 ATP를 생성하는 방법에 더 가깝습니다. 의심의 여지없이 이러한 기술은 ETC의 구조, 기능 및 동적 규제에 대한 추가 세부 정보를 제공하기 위해 더욱 개선 될 것입니다.

ATP 형태의 미토콘드리아 에너지는 세포 생존에 필수적 일뿐만 아니라 세포 사멸의 조절에도 필수적이다. 산화 적 인산화에 의한 ATP의 생성에는 기능적 전자 전달 사슬 (ETC, Cx-1 내지 IV) 및 미토콘드리아 ATP 신타 제 (Cx-V)가 필요하다. 최근의 연구에 따르면 이러한 큰 단백질 복합체는 respirasomes 및 synthasomes 1 , 2 라고 불리는 수퍼 콤플렉스로 구성되어 있습니다. 이러한 대규모 단지와 수퍼 콤플렉스의 조립, 역학 및 활동 규제를 분석하는 것은 어려운 일입니다. 분광 광도계를 사용하여 수행 한 산소 전극 및 효소 분석으로 얻은 산소 소비 측정은 ETC 복합체 활성에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있지만이 분석법은 관련된 단백질 복합체 또는 수퍼 콤플렉스의 존재, 크기 및 하위 구성에 관한 정보를 제공 할 수 없습니다. 그러나, 청색 및 투명한 천연 (BN 및 CN) PAGE 3 은 복잡한 구성 및 조립 / 해체에 대한 중요한 정보와 생리 및 병리학 적 조건 하에서 이들 중요한 호흡 복합체의 초분자 조직의 동적 조절에 대한 강력한 도구를 창출했습니다. 이러한 복합체를 고차 수퍼 콤플렉스로 조립하면 미토콘드리아 구조와 기능을 조절하는 것으로 보인다 5 . 예를 들어 respirasome assembly는 전자 이동의 효율과 미토콘드리아 내부 막을 가로 지른 양성자 원동력의 생성을 증가시킵니다 5 . 또한, synthasomes의 조립은 ATP 생산의 효율과 세포질 2 로의 에너지 등가물의 전달을 증가시킬뿐만 아니라 미토콘드리아 내부 막을 관상의 cristae 6 로 몰드시킨다 &lt;/ sup&gt; 7 . 마우스 배아에서 심장 발달 중 supercomplex assembly에 대한 연구는 심장에서 Cx-I- 함유 supercomplexes의 생성이 대략 배아 일 13.5 8 에서 시작한다는 것을 보여준다. 다른 사람들은 노화 또는 허혈 / 재관류 손상으로 인해 Cx-I- 함유 수퍼 콤플렉스의 양이 심장에서 감소하거나 신경 퇴행성 질환의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다 11 . 이 프로토콜은 ETC 복합체 및 supercomplexes의 조립 및 활동을 조사하는 데 사용할 수있는 원시 젤 페이지에 대한 방법을 설명합니다. 미토콘드리아 supercomplexes의 대략 분자량은 CN 또는 BN polyacrylamide 젤에 단백질 복합체를 분리하여 평가할 수 있습니다. CN PAGE는 또한 겔에서 직접적으로 모든 미토콘드리아 복합체의 효소 활성을 시각화합니다 (in-gel assay;IGA) 12 . 이 연구는 IGA를 통해 NADH를 산화시키는 Cx-I의 능력과 IGA에 의한 Cx-V의 ATP 가수 분해 활성으로 인한 신타 소솜의 존재를 강조함으로써 호흡기 활동을 입증합니다. Cx-I 및 Cx-V를 함유 한 복합체 및 수퍼 콤플렉스는 또한 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 면역 블로 팅을 수행함으로써 입증 될 수있다. 이 방법의 장점은 일반적으로 BN 또는 CN PAGE가 생리 학적 크기 및 조성을 기반으로 단백질 복합체를 분리한다는 점입니다. 멤브레인으로의 전달은 이러한 밴드 패턴을 보존합니다. BN 또는 CN PAGE에서 단백질 복합체를 분석하는 것은 2D-PAGE (Fiala 등 13 참조) 또는 자당 밀도 원심 분리 14 , 15 를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 특정 밴드를 추가로 분석하기 위해 BN PAGE에서 추출 할 수 있으며이 단백질 복합체의 단백질을 정제 할 수 있습니다d. 네이티브 전기 분해는 몇 시간 내에 수행 될 수 있는데, 이것은 겔로부터 주변 완충액으로의 단백질의 수동 확산 (참조 문헌 16에서 사용 된 바와 같이)에 상당한 차이를 만들 수있다. 요약하면, 이들 방법은 미토콘드리아 막으로부터의 고 분자량 수퍼 콤플렉스의 추가 특성 결정을 가능하게하는 몇 가지 접근법을 기술한다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Protean II mini-gel chamber</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean XL maxi-gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653189</td>
			<td>Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, Hoefer SG15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95044-704</td>
			<td>Pouring mini-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, maxi-gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>GM-100</td>
			<td>Pouring maxi-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Complete set to wet transfer of proteins onto membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroeluter model 422</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652976</td>
