A biologia de sistemas oferece informações sobre as redes biológicas e o mecanismo em modelos de infecção, enquanto a biologia sintética permite a terapia de precisão. Estamos explorando o imunometabolismo na infecção por Leishmania major e o potencial dos circuitos biossintéticos para a resolução da doença, revolucionando a imunoterapia. Nos últimos anos, a biologia sintética tem se mostrado muito promissora para o desenvolvimento de novas e eficazes estratégias de combate à Leishmaniose.
Alguns dos desenvolvimentos recentes estão no campo da engenharia de citocinas sintéticas, circuito sintético biestável CRISPR-Cas9 e peptídeos sintéticos estão sendo investigados como terapêuticos. Nosso protocolo tem como alvo a proteína do hospedeiro, que é modulada pelo parasita para sua sobrevivência. Assim, estudamos o efeito no circuito não apenas no parasita, mas também no hospedeiro.
Além disso, estudamos o efeito do circuito sintético na abordagem da ortogonalidade e da função de modularidade na entrega no hospedeiro. Para começar, em um computador, abra o software TinkerCell e clique na guia de peças. Selecione o componente promotor do CMV na biblioteca e coloque-o na tela para simbolizar o promotor do citomegalovírus dentro do circuito sintético.
Em seguida, recupere o local de ligação do repressor análogo ao operador da tetraciclina e posicione-o adjacente ao promotor na tela, integrando-se ao promotor do CMV. Arraste e solte os locais de entrada do ribossomo interno e a região de codificação na tela, integrando-os aos componentes genéticos existentes. Renomeie a região de codificação como repressor responsivo à tetraciclina.
Mescle esses elementos genéticos para facilitar a construção das peças sintéticas. Incorpore uma região espaçadora clivável pelo teschovírus suíno 12A na tela. Introduzir uma região codificante adicional, succinato desidrogenase ou SDHA, representando o gene de interesse na construção sintética e integrando-o com os outros elementos.
Adjacente à região codificadora SDHA, integra outra região espaçadora clivável por protease celular porcina teschovírus 12A. Introduza uma região codificante que represente o gene repórter e rotule-a como GFP na construção. Ao lado de GFP, anexe um terminador.
Para verificar a formação de um circuito genético funcional, clique em qualquer parte do circuito. O circuito aparece vermelho ao clicar. Na guia de reação, atribua taxas regulatórias ao repressor responsivo à tetraciclina, SDHA e GFP para delinear a reação de tradução dentro do circuito sintético.
Adicione uma pequena molécula da guia de peças e nomeie-a como doxiciclina. Para atribuir uma função de onda à doxiciclina, na guia de peças e conexão, selecione a entrada e clique na entrada da onda. Na guia de reação, clique em reação de repressão.
Arraste e solte a taxa de reação na tela entre o repressor responsivo a dox e tetraciclina. Para definir a cinética de reação entre dox e repressor responsivo à tetraciclina, clique duas vezes no ícone da função de onda em dox e ajuste doxiciclina.sin. amplitude para 10.
Para implementar a reação reguladora transcricional entre a proteína repressora responsiva à tetraciclina e o local de ligação do repressor, selecione a reação na guia de reação e coloque-a na tela entre o repressor responsivo à tetraciclina e o operador da tetraciclina. Clique duas vezes em cada componente e reação para definir uma concentração inicial e um parâmetro para simulação. Clique em simulação, escolha determinística e simule o circuito para 100 unidades de tempo.
Ajuste o gráfico de simulação no painel de controle e observe o padrão do gráfico para SDHA e proteínas repressivas responsivas à tetraciclina. Abra o registro de peças biológicas padrão, clique em pesquisar e digite o nome do componente genético. Para obter a sequência de nucleotídeos do promotor do CMV, clique na sequência de partes e salve o arquivo como um arquivo de texto.
