Системная биология дает представление о биологических сетях и механизмах в моделях инфекций, в то время как синтетическая биология позволяет проводить прецизионную терапию. Мы исследуем иммунометаболизм при большой инфекции Leishmania и потенциал биосинтетических схем для разрешения заболеваний, революционизируя иммунотерапию. В последние годы синтетическая биология показала большие перспективы в разработке новых и эффективных стратегий борьбы с лейшманиозом.
Некоторые из последних разработок относятся к области инженерии синтетических цитокинов, бистабильной синтетической схемы CRISPR-Cas9, а синтетические пептиды исследуются в качестве терапевтических средств. Наш протокол нацелен на белок хозяина, который модулируется паразитом для его выживания. Таким образом, мы изучаем влияние на контур не только на паразита, но и на хозяина.
Кроме того, мы изучили влияние синтетической схемы на адресацию функции ортогональности и модульности при доставке в хост. Для начала на компьютере откройте программное обеспечение TinkerCell и перейдите на вкладку деталей. Выберите компонент промотора ЦМВ из библиотеки и поместите его на холст, чтобы символизировать промотор цитомегаловируса в синтетической цепи.
Затем извлеките сайт связывания репрессора, аналогичный оператору тетрациклина, и расположите его рядом с промотором на холсте, интегрируя с промотором ЦМВ. Перетащите внутренние сайты входа рибосом и область кодирования на холст, интегрируя их с существующими генетическими компонентами. Переименуйте область кодирования в тетрациклин-чувствительный репрессор.
Объедините эти генетические элементы, чтобы облегчить создание синтетических деталей. Включите в холст область распорки, которую расщепляет тесховирус свиньи 12A. Введите дополнительную кодирующую область, сукцинатдегидрогеназу или SDHA, представляющую интерес ген в синтетической конструкции и интегрирующую его с другими элементами.
Рядом с кодирующей областью SDHA интегрировать еще одну область спейсера, расщепляемую клеточной протеазой тесховируса свиньи 12А. Введите кодирующую область, представляющую репортерный ген, и пометьте ее как GFP в конструкцию. Рядом с GFP добавьте терминатор.
Чтобы убедиться в формировании функциональной генетической цепи, нажмите на любой участок цепи. При нажатии цепь становится красной. На вкладке «Реакция» назначьте регуляторные скорости тетрациклин-чувствительному репрессору, SDHA и GFP, чтобы очертить реакцию трансляции в синтетическом контуре.
Добавьте маленькую молекулу с вкладки деталей и назовите ее доксициклином. Чтобы назначить доксициклину волновую функцию, на вкладке деталей и соединений выберите вход и нажмите на вход волны. На вкладке реакции нажмите на реакцию подавления.
Перетащите скорость реакции на холст между dox и тетрациклин-чувствительным репрессором. Чтобы установить кинетику реакции между dox и репрессором, чувствительным к тетрациклину, дважды щелкните значок волновой функции на dox и настройте doxycycline.sin. Амплитуда до 10.
Чтобы осуществить транскрипционную регуляторную реакцию между тетрациклин-чувствительным репрессорным белком и сайтом связывания репрессора, выберите реакцию на вкладке реакции и поместите ее на холст между тетрациклин-чувствительным репрессором и оператором тетрациклина. Дважды щелкните по каждому компоненту и реакции, чтобы задать начальную концентрацию и параметр для моделирования. Нажмите на simulation, выберите deterministic и смоделируйте схему для 100 единиц времени.
Настройте график моделирования с панели управления и наблюдайте за картиной графика для SDHA и репрессивных белков, реагирующих на тетрациклин. Откройте реестр стандартных биологических частей, затем нажмите на поиск и введите название генетического компонента. Чтобы получить нуклеотидную последовательность промотора ЦМВ, нажмите на кнопку «Получить последовательность» и сохраните файл в виде текстового файла.
Чтобы получить кодирующую белок последовательность SDHA, откройте NCBI и выберите нуклеотид из выпадающего списка рядом с окном поиска. Тип сукцинатдегидрогеназы и Mus musculus и поиск нуклеотидной последовательности. Нажмите на опцию CDS, чтобы получить последовательность кодирования SDHA и сохранить последовательность в текстовом файле.
