시스템 생물학은 감염 모델의 생물학적 네트워크와 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 반면, 합성 생물학은 정밀 치료를 가능하게 합니다. 우리는 리슈마니아 주요 감염의 면역 대사와 질병 해결을 위한 생합성 회로의 잠재력을 탐구하여 면역 치료제에 혁명을 일으키고 있습니다. 최근 몇 년 동안 합성생물학은 리슈만편모충증을 퇴치하기 위한 새롭고 효과적인 전략 개발에 큰 가능성을 보여주었습니다.
최근 개발 중 일부는 엔지니어링 합성 사이토카인, 쌍안정 합성 회로 CRISPR-Cas9 및 합성 펩타이드 분야에서 치료제로 연구되고 있습니다. 우리의 프로토콜은 기생충의 생존을 위해 기생충에 의해 조절되는 숙주 단백질을 표적으로 합니다. 따라서 우리는 기생충뿐만 아니라 숙주에 대한 회로의 영향을 연구합니다.
또한, 우리는 호스트에서 전달될 때 직교성 및 모듈성 기능을 해결하는 데 대한 합성 회로의 효과를 연구했습니다. 시작하려면 컴퓨터에서 TinkerCell 소프트웨어를 열고 부품 탭을 클릭하십시오. 라이브러리에서 CMV 프로모터 구성 요소를 선택하고 캔버스에 배치하여 합성 회로 내의 거대세포바이러스 프로모터를 기호화합니다.
그런 다음 테트라사이클린 연산자와 유사한 억제자 결합 부위를 검색하고 캔버스의 프로모터에 인접하게 배치하여 CMV 프로모터와 통합합니다. 내부 리보솜 진입 부위와 코딩 영역을 캔버스로 끌어다 놓아 기존 유전 구성 요소와 통합합니다. 코딩 영역의 이름을 tetracycline-responsive repressor로 바꿉니다.
합성 부분의 구성을 용이하게 하기 위해 이러한 유전 요소를 병합합니다. 돼지 테스코바이러스 12A에 의해 절단될 수 있는 스페이서 영역을 캔버스에 통합합니다. 추가 코딩 영역인 석시네이트 탈수소효소(succinate dehydrogenase) 또는 SDHA를 도입하여 합성 구조에서 관심 유전자를 나타내고 다른 요소와 통합합니다.
SDHA 코딩 영역에 인접하여 세포 단백질 분해 효소 돼지 테쇼바이러스 12A에 의해 절단 가능한 다른 스페이서 영역을 통합합니다. 리포터 유전자를 나타내는 코딩 영역을 도입하고 이를 GFP로 구조체에 라벨링합니다. GFP 옆에 종결자를 추가합니다.
기능적 유전 회로의 형성을 확인하려면 회로의 아무 부분이나 클릭하십시오. 클릭하면 회로가 빨간색으로 나타납니다. reaction 탭에서 tetracycline-responsive repressor, SDHA 및 GFP에 조절 속도를 할당하여 합성 회로 내의 translation 반응을 설명합니다.
부품 탭에서 작은 분자를 추가하고 이름을 doxycycline으로 지정합니다. 독시사이클린에 파동 기능을 할당하려면 parts and connection 탭에서 input을 선택하고 wave input을 클릭합니다. reaction 탭에서 repression reaction을 클릭합니다.
캔버스에서 dox와 테트라사이클린 반응 억제제 사이의 반응 속도를 드래그 앤 드롭합니다. dox와 tetracycline responsive repressor 사이의 반응 역학을 설정하려면 dox에서 파동 함수 아이콘을 두 번 클릭하고 doxycycline.sin을 조정하십시오. 진폭을 10으로 변경합니다.
테트라사이클린 반응성 억제 인자와 억제 인자 결합 부위 사이의 전사 조절 반응을 구현하려면 반응 탭에서 반응을 선택하고 테트라사이클린 반응 억제자와 테트라사이클린 연산자 사이의 캔버스에 놓습니다. 각 성분과 반응을 두 번 클릭하여 시뮬레이션을 위한 초기 농도와 매개변수를 설정합니다. 시뮬레이션을 클릭하고, 결정론을 선택하고, 100개의 시간 단위에 대해 회로를 시뮬레이션합니다.
제어판에서 시뮬레이션 그래프를 조정하고 SDHA 및 테트라사이클린 반응성 억제 단백질에 대한 그래프 패턴을 관찰합니다. 표준 생물학적 부분의 레지스트리를 연 다음 검색을 클릭하고 유전 구성 요소의 이름을 입력하십시오. CMV 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 얻으려면 get part sequence를 클릭하고 파일을 텍스트 파일로 저장하십시오.
