We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+CAR-T+Cells:+Design+Concepts.">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

CAR 및 임상 연구 향해 HSC 기반 설계 내성 획득 모멘텀 밀접 설계된 세포 분화 및 기능을 검토하기위한 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에서 우리는 건설 및 HIV에 대한 설계 유 전적으로 변형 된 줄기 세포와 인간화 된 쥐를 시험하기위한 방법을 설명했다. 이식 전에 줄기 세포의 효율적인 전달을하는 것이 중요합니다. 그러나, 표적 세포의 인식에 따라 증식하는 T 세포의 능력으로 인해, 줄기 세포 변성 낮은 수준은 HIV 복제 8에 대해 강력한 응답을 생성하기에 충분 하였다. 그럼에도 불구하고, 줄기 세포 변형의 높은 수준을 달성하기 위해, 우리는자가 흉선 대신 간 및 다른 곳에서 13 ~ 15 설명했다 쥐 수술 흉선 청크와 젤라틴 단백질 혼합물에 형질 도입 CD34 + 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 젤라틴 단백질 혼합물이다 solubiliz세포 외 기질 단백질이 풍부 에드 조직의 기저막. 정상적인 생리적 조건 하에서, 젤라틴 단백질 혼합물은 줄기 세포 (20)의 효과적인 부착과 분화를 허용하는 재구성 된 생물학적 활성을 안정 행렬을 생성하는 중합. 인간의 세포 재구성 복고풍 궤도 출혈에 의해 확인 및 6 유동 세포 계측법 할 수 있습니다 - 팔주 수술 후. 벡터는 줄기 세포의 생존과 갱신 독성이되지 않도록, 이는 1.2.6에 기술 된 바와 같이 실험에 앞서 CD34 + 세포에서 벡터 역가를 권장합니다. NSG-BLT 마우스 모델의 능력은 HIV 감염을 치료 한 HIV 면역 병리학 및 세포 - 기반 치료법 연구를 위해 매우 유용하게 점막 감염 모델 일관된 혈증 및 세포 면역 반응을 지원한다. 가장 중요한 NSG-BLT 생쥐에서 생성 된 T 세포 거동을 연구하기 위해 연구를 허용자가 흉선 조직에서 선택한흉선 선택 8,21 후 유전자 변형 된 줄기 세포. 설명 된 방법으로, 우리는 지속적으로 40 % -90 %에게 인간의 면역 세포 재구성을 얻을 수 있었다. 인간 세포 재구성 낮은 수준의 수술 및 이식 조직의 품질을 수행하는 사람의 기술을 포함하여 다수의 요인에 기인 할 수있다. 인간 세포 재구성 높은 수준을 달성하기 위해서는 확실하게 신장 캡슐 밑에 배치되는 이식을 위해 중요하다. 또한, 높은 광학 현미경 수술을 위해 준비 각각의 흉선 임플란트를 검사하고 의심스러운 부분을 삭제하는 것이 좋습니다. 인간화 BLT 마우스 모델 (1,15,22 검토) HIV에 대한 면역 설계 공부 유망한 도구이지만, 자체 한계가있다. 즉,이 모델은 완벽하게 인간의 말초 면역 시스템을 모방하지 않습니다. 연구는 하이퍼 돌연변이, 클래스 전환의 IgG antibo의 손상 발전을 보여 주었다1,23 DY. 또한, 면역 결핍 마우스를 사용하는 것은 기술적으로 도전하고 건강이 마우스를 유지하는 것은 상당한 자원과 훈련이 필요합니다. 미묘한 기회 감염 샘플에 걸쳐으로 유의 한 차이를 나타내 잠재적으로 실험에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 미래의 1.24 데이터의 무결성을 유지하기 위해 잘 준비 시설 적절히 훈련 된 직원이 중요하다. 이들 실시 예 4,8에 의해 입증 된 바와 같이 염두 이러한 제한으로, 인간화 NSG-BLT 마우스 모델은 여전히 줄기 세포 기반 설계 내성의 연구에 중요한 수단을 제공한다. 항체 (10)와보다 효율적 CAR 25 시그널링 도메인의 변경을 중화 HIV 확장에 기초 키메라 항원 수용체의 개발 추세로, 이러한 모델 및 프로토콜의 특성과 유전자 변형 CEL의 기능을 조사하기 위하여 사용될 수있다자동차의 새로운 세대와 함께 LS. 또한,이 모델은 잠재적으로 설계된 면역과 관련하여 (예를 억제 수용체 차단 등)를 기반으로 면역 치료에 대한 연구를 수용 할 수있다.