Последовательно объедините нуклеотидную последовательность всех генетических регуляторных частей в одном файле. Добавьте стартовый кодон ATG сразу после последовательности Козака и удалите внутренние стоп-кодоны, чтобы избежать образования зарождающихся полипептидов. Откройте веб-сайт Expasy и вставьте нуклеотидную последовательность.
Нажмите на опцию «Перевести последовательность», затем выберите пять простых трех простых кадров один и удалите стоп-кодоны. Для начала культивируйте клетки RAW264.7 при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет достигнуто 90% слияние. Подготовьте следующие образцы для определения эффекта индуцированной синтетической цепи для устранения паразитов.
Соскребите элементы RAW264.7 из колбы площадью 25 квадратных сантиметров. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300G в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре полной среды DMEM. Перелейте 10 микролитров суспензии ресуспендированных клеток в 100-микролитровую пробирку.
Добавьте в ячейки 10 микролитров 0,5%-ного трипана синего и хорошо перемешайте. Загрузите 10 микролитров смеси клеток и трипанового синего цвета на предметное стекло камеры для подсчета клеток и отсчитайте клетки из четырех камер. Планшет два раза по 10 в степени четырех ячеек на лунку в крышку сдвигают дном 96-луночной пластины и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов.
Чтобы получить зараженный образец в течение шести часов, центрифугируйте один миллилитр стационарной фазы Leishmania major promastigotes при температуре 7,273G в течение 10 минут и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах полной среды DMEM. После подсчета прибавьте два умножения на 10 к степени пяти больших промастигот в крышку слипа дна 96-луночной пластины. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение шести часов.
После инкубации трижды промойте клетки PBS. Для подготовки образцов IMT и IMTI выращивают в два раза по 10 в степени пяти больших промастигот L, в течение 6, 12, 18 и 24 часов. В 1,5-миллилитровую пробирку добавьте 24 микролитра восстановленной сыворотки среды и один микрограмм синтетической контурной плазмиды.
В еще одну 1,5-миллилитровую тубу добавьте 24 микролитра восстановленной сывороточной среды и один микролитр полиэтиленимина или ПЭИ. Я хорошо перемешиваю пипеткой не менее 10 раз и выдерживаю при комнатной температуре в течение пяти минут. Переложите смесь PEI в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую ДНК, и хорошо перемешайте.
Инкубируйте трубку в течение 10 минут. Слейте фильтрующий материал из лунок на 96-луночной нижней пластине крышки и трижды промойте ячейки PBS. С помощью пипетки по каплям добавьте смесь ДНК-ПЭИ к клеткам и осторожно встряхните пластину.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение трех часов. Далее добавьте в клетки 200 микролитров свежей восстановленной сыворотки среды, аккуратно встряхните пластину и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На следующий день выбросьте носитель.
После двукратной промывки клеток PBS добавьте в клетки полноценные среды DMEM, содержащие генетикин и доксициклин, и инкубируйте в течение 24 часов. Моделирование синтетической схемы выявило колебательную динамику как в SDHA, так и в тетрациклиновом репрессоре. Введение синтетической цепи в Escherichia coli DH5-альфа привело к тому, что трансформированные колонии проявили устойчивость к канамицину, что свидетельствует об эффективной трансформации.
Трансфекция синтетическим контуром и индукция доксициклином со временем значительно увеличивали экспрессию GFP в клетках IMT. После трансфекции и индукции доксициклина в инфицированных макрофагах наблюдалось значительное снижение внутриклеточной паразитарной нагрузки. Уровни цитокинов интерлейкина 10 и интерлейкина 12 были самыми высокими через шесть часов после заражения, при этом существенной разницы не наблюдалось при трансфекции и индукции синтетических контуров.
Значительное увеличение фактора некроза опухоли альфа, интерферона гамма и трансформирующего фактора роста бета наблюдалось в 24-часовой пробе IMTI, что указывает на повышение регуляции провоспалительных цитокинов.