SDHA의 단백질 코딩 염기서열을 얻으려면 NCBI를 열고 검색 창 옆의 드롭다운에서 뉴클레오티드를 선택합니다. succinate dehydrogenase 및 Mus musculus를 입력하고 뉴클레오티드 염기서열을 검색합니다. CDS 옵션을 클릭하여 SDHA의 코딩 시퀀스를 가져오고 시퀀스를 텍스트 파일에 저장합니다.
모든 유전적 조절 부분의 뉴클레오티드 염기서열을 하나의 파일에 순차적으로 병합합니다. Kozak 염기서열 바로 뒤에 시작 코돈 ATG를 추가하고 초기 폴리펩티드의 형성을 방지하기 위해 내부 정지 코돈을 제거합니다. Expasy 웹 사이트를 열고 뉴클레오티드 염기서열을 붙여넣습니다.
시퀀스 변환 옵션을 클릭한 다음 5개의 프라임 3 프라임 프레임 1을 선택하고 정지 코돈을 제거합니다. 먼저 섭씨 37도에서 90% 밀도가 달성될 때까지 RAW264.7 세포를 배양합니다. 유도 합성 회로의 기생충 제거 효과를 결정하기 위해 다음 샘플을 준비하십시오.
264.7제곱센티미터 플라스크에서 RAW25 셀을 긁어냅니다. 셀 현탁액을 300G에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 DMEM 완전 배지 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 10 마이크로리터의 재부유 셀 현탁액을 100마이크로리터 튜브에 옮깁니다.
10 마이크로 리터의 0.5 % 트리판 블루를 세포에 넣고 잘 섞습니다. 10 마이크로리터의 세포와 트리판 블루 믹스를 세포 계수 챔버 슬라이드에 넣고 4개의 챔버에서 세포 계수를 취합니다. 덮개에서 웰당 4개의 세포의 거듭제곱으로 2회 10을 플레이트하고 바닥 96웰 플레이트를 슬립하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 24시간 동안 배양합니다.
6시간 동안 감염된 샘플을 준비하기 위해 7, 273G에서 10분 동안 1밀리리터의 고정상 리슈마니아 주요 프로마스티고테를 원심분리하고 펠릿을 500마이크로리터의 DMEM 완전한 매체에 다시 현탁시킵니다. 계산 후 커버 슬립 하단 96웰 플레이트에 5개의 L.major promastigotes의 거듭제곱에 2 곱하기 10을 추가합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 6시간 동안 세포를 배양합니다.
배양 후 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. IMT 및 IMTI 샘플을 준비하려면 6, 12, 18 및 24시간 동안 5개의 L.major promastigotes의 거듭제곱으로 10의 2배를 성장시킵니다. 1.5 밀리리터 튜브에 24 마이크로리터의 환원 혈청 배지와 1 마이크로그램의 합성 회로 플라스미드를 추가합니다.
다른 1.5밀리리터 튜브에 24마이크로리터의 환원 혈청 배지와 1마이크로리터의 폴리에틸렌민(PEI)을 추가합니다. 최소 10회 피펫팅하여 잘 섞고 실온에서 5분 동안 배양합니다. PEI 혼합물을 DNA가 들어있는 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 잘 섞는다.
튜브를 10분 동안 배양합니다. 96웰 커버 슬립 바닥판의 웰에서 매체를 버리고 PBS로 셀을 세 번 세척합니다. 피펫을 사용하여 DNA-PEI 혼합물을 세포에 한 방울 떨어뜨리고 플레이트를 부드럽게 흔듭니다.
섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 3시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터의 신선한 환원 혈청 배지를 세포에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔든 다음 24 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 5 시간 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 버리십시오.
PBS로 세포를 2회 세척한 후 유전과 독시사이클린을 함유한 DMEM complete media를 세포에 추가하고 24시간 동안 배양합니다. 합성 회로의 시뮬레이션은 SDHA와 테트라사이클린 억제기 모두에서 진동 역학을 밝혀냈습니다. Escherichia coli DH5-alpha에 합성 회로를 도입한 결과, 카나마이신에 대한 내성을 나타내는 형질전환된 콜로니가 생성되었으며, 이는 효율적인 형질전환을 나타냅니다.
합성 회로를 사용한 형질주입과 독시사이클린을 사용한 유도는 시간이 지남에 따라 IMT 세포에서 GFP 발현을 크게 증가시켰습니다. 형질주입 및 독시사이클린 유도 후, 감염된 대식세포에서 세포 내 기생충 부하의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 인터루킨 10과 인터루킨 12의 사이토카인 수치는 감염 후 6시간에 가장 높았으며, 형질주입 및 합성 회로 유도 시에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.
24시간 IMTI 샘플에서 종양괴사인자 알파, 인터페론 감마, 형질전환성장인자 베타의 유의한 증가가 관찰되었는데, 이는 전염증성 사이토카인의 상향조절을 나타냅니다.
