في مختبرنا ، نحقق في نقل الإلكترون خارج الخلية ، أو EET ، في بكتيريا مثل lactiplantibacillus plantarum ، وهي بكتيريا مخمرة مهمة في الصناعات الغذائية. في EET ، تنقل الخلية الإلكترونات إلى صولجان إلكتروني خارج الخلية ، مثل قطب كهربائي في نظام كيميائي كهربائي حيوي. نريد أن نفهم وهندس EET للتطبيقات في الاستشعار الحيوي والتحفيز الحيوي وتخمير الطعام.
اكتشفنا أن نفق جبال الألب يمكنه شراء التيار من خلال EET في وجود quinone مثل DHNA. تجدد هذه العملية NAD plus ، وتسريع الخسارة الإجمالية لمسارات التخمير الأولية ، وتعزز نمو الخلايا. علاوة على ذلك ، نجد أن مشتقات الكينون المتنوعة ، بخلاف DHNA ، يمكن أن تتوسط أيضا في EET في L plantarum.
يتطلب التحقيق في EET بوساطة إعدادات كيميائية حيوية متخصصة. على وجه التحديد، نستخدم نظاما كهروكيميائيا حيويا ثلاثي الأقطاب الكهربائية وغرفتين لمنع الحديث المتبادل بين التفاعلات الأنودية والتفاعلات الكاثودية. نستخدم أيضا مجال كربوني ، قطب كهربائي يعمل به مساحة سطح كبيرة لتعزيز نقل الإلكترون من وسطاء الإلكترون.
يمكن أن يكون لعملنا الذي يستكشف مسارات EET في L plantarum وكيف تتفاعل هذه المسارات مع التمثيل الغذائي المخمر تطبيقات مفيدة في الصناعات الغذائية. نحن نعلم أن EET و L plantarum يغير التدفق الأيضي من خلال التخمير ، ويمكن التلاعب بذلك للحصول على تطبيقات مفيدة وتغيير نكهات الطعام وإنتاج مواد كيميائية قيمة في التخمير الكهربائي. في المستقبل ، سنستمر في زيادة معرفتنا الأساسية ب EET ومتابعة تطبيقات EET الجديدة في الكائنات الحية مثل L plantarum.
نخطط لهندسة البروتينات في مسار EET ، مما سيسمح لنا بالتحكم بشكل أكبر في EET للتطبيقات في التخمير الكهربائي والاستشعار الحيوي. للبدء ، قم بقطع أسلاك التيتانيوم بقطر ملليمتر واحد من الرمل للعمل في أقطاب مضادة ، مع ورق صنفرة أكسيد الألومنيوم حتى يصبح لامعا بشكل متساو. باستخدام كماشة ، قم بثني أحد طرفي كل سلك قطب كهربائي يعمل في خطاف صغير.
حرك لباد كربون بحجم 16 سم مربع على كل سلك كهربائي يعمل ، ونسج السلك داخل وخارج لباد الكربون مرة واحدة وسحب الجولة لأسفل السلك حتى يتم تثبيتها على الخطاف. قم بتأمين أقطاب مواجهة العمل في أغطية GL 45 عن طريق ثقب الحاجز المطاطي بالسلك وسحبه من خلال بضعة سنتيمترات. لبناء مفاعلات مقترنة ، قم بتجميع الحلقة O وضع غشاء تبادل كاتيوني مقطوع مسبقا ، منقوعا مسبقا في الماء في الحلقة O المجمعة.
ضع الحلقة O مع الغشاء بين الفتحات السفلية الكبيرة لزجاجتي مفاعل مقترنتين. قم بتأمين زجاجات زوج المفاعل وحلقة بالغشاء بمشبك المفصل. قم بإسقاط قضيب تقليب مغناطيسي في كل غرفة أنوديك قبل إغلاق جميع الفتحات الصغيرة في الجزء العلوي من كل زجاجة بأغطية GL14 ، مزودة بحاجز مطاطي.
املأ كل زجاجة مفاعل ب 110 مل من الماء منزوع الأيونات. أدخل الأغطية المزودة بقطب كهربائي دائري من اللباد الكربوني واضغط برفق على الجزء العلوي من اللباد الدائري لإبقائه مثبتا على الخطاف. أغلق الزجاجات بغطاء GL45 المناسب المزود بقطب كهربائي.
مفاعلات الأوتوكلاف المملوءة بالماء وأغطية القطب الكهربائي GL14. في ظل ظروف معقمة ، اكشط نبات اللبن abasilisk plantarum من أعلى مخزون الجلسرين ، وقم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من الطلب التجاري rugosa sharp ، أو MRS متوسط. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، دون اهتزاز.
للبدء ، في خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، تخلص من الماء المعقم من مفاعلات النظام الكهروكيميائي الحيوي. املأ الغرف الكاثودية ب 110 مل من الغرف المتوسطة M9 المعقمة والأودية ب 110 مل من MCDM المحضرة حديثا. استبدل غطاء GL14 واحدا من الغرفة الأنودية بغطاء الأوتوكلاف GL14 بحلقة سقف من السيليكون.
رش الأقطاب الكهربائية المرجعية المحضرة بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعها من خلال غطاء القطب الكهربائي في كل غرفة أنوديك. شد جميع الأغطية والمشابك لتجنب التسرب. لتوصيل المفاعلات بنظام مضخة المياه ، أولا ، ضع كل مفاعل على منصة قضيب التحريك المناسبة.