			<td>Electroelution of proteins from native or SDS PAGES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653308</td>
			<td>Short plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653312</td>
			<td>Spacer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td>Inner plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td>Outer Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Power supply suitable for native electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL-Western&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal-West Dura</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td>Enhanced chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film/autoradiography film</td>
			<td>GE Health care</td>
			<td>28906845</td>
			<td>Documentation of Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processor CP1000</td>
			<td>Agfa</td>
			<td>NC0872640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Taking photos to document gels, membranes and blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640 Camera hood&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td></td>
			<td>shielding camera for photos being taken on a light table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bisacrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610148</td>
			<td>40% pre-mixed solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxychelate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D66750</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I15513</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G250</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native&#160; molecular weight kit</td>
			<td>GE Health care&#160;</td>
			<td>17-0445-01</td>
			<td>High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>antibody to ATP synthase subunit ATP5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110244</td>
			<td>antibody to Cx-1 subunit NDUFB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529534</td>
			<td>antibody to VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP linked antibody</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution

미토콘드리아 전자 수송 사슬 (ETC)은 다양한 연료의 분해로 인해 생성 된 에너지를 세포의 ATP 인 생물 에너지로 변환시킵니다. ETC는 respirasomes (CI, C-III, C-IV) 및 전자 전달 및 ATP 생산의 효율성을 증가시키는 synthasomes (CV)라고 불리는 supercomplexes로 조립되는 5 개의 거대한 단백질 복합체로 구성됩니다. ETC 기능을 측정하기 위해 50 년 이상 다양한 방법이 사용되었지만 이러한 프로토콜은 개별 복합체와 수퍼 콤플렉스의 조립에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 ETC 복잡한 구조를 연구하기 위해 20 년 이상 전에 수정 된 방법 인 고유 겔 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE) 기술을 설명합니다. 네이티브 전기 영동으로 ETC 복합체를 활성 형태로 분리 할 수 ​​있으며,이 복합체는 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔화 분석 (IGA) 및 전기 분해로 정제 할 수 있습니다. 다시 조합하여네이티브 젤 PAGE와 다른 미토콘드리아 분석 결과를 비교해 보면 ETC 활동, 동적 인 조립 및 분해, 그리고 이것이 미토콘드리아 구조와 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 완성도를 얻을 수 있습니다. 이 작품은 또한 이러한 기술의 한계를 논의 할 것입니다. 요약하면, 네이티브 PAGE 기술은 면역 블로 팅, IGA, 전기 분해가 뒤 따르는 것으로 미토콘드리아 ETC 수퍼 콤플렉스의 기능과 구성을 조사하는 강력한 방법입니다.