조합 된 항 - 레트로 바이러스 요법의 성공에도 불구하고 HIV 감염은 여전히​​ 평생 질환이다. HIV에 대하여 세포 성 면역 반응은 HIV 복제를 조절하는데 매우 중요한 역할을한다. 줄기 세포 조작에서의 최근 발전은 HIV 치료 1-3 유전자 치료 접근의 급속한 발전을 허용했다. 그 결과, HIV에 대한 세포 - 기반 치료법의 효능의 생체 내 연구에 있도록 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 동물 모델에서 작업하는 HIV 바이러스는 인간 세포를 감염한다는 사실에 의해 복잡하게된다. 이러한 제한을 피하기 위해, 과학자들은 붉은 털 원숭이에서 4,5- 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)과 같은 질병 모델을 사용하는 것에 의존하고있다. 불행하게도 인해 종에 걸쳐 고유 차이와 SIV와 HIV 사이의 차이점이 모델의 주요 제한 사항이 있습니다. 또한, 단지 고도로 전문화 된 시설은 C는인간이 아닌 영장류 각각의 원숭이와 함께 작업을 지원 apable 큰 투자를 필요로한다. 따라서, HIV 감염 / 발병되기 쉽다 인간의 면역 시스템을 이용하여, 적은 경제적 금지하는 모델에 대한 가압이 필요하다. (또는 NSG) 혈액 / 간 / 흉선 (BLT) 인간화 된 마우스 모델은 점점 입증하는 중요한 도구 비 비만 당뇨병 (NOD)가 결합 된 면역 결핍 (SCID) -common 감마 체인 녹아웃 (- - / C γ)를 -severe HIV 감염을 연구합니다. 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 태아 흉선을 주입함으로써, 마우스 개발 인간 면역계 1-3 요점을 되풀이 할 수있다. 줄기 세포 기반 유전자 치료제의 한 종류는 항원 특이 T 세포로 분화하는 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)를 재 프로그래밍함으로써 HIV를 타겟팅 말초 T 세포를 &#39;재지&#39;포함한다. 우리는 이전에 도시했는지 분자 클로닝 된 항 HIV 특이 T 세포와 재 설계 조혈SL9 에피토프 (아미노산 77-85; SLYNTVATL) 대 ceptor (TCR) HIV-1 개그는 인간화 NSG-BLT 마우스 모델 6에서 HIV 복제를 억제하는 성숙한 T 세포 형성에 줄기 세포를 리다이렉트 할 수있다. 분자 클로닝 TCR 사용의 경고는이 치료의 적용을 제한하는 특정 인간 백혈구 항원 (HLA) 서브 타입으로 제한된다는 것이다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 반면, 보편적 모두 HLA 서브 타입에 적용될 수있다. 초기 연구는 CD3의 도메인 신호 세포 내 ζ에 융합 된 인간 CD4의 세포 외 및 횡단 도메인으로 구성된 자동차를 이용하여 수행 하였다합니다 (CD4ζCAR 불린다). CD4ζCAR는 HIV 엔벨로프를 인정하고, T 세포 수용체 (7)에 의해 매개되는 것과 유사한 세포 독성 T 세포 반응을 유발할 수 CD8 T 세포에서 발현. 우리는 최근 인간의 조혈 모세포가 다음 여러 조혈 리로 분화 할 수 CD4ζCAR으로 수정 될 수 있음을 증명하고있다인간형 마우스 모델 8에서 HIV 복제를 억제 할 수있는 작용 성 T 세포를 포함 neages. 암 9 키메라 항원 수용체 치료의 급속한 발전, 그리고 강력한 광범위 중화 항체 단일 사슬 항체 자동차의 건설을 허용 HIV에 대한 10-12의 지속적인 특성, 그것은인지 CD4ζCAR 외에도 많은 새로운 후보의 구조이며, 생성 및 HIV 질환 및 기타 질환의 줄기 세포 기반 유전자 치료에 대해 시험한다. 또한, 이러한 항원 특이 차량을 포함하는 인간화 NSG-BLT 마우스 모델은 밀접하게 생체 내에서 인간 T 세포 반응을 조사하기 위해 유용한 도구를 제공 할 수있다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 BLT 마우스 그 조혈 모세포는 젤라틴 단백질 혼합물에서 태아 간 트렁크 (16) 대신에 사용됩니다에서 13-15의 인간화의 건설 이전에 기술 된 방법과 다릅니다. 이 프로토콜은 설명 humani 1) 건설CD4ζCAR으로 설계 평탄화 BLT 마우스; 2) 유전자 변형 세포의 분화의 특성화; 유 전적으로 변형 된 세포 기능, 3) 특성화.