Para obter a sequência codificadora de proteínas do SDHA, abra o NCBI e escolha nucleotídeo no menu suspenso ao lado da janela de pesquisa. Digite succinato desidrogenase e Mus musculus e procure a sequência de nucleotídeos. Clique na opção CDS para obter a sequência de codificação do SDHA e salve a sequência em um arquivo de texto.
Mescle sequencialmente a sequência de nucleotídeos de todas as partes reguladoras genéticas em um arquivo. Adicione um códon de início ATG logo após a sequência de Kozak e remova os códons de parada internos para evitar a formação de polipeptídeos nascentes. Abra o site da Expasy e cole a sequência de nucleotídeos.
Clique na opção de translação da sequência, selecione cinco primos três primos quadro um e remova os códons de parada. Para começar, cultive células RAW264.7 a 37 graus Celsius até que 90% de confluência seja alcançada. Preparar as seguintes amostras para determinar o efeito de eliminação de parasitas do circuito sintético induzido.
Raspe as células RAW264.7 de um balão de 25 centímetros quadrados. Centrifugar a suspensão celular a 300 g durante cinco minutos e voltar a suspender o sedimento num mililitro de meio completo DMEM. Transfira 10 microlitros da suspensão celular ressuspensa para um tubo de 100 microlitros.
Adicione 10 microlitros de 0,5% de azul de tripano às células e misture bem. Carregue 10 microlitros de mistura de células e azul de tripano na lâmina da câmara de contagem de células e tire a contagem de células de quatro câmaras. Placa duas vezes 10 elevado a quatro células por poço na placa de 96 poços com fundo de lamínula e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Para preparar uma amostra infectada de seis horas, centrifugue um mililitro de promastigotas de Leishmania major em fase estacionária a 7.273G por 10 minutos e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de meio completo DMEM. Após a contagem, adicione duas vezes 10 à potência de cinco promastigotas L.major na placa de 96 poços do fundo da lamínula. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis horas.
Após a incubação, lave as células três vezes com PBS. Para preparar as amostras de IMT e IMTI, crescer duas vezes 10 elevado à potência de cinco promastigotas de L. major por 6, 12, 18 e 24 horas. Em um tubo de 1,5 mililitro, adicione 24 microlitros de meio sérico reduzido e um micrograma de plasmídeo de circuito sintético.
Em outro tubo de 1,5 mililitro, adicione 24 microlitros de meio sérico reduzido e um microlitro de polietilenimina ou PEI. Eu misturo bem pipetando pelo menos 10 vezes e incubo em temperatura ambiente por cinco minutos. Transfira a mistura PEI para o tubo de 1,5 mililitro contendo o DNA e misture bem.
Incube o tubo por 10 minutos. Descarte a mídia dos poços na placa inferior da lamínula de 96 poços e lave as células três vezes com PBS. Usando uma pipeta, adicione gota a gota a mistura de DNA-PEI às células e agite suavemente a placa.
Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de soro reduzido fresco às células, agite suavemente a placa e incube por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, descarte o meio.
Depois de lavar as células duas vezes com PBS, adicione meios completos de DMEM contendo geneticina e doxiciclina às células e incube por 24 horas. A simulação do circuito sintético revelou dinâmica oscilatória tanto no SDHA quanto no repressor de tetraciclina. A introdução do circuito sintético em Escherichia coli DH5-alfa resultou em colônias transformadas exibindo resistência à canamicina, indicativo de transformação eficiente.
A transfecção com o circuito sintético e a indução com doxiciclina aumentaram significativamente a expressão de GFP em células IMT ao longo do tempo. Após a transfecção e indução de doxiciclina, foi observada uma redução significativa na carga parasitária intracelular em macrófagos infectados. Os níveis de citocinas de interleucina 10 e interleucina 12 foram mais altos seis horas após a infecção, sem diferença significativa observada após a transfecção e indução de circuitos sintéticos.
Um aumento significativo no fator de necrose tumoral alfa, interferon gama e fator de crescimento transformador beta foi observado na amostra de IMTI de 24 horas, indicando a regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias.