미토콘드리아 supercomplexes를 시각화하기 위해 쥐에서 새로 격리 mitochondria가 사용되었다 17 , 18 . Mitochondrial supercomplexes는 일부 연구자들에게는 용인 될 수 있지만, 분해 및 해동의 반복주기에 민감합니다. 보관을 위해 동결이 필요한 경우 최상의 결과를 얻으려면 샘플을 한 번 이상 동결 및 해동하지 않아야합니다. 미토콘드리아 ETC 복합체를 BN PAGE로 시각화하기 위해 분리 된 심장 미토콘드리아의 단백질 100 μg을 4-10 % 젤에 로딩했다 ( 그림 1A ). 로딩 및 음극 완충액의 쿠마시 스테인은 실행 중 단백질 복합체를 표지하기에 충분합니다. 대비를 디지털 방식으로 증가시킨 후에 수퍼 콤플렉스가 나타납니다 (표시되지 않음). CN PAGE의 경우 20 μgf 단백질은 분리 된 미토콘드리아로부터 3 내지 8 % CN 겔 상에 로딩되고 분리되었다 ( 도 1B ). CN PAGE를 Coomassie로 염색하고 단백질 복합체를 시각화하기 위해 제거 하였다. 명암을 디지털 방식으로 증가시킨 후에, Cx-I의 단량체보다 큰 분자량을 갖는 여러 단백질 복합체가 나타났다 ( 그림 1B , 오른쪽). 사용 된 AAB의 농도는 가장 큰 수퍼 콤플렉스가 우물로부터 단지 겔로 들어가는 것을 허용했습니다. 그러나, 3 % 미만의 AAB의 그래디언트로 끝나는 겔은 이동 또는 밴드 또는 레인을 절제하기에 충분히 안정하지 못합니다. 또한, 3-8 % CN 젤의 상부 부분에있는 AAB의 낮은 농도는 단백질 복합체의 일부 이동성을 유지합니다. 이는 고유의 전기 분해를 고려할 때 중요합니다 19 . Cx-I의 단량체 및 수퍼 콤플렉스 및 C의 단량체, 이합체 및 수퍼 콤플렉스xV는 효소 적으로 활성이며 IGA ( 그림 1C- F )로 시각화 할 수 있습니다. 이 분석은 분리 된 심장 미토콘드리아에서 Cx-1과 Cx-V가 각각의 단량체보다 큰 단백질 복합체에 존재 함을 보여줍니다. Cx-I에 대한 IGA 분석에서 NADH는 산화되고 전자는 nitroblue tetrazolium을 감소시키기 위해 전달된다. 이것은 Cx-I 단량체와 Cx-I 함유 호흡기 / 수퍼 콤플렉스의 분자량에서 국부적 인 청색을 낳는다 ( 그림 1C ). Cx-V의 활성은 F1 서브 유닛이 ATP를 가수 분해하는 능력으로부터 평가되며, CN 또는 BN 겔을 사용하여 수행 될 수있다 ( 도 1D- F ). 이 반응에서 생성 된 ADP는 납과 상호 작용하여 Cx-V 단량체, 이합체, 신타 소솜 및 하위 복합체 (Cx-V의 조립되지 않은 F1 부분 일 가능성이 높음)의 수준에서 흰색 침전물을 생성합니다. 올리고 마이신은 l이 밴드가 abeling되어 Cx-V가 포함되어 있음을 확인했습니다 ( 그림 1E ). 여기에 설명 된 모든 실험에서 양성 이온 성 세제 인 lauryl maltoside는 2 μg / 1 μg의 단백질 농도로 사용되었으며, 이는 일관되고 재현성있는 결과를 제공하면서 수퍼 콤플렉스를 보존하는 가능한 최고 농도입니다 ( 그림 1F ). 그러나 라 우릴 말 토 시드의 효과는 로트 번호, 저장 조건 및 나이에 달려 있습니다. 따라서 한 실험실에서 사용 된 정확한 농도는 원고에서보고 된 농도와 반드시 동일하지는 않습니다. 세제의 적절한 농도는 멤브레인을 가용화하지만 복합체와 수퍼 콤플렉스는 손상시키지 않고 다양한 농도의 라 우릴 말 토 시드 ( 그림 1F )를 사용하여 결정해야합니다. CN PAGE의 경우, 웰당 40 μL의 총 샘플 부피가 준비되었다여기에 단백질 / 세제 비율 1 μg / 2 μg 또는 세제 / 버퍼 비율 1 μg / 1 μL (1.9 mM과 동일)가됩니다. 40 μL에서 미니 젤의 각 웰당 30 μL가 적용되었습니다. 나머지는 로딩 대조군 인 VDAC의 검출을위한 분액으로 사용되었다 ( 도 2D ). 면역 블로 팅의 경우 CN이 BN PAGE보다 선호되는데, 그 이유는 단백질이 항체에 의한 검출을 방해 할 수있는 쿠마시 (Coomassie)가 없기 때문입니다. 