<table><tbody><tr><td>CD34 microbead kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>For sorting human CD34+ progenitor cells</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>For measuring viral load in the serum</td></tr><tr><td>MACSQuant Flow Cytometer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>For flow analysis</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>For flow analysis</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&amp;nbsp;</td><td>For tissue digestion</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&amp;nbsp;</td><td>for tissue digestion</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life technology</td><td>17104-019&amp;nbsp;</td><td>for tissue digestion</td></tr><tr><td>CFX Real time PCR detection system</td><td>Biorad</td><td></td><td>For measuring viral load and gene expression</td></tr><tr><td>Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>For constructing the humanized mice</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>For culturing cells</td></tr><tr><td>Piperacillin/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>Anti-fungal</td></tr><tr><td>Amphotericin B (Fungizone antimycotic)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>Anti-fungal</td></tr><tr><td>Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Sutures, 4-0, vicryl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>23000J304H&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Alcohol prep pads&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>3583006818</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Gloves, surgical, 6 1/2</td><td>Owens and Minor</td><td>4075711102</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s Serum-Free T-Cell Medium</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-102</td><td>For CD34+ cell transduction</td></tr><tr><td>Human Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>For CD34+ cell transduction</td></tr></tbody></table>

stem-cell based engineered immunity against hiv infection in the humanized mouse model

HIV에 대한 줄기 세포 기반 유전자 요법의 급속한 발전으로, 유전자 변형 세포의 조혈 및 분화 면역 기능을 연구하기위한 동물 모델에 대한 요구 사항을 가압있다. 인간화 뼈 골수 / 간장 / 흉선 (BLT) 마우스 모델은 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하는 주변의 인간 면역 시스템의 전체 재구성을 허용한다. 인간의 흉선 이식은자가 흉선 조직에서 T 세포의 흉선 선택할 수 있습니다. HIV 감염의 연구 이외에도, 모델은 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)에서 유래 된 세포의 분화, 발달 및 기능을 연구하기위한 강력한 도구로 나타낸다. 형질 도입 조혈 모세포와 -Bone 골수 / 간 / 흉선 (NSG-BLT) 마우스 여기에 우리가 결합 된 면역 결핍 (SCID) -common 감마 체인 녹아웃 (- - / C γ)를 -severe 인간화 비 비만 당뇨병 (NOD)의 건설 개요 CD4 키메라 항원 수용체와 (CD4CAR)렌티 바이러스 벡터입니다. 우리는 CD4CAR 조혈 성공적 다중 계통으로 분화, 항 HIV 활성을 가질 수 있다는 것을 보여준다. 이 연구의 목적은 HIV에 대한 면역 설계에 대한 생체 내 모델로서 NSG-BLT 마우스 모델의 사용을 설명한다. 그것은 렌티 바이러스와 인체 조직이 사용되기 때문에, 실험과 수술이 특별한주의 (BSL2의 +) 설비와 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2)에 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야하는 것이 주목할 가치가있다.