ثم قم بتوصيل حنفيات سترة الماء لكل مفاعل بالتالي بأنابيب مطاطية ، وتوصيل المفاعلات الطرفية بأنابيب التدفق والتدفق لمضخة المياه. املأ المضخة بالماء وأضف أربع إلى ست قطرات من مكيف المياه. قم بتشغيل نظام المضخة واضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية.
ابدأ تشغيل المضخة وراقب تدفق المياه عبر جميع سترات المياه في المفاعل ، مع التأكد من عدم وجود تسريبات. قم بتشغيل منصات التقليب واضبطها على التقليب المستمر عند 220 دورة في الدقيقة. لربط المفاعلات بخطوط الغاز التي تجنيب النيتروجين ، أولا ، قم بتوصيل مرشح هواء بإبرة قياس 22 وأدخل الإبرة من خلال الحاجز العلوي لغرفة أنوديك المفاعل في الوسائط.
أدخل إبرة قياس 18 في الحاجز العلوي لغرفة أنوديك المفاعل ، ثم قم بتوصيل خط الغاز من مصدر النيتروجين بفلتر الهواء وافتح الصمام للسماح للغاز بالتدفق برفق عبر المفاعل. لربط المفاعلات الحيوية بخيوط البوتينسيوستات ، قم بتوصيل عداد العمل وخيوط مشبك التمساح الكهربائي المرجعي من potentiostat إلى الأقطاب الكهربائية المقابلة لها. بعد إدخال جميع المعلمات ، اضغط على مثلث البداية الأخضر لبدء التشغيل.
راقب آثار جهد الدائرة المفتوحة لبضع دقائق للتأكد من قراءة جميع المفاعلات بشكل إيجابي. وقريبة من بعضها البعض بإشارة ثابتة. في ظل ظروف معقمة ، استزراع فرعي لمزرعة L plantarum المزروعة سابقا من واحد إلى 200 في 50 مل من MMRS.
قم بتنمية الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، دون اهتزاز. للبدء ، قم بإزالة ثقافة L plantarum المزروعة في MMRS من الحاضنة. انقل المزرعة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل في ظروف معقمة وضع الأنبوب على الجليد.
الطرد المركزي للثقافة عند 4 ، 000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 50 مل من PBS. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في PBS البارد إلى الكثافة البصرية عند 600 نانومتر من 11.
قم بتحميل ملليلترين من الخلايا المعلقة في حقنة سعة ثلاثة ملليلتر ، مزودة بإبرة. في محطة المفاعل ، قم بإزالة غطاء حقنة خلية وأدخل الإبرة في الجزء العلوي من غرفة أنوديك المفاعل. بمجرد وضع جميع المحاقن في مكانها ، اضغط على المكابسات لحقن الخلايا.
سجل وقت الحقن من تتبع قياس التيار الزمني. اسمح للتيار بالاستقرار على التتبع لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. في النظام الكهروكيميائي الحيوي ، قم بتسمية المفاعلات التجريبية على أنها بالإضافة إلى DHNA ، ومفاعلات التحكم في المذيبات على أنها ناقص DHNA.
قم بإزالة غطاء حقنة محملة ب 110 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل مليلتر DHNA ، وأدخلها في الجزء العلوي من الحجرة الأنودية ، المعينة على أنها بالإضافة إلى DHNA. أدخل حقنة محملة ب 110 ميكرولتر من DMSO في الغرفة الأنودية ، المعينة على أنها ناقص DHNA. باستخدام حقنة ثلاثة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 21 ، قم بإزالة ملليلترين من الوسائط من كل غرفة أنوديك من خلال الحاجز الصغير غير المستخدم.
انقل العينات إلى صفيحة بئر عميقة 24 لقياس الأس الهيدروجيني لنقطة زمنية الصفر في الساعة. اضغط على غطاسات محاقن DHNA و DMSO للحقن في المفاعلات. سجل وقت الحقن من تتبع قياس التيار الزمني.
تخلص من جميع المحاقن والإبر. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة ملليلترين من الوسائط من كل غرفة أنوديك كما هو موضح سابقا ، وانقلها إلى صفيحة بئر عميقة 24 لقياسات الأس الهيدروجيني لمدة 24 ساعة. قم بتشغيل الفولتامتر الدوري للنقطة الزمنية 24 ساعة.
قم بقياس وتسجيل الأس الهيدروجيني لعينات 24 ساعة من كل مفاعل. وصلت الكثافة الحالية الناتجة عن نقل الإلكترون خارج الخلية إلى ذروتها تبلغ حوالي 132 ميكرو أمبير لكل سنتيمتر مربع ، بعد ثماني ساعات من حقن DHNA. في المقابل ، أدى حقن DMSO إلى كثافة تيار ضئيلة.
أظهرت بيانات قياس الجهد الدوري زيادة ملحوظة في التيار التأكسدي عند 50 مللي فولت في وجود L plantarum مع DHNA ، مقارنة ب L plantarum مع DMSO وزيادة بنسبة 256٪ في كثافة التيار عند 300 مللي فولت ، مقارنة بأثر DHNA اللاأحيائي. أدى نقل الإلكترون خارج الخلية إلى انخفاض ملحوظ في الأس الهيدروجيني إلى متوسط 3.33 على مدار 24 ساعة في العينات التي تحتوي على L plantarum و DHNA ، بينما كان متوسط الأس الهيدروجيني للعينات التي تحتوي على L plantarum و DMSO 6.50.