그림 2 는 분리 된 심장, 간 및 뇌 미토콘드리아의 Cx-I 및 Cx-V 단백질 NDUFB6 및 ATP5A를 함유 한 수퍼 콤플렉스 검출을 보여줍니다. 전달 후 면역 블 롯팅 전의 Ponceau S 라벨링은 분자량 마커를 표시하고 단백질 로딩을 제어하는 ​​데 사용할 수 있습니다 ( 그림 2A ). 이것은 nitrocellul에 ETC의 단백질 복합체의 단량체를 시각화합니다그러나 Ponceau S 라벨링은 면역 블로 팅으로 얻을 수있는 미토콘드리아 supercomplexes ( 그림 2A )의 시각화에 항상 충분하지 않습니다. Cx-I는 그 자체로 이합체 및 4 량체로 조립되지 않지만 Cx-III 및 Cx-IV 14 , 20 , 21 과 함께 점점 더 높은 분자량의 수퍼 콤플렉스를 형성한다. 여기서 NDUFB6에 대한 항체를 사용하여 심장에서 채취 한 시료가 간 또는 뇌에서 미토콘드리아보다 더 많은 Cx-I 단량체와 고 분자량 수퍼 콤플렉스 (상위 밴드)를 포함한다는 것을 보여줍니다 ( 그림 2B ). mid-range respirasome supercomplexes의 양은 다른 조직보다 심장에서 훨씬 높았다 ( 그림 2B ). 항 -ATP5A 항체를 사용하여,Cx-V의 단량체는 모든 조직으로부터 미토콘드리아에서 검출 가능하지만, 심장 미토콘드리아에서 명확히 볼 수있는 이량 체 (D) 및 큰 수퍼 콤플렉스 (SC)를 나타내는 밴드의 뚜렷한 패턴은 간 및 뇌 미토콘드리아에서 현저하지 않다 도 2c ). 면역 블롯의 과다 노출 (1 분 대 20 초)은 여러 가지 Cx-V- 함유 수퍼 콤플렉스를 보여 주며, 이는 테트라 머 및 신타 소솜을 나타낼 수 있습니다 ( 그림 2C ). 심장, 간, 및 뇌 미토콘드리아에서 Cx-V- 함유 단백질 복합체의 이러한 패턴은 조직 특이성 일 수 있고 아직 탐구되지 않은 차이를 나타낸다. 이러한 도말의 단백질 로딩은 Ponceau S 염색 및 SDS PAGE에 의한 상기 분취 량의 VDAC 검출에 의해 수행 될 수있다 ( 도 2D 에서 입증 됨). 모든 항생제가 아님다이는 천연 PAGE 후 단백질 복합체의 4 차 또는 3 차 구조 내의 단백질을 검출하는데 적합하다. 이 문제를 극복하기 위해 네이티브 젤의 전체 및 부분 레인을 2 차원 (2D 겔, 데모 용 참조 13 참조)의 변성 젤에 장착 할 수 있습니다. 2D 전기 영동은 초분자 복합체에서 단백질을 시각화하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 그림 2 에서 볼 수 있듯이 수퍼 콤플렉스는 다양한 양으로 존재하며 수퍼 콤플렉스의 개별 단백질 신호는 두 번째 변성 차원에서 시각화하기 어려울 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 네이티브 젤로부터 단백질 복합체의 전기 용출이 여기에 사용되었습니다. 이것은 다중 레인에서 수퍼 콤플렉스 (supercomplex) 밴드를 분리하여 향후 연구를위한 더 많은 재료를 생산합니다. 전기 분해를 사용할 때, IGA에 의해 확인되고 BN PAGE에서 시각화 된 관심 밴드 만이 excised; 이 젤 조각으로부터 얻은 단백질은 겔로부터의 용출에 의해 추가로 정제됩니다. 도 3A 는 단량체를 나타내는 밴드가 전기 분해를 위해 절제 된 BN PAGE의 레인을 도시한다. 전기 분해 후 단량체의 Cx-V 활성을 평가하기 위해 용출액을 두 번째 CN PAGE에 적용했다. 단량체의 용리액은 여전히 ​​효소 적으로 활성 인 Cx-V를 포함하고 있지만 부 콤플렉스도 나타납니다 ( 그림 3B ). 네이티브 CN PAGE ( 그림 3C ) 또는 변성 SDS 페이지 ( 그림 3D ) 후 eluate의 실버 얼룩은 용출액에 단백질의 존재를 나타내며 ATP5A에 대한 immunoblotting은 두 샘플 모두에서 Cx-V의 존재를 나타냅니다 ( 그림 3D ). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55738/55738fig1.jpg" /> 그림 1 : Mitoch의 시각화ondrial Supercomplexes. ( A ) 분리 된 심장 미토콘드리아의 샘플을 가지고 4-10 % BN maxi-gel 2 차선. 동일한 샘플의 분취 량을 두 개의 레인에서 웰당 100 ㎍의 단백질로 처리 하였다. ETC의 단백질 복합체 I, II, III, IV 및 V의 단량체가 명확하게 보여지고 겔의 오른쪽에 표시됩니다. ( B ) CN PAGE에서 심장 미토콘드리아 샘플 (1과 2, 20 μg protein / lane)을 분리하고 쿠마시 염색으로 시각화 하였다. SC는 젤의 윗 부분의 확대와 디지털 향상 후 supercomplexes의 위치를 ​​나타냅니다 (영역은 빨간색 화살표로 표시됨). ( C ) 미토콘드리아 단백질 20 μg을 3-8 % CN PAGE에서 분리하고 Cx-I IGA로 처리 하였다. 확대되고 디지털로 강화 된 이미지는 Cx-I 반응 생성물의 밴드를 보여줍니다. ( D ) 미토콘드리아 단백질 20 μg을 3-8 % BN PAGE에서 분리하고 Cx-V IGA로 가공 하였다. 매그 니 피<html> Ex 및 디지털 방식으로 강화 된 이미지는 Cx-V 반응 생성물의 밴드를 보여줍니다. ( E ) 미토콘드리아 단백질 50 μg을 5-15 % CN PAGE에서 분리하고 Cx-V IGA (-) 및 (+) 5 μg / mL oligomycin (Oligo)으로 가공 하였다. ( F ) 미토콘드리아 단백질 (20 μg / lane)을 젤 상단에 표시된대로 1 μg의 라 우릴 말토 사이드 (lauryl maltoside) 2 - 6 μg로 가용화하고 3-8 % CN 겔에서 분리 한 후 Cx- V IGA. 모든 이미지는 밝은 테이블 ( A - C ) 또는 검은 색 표면 ( D - F ) 중 하나를 사용하여 촬영되었습니다. 카메라 사양은 재료 표에 나와 있습니다. 분자량 마커 (MW)의 위치는 모든 패널의 왼쪽에 표시됩니다. 약어 : D = 이량 체; F 1 * = Cx-V의 서브 콤플렉스; LM = 라 우릴 말 토 시드; m = 분자량 마커; M = 단량체; SC = 수퍼 콤플렉스.g1large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55738/55738fig2.jpg" /> 그림 2 : Immunoblotting에 의한 Mitochondrial Supercomplexes의 검출. 심장 (H), 간 (Li) 및 뇌 (B) 미토콘드리아의 단백질 20 μg을 3-8 % CN PAGE에서 분리하고 니트로 셀룰로오스 막에 옮겼다. ( A ) 막의 Ponceau S 염색은 단백질 복합체와 분자량 마커 (m)의 존재를 나타냅니다. 파란색 화살표는 젤의 상단을 가리 킵니다. ( B ) Cx-1 단백질 인 NDUFB6를 (A)에 나타낸 얼룩에서 면역 표지 하였다 (1 분 노출 시간). ( C ) 항 -ATP5A 항체로 Cx-V를 시각화 하였다 (표시된 바와 같이 20 초 및 1 분 노출). (B)와 (C)의 빨간색 화살표는 확대 된 영역을 표시하고 디지털로 확대 표시됩니다Cx-I- 및 Cx-V- 함유 수퍼 콤플렉스의 라이 제이션, 및 파란색 화살표는 겔의 상부를 가리킨다. ( D ) Ponceau S 및 (A), (B) 및 (C)에 사용 된 각 추출물의 VDAC 분취 량을 SDS PAGE로 분리하고 니트로 셀룰로오스로 옮긴 면역 표지. 약어 : M = Cx-I 또는 Cx-V의 단량체, D = Cx-V의 이량 체, SC = Cx-I 또는 Cx-V를 함유하는 수퍼 콤플렉스. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55738/55738fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55738/55738fig3.jpg" /> 그림 3 : Cx-V의 전기 분해. ( A ) 미토콘드리아 샘플의 BN 페이지. 