도 1은 변형 된 줄기 세포와 인간형 BLT 쥐 구성의 개략을 나타낸다. 10주 임플란트 수술 후, 마우스는 유전자 변형 된 세포의 분화 및 발달을 평가하기 위해 희생되었다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 다수의 림프 조직 (혈액, 비장, 흉선 및 골수) CD4ζCAR 변성 된 마우스로부터 수거 하였다. 이 프로토콜에 사용되는 CD4ζCAR는 항 CD4 항체 및 GFP 8의 발현에 의해 검출 될 수 CD4 키메라 항원 수용체와 GFP가 포함되어 있습니다. 세포를 단리하고 인간 CD45에 대한 항체뿐만 아니라 항 CD4 항체로 염색하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. GFP 및 CD4 이중 양성 세포는 여러 림프 조직에서 CD4CAR + 세포의 존재를 나타내는 검출되었다. 유전자 변형 세포의 분화를 조사하기 위해,<html> 비장 세포는 인간 CD45 (림프구), CD3 (T 세포), CD19 (B 세포), CD14 (단핵구 및 대 식세포) 및 CD337 (NK 세포)에 대한 항체로 염색 하였다. 도 3에 도시 된 바와 같이, CD4ζCAR 조혈 줄기 세포는 다중 계통으로 분화. CD4CAR 변성 세포가 작용하는 경우를 조사하기 위해, 우리는 CD4CAR 셀 (HIV 감염 T1 세포 또는 대조군으로 감염되지 않은 세포 T1)를 인식 할 표적 세포와 비장 세포를 coincubated. 세포를 밤새 공동 배양하고, 단백질 수송 억제제는 추가 6 시간 동안 첨가 하였다. 그 후, 세포는 고정 및 IFNγ와 TNFα와 같은 사이토 카인의 세포 내 발현 얼룩 투과성이되었다. 도 4에 도시 된 바와 같이, CAR 발현 세포 감염된 세포 T1 IFNγ 및 TNFα의 더 많은 양을 생산했다. 로드 / 54048 / 54048fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 태아 흉선 : 수정 된 줄기 세포와 인간화 된 BLT 마우스의 건설 FT의 개요. FL :. 태아 간 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54048/54048fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54048/54048fig2.jpg" /> 그림 2. CD4 키메라 항원 수용체 변성 세포가 여러 림프 조직에서 검출 될 수 마우스 CD4CAR 변성 조혈 모세포로 수확 하였다 수술 복수 림프 조직 후 10 주에 희생시키고, 세포는 항 - 인간 CD45 및 항 인간 CD4 항체로 염색했다 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54048/54048fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3 :.. CD4 키메라 항원 수용체 수정 된 세포는 여러 계통으로 분화 할 수 CD4CAR 변형 마우스의 비장 세포 수확과 인간의 CD45, CD3, CD19, CD14 및 CD337에 대한 항체로 염색과 흐름에 의해 분석 하였다 세포 계측법 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54048/54048fig3large.jpg" target="_blank">큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54048/54048fig4.jpg" /> 그림 4 :. CD4 CAR + T 세포의 전 생체 내 사이토 카인 분석은 HIV의 비장 세포는 CD4CAR 마우스가 표시됩니다 HIV 감염 또는 감염되지 않은 T1 세포 및 사이토 카인의 자신의 세포 내 생산 중 하나를 자극 하였다 감염. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54048/54048fig4large.jpg" target="_blank">경쟁하려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 WA 더 큰 버전.

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Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

stem-cell-based-engineered-immunity-against-hiv-infection-humanized

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.1K 조회수.  University of California, Los Angeles. This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection. 

비디오: Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

연구

면역학 및 감염병학

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

암 연구학

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of their morbidity. The liver immunopathology caused by HIV-1 remains elusive. Small xenograft animal models with human hepatocytes and human immune system can recapitulate the human biology of the disease&#39;s pathogenesis. Herein, a protocol is described to establish a dual humanized mouse model through human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transplantation, to study liver immunopathology as observed in HIV-infected patients. To achieve dual reconstitution, male TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) mice are intraperitoneally injected with ganciclovir (GCV) doses to eliminate mouse transgenic liver cells, and with treosulfan for nonmyeloablative conditioning, both of which facilitate human hepatocyte (HEP) engraftment and human immune system (HIS) development. Human albumin (ALB) levels are evaluated for liver engraftment, and the presence of human immune cells in blood detected by flow cytometry confirms the establishment of human immune system. The model developed using the protocol described here resembles multiple components of liver damage from HIV-1 infection. Its establishment could prove to be essential for studies of hepatitis virus co-infection and for the evaluation of antiviral and antiretroviral drugs.

This protocol provides a reliable method to establish humanized mice with both human immune system and liver cells. Dual reconstituted immunodeficient mice achieved via intrasplenic injection of human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem cells are susceptible to human immunodeficiency virus-1 infection and recapitulate liver damage as observed in HIV-infected patients.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical research on infectious diseases. Described here are three models of humanized immunodeficient mice for studying the dynamics of HIV infection. The first is based on the intrahepatic injection of CD34+ hematopoietic stem cells in newborn mice, which allows for the reconstitution of several blood and lymphoid tissue-confined cells, followed by infection with a reference HIV strain. This model allows monitoring for up to 36 weeks post-infection and is hence called the chronic model. The second and third models are referred to as the acute and reactivation models, in which peripheral blood mononuclear cells are intraperitoneally injected in adult mice. In the acute model, cells from a healthy donor are engrafted through the intraperitoneal route, followed by infection with a reference HIV strain. Finally, in the reactivation model, cells from an HIV-infected donor under antiretroviral therapy are engrafted via the intraperitoneal route. In this case, a drug-free environment in the mouse allows for virus reactivation and an increase in viral load. The protocols provided here describe the conventional experimental approach for humanized, immunodeficient mouse models of HIV infection.

Described here are three experimental approaches for studying the dynamics of HIV infection in humanized mice. The first permits the study of chronic infection events, whereas the two latter allows for the study of acute events after primary infection or viral reactivation.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes the establishment of a human immune system in adult NOG mice. Here, we explain all the practical steps from isolation of umbilical cord blood derived human CD34+ cells and their subsequent intravenous transplantation into the mice, to the manipulation of the model through HIV infection, combination antiretroviral therapy (cART), and blood sampling. Approximately 75,000 hCD34+ cells are injected intravenously into the mice and the level of human chimerism, also known as humanization, in the peripheral blood is estimated longitudinally for months by flow cytometry. A total of 75,000 hCD34+ cells yields 20%&#8211;50% human CD45+ cells in the peripheral blood. The mice are susceptible to intravaginal infection with HIV and blood can be sampled once weekly for analysis, and twice monthly for extended periods. This protocol describes an assay for quantification of plasma viral load using droplet digital PCR (ddPCR). We show how the mice can be effectively treated with a standard-of-care cART regimen in the diet. The delivery of cART in the form of regular mouse chow is a significant refinement of the experimental model. This model can be used for preclinical analysis of both systemic and topical pre-exposure prophylaxis compounds as well as for testing of novel treatments and HIV cure strategies.

We have developed a protocol for the generation and evaluation of a humanized and human immunodeficiency virus-infected NOG mouse model based on stem cell transplant, intravaginal human immunodeficiency virus exposure, and droplet digital PCR RNA quantification.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

Production of Humanized Mouse via Thymic Renal Capsule Grafting, CD34+ Cells Injection, and Cytokine Delivery

Animal models provide a vital translation between in vitro and in vivo biomedical research. Humanized mouse models provide a bridge in the representation of human systems, thereby allowing for a more accurate study of pathogenesis, biomarkers, and many other scientific queries. In this method described, immune-deficient NOD-scid IL2R&#947;null (NSG) mice are implanted with autologous thymus, injected with liver-derived CD34+ cells followed by a series of injected cytokine deliveries. In contrast to other models of a similar nature, the model described here promotes an improved reconstitution of immune cells by delivering cytokines and growth factors via transgenes encoded in AAV8 or pMV101 DNA-based vectors. Moreover, it offers long-term stability with reconstituted mice having an average lifespan of 30 weeks after CD34+ injections. Through this model, we hope to provide a stable and impactful method of studying immunotherapy and human disease in a murine model, thus demonstrating the need for predictive preclinical models.

Production of Humanized Mouse via Thymic Renal Capsule Grafting, CD34+ Cells Injection, and Cytokine Delivery

Humanized mouse models provide a more accurate representation of the human immune microenvironment. This manuscript describes the process in which these models are created through a renal graft of human thymus, injection of human CD34+ cells, and the targeted delivery of human cytokine transgenes to promote CD34+ cell proliferation and differentiation.

Animal models provide a vital translation between in vitro and in vivo biomedical research. Humanized mouse models provide a bridge in the representation ...

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. Although combinational antiretroviral therapy (cART) has been successful in suppressing viral replication, it cannot completely eradicate the reservoir from HIV-infected individuals. A safe and effective cure strategy for HIV infection will require multipronged methods, and therefore the advancements of animal models for HIV-1 infection are pivotal for the development of HIV cure research. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection. The humanized mouse model can be infected by HIV-1 and viral replication can be controlled with cART regimens. Moreover, cART interruption results in a prompt viral rebound in humanized mice. However, administration of cART to the animal can be ineffective, difficult, or toxic, and many clinically relevant cART regimens are unable to be optimally utilized. Along with being potentially unsafe for researchers, administration of cART by a commonly used intensive daily injection procedure induces stress by physical restraint of the animal. The novel oral cART method to treat HIV-1 infected humanized mice described in this article resulted in suppression of viremia below the detection level, increased rate of CD4+ restoration, and improved overall health in HIV-1 infected humanized mice.

This protocol describes a novel method to deliver oral combinational antiretroviral drugs that successfully suppress HIV-1 RNA replication in humanized mice.

HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 경구 조합 항레트로바이러스 치료

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Source: Lanis, J. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

제대혈 조혈 줄기세포를 분리하여 인간 면역계 마우스를 생성하다

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. All procedures involving animal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunotherapy

Model Development and Disease Study

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

Source: Dagur, R. S. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58645">Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

인간 간 세포와 면역 세포를 이용한 인간화 마우스 모델 개발

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

요약

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