박스 밴드는 excised 및 electroeluted Cx-V의 단량체를 나타냅니다. ( B ) 용출액을 CN PAGE에 적용한 후, Cx-V에 대한 IGA는 단량체 (M)및 Cx-V의 F1을 함유하는 서브 콤플렉스를 포함한다. ( C ) 용출액의 CN PAGE의은 염색은 단량체 (M)를 나타낸다. ( D ) 변성 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)의 ATP5A (오른쪽 패널)에 대한 은색 염색 (왼쪽 패널) 및 면역 블롯. 용출액의 PAGE는 Cx-V의 존재를 나타낸다. SDS 페이지는 다른 곳에서 출판 된 프로토콜을 참조하십시오. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55738/55738fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

analyzing-supercomplexes-mitochondrial-electron-transport-chain-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.0K 조회수.  University of Rochester.  이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다. 

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis proposed and tested was that a regular maternal exercise of a sow during pregnancy would increase the mitochondrial efficiency of offspring heart bioenergetics. This hypothesis was tested by isolating mitochondria using a mild-isolation procedure to assess mitochondrial ETC and supercomplex profiles. The procedure described here allowed for the processing of previously frozen archived heart tissues and eliminated the necessity of fresh mitochondria preparation for the assessment of mitochondrial ETC complexes, supercomplexes, and ETC complex activity profiles. This protocol describes the optimal ETC protein complex measurement in multiplexed antibody-based immunoblotting and super complex assessment using blue-native gel electrophoresis.

Preparation of mitochondria-enriched samples from previously frozen archived solid tissues allowed the investigators to perform both functional and analytical assessments of mitochondria in various experimental modalities. This study demonstrates how to prepare mitochondria-enriched preparations from frozen heart tissue and perform analytical assessments of mitochondria.

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...