이 작품은 텍사스 상뼈 질환 프로그램, 캐롤라인 비스 법률 기금 상, 그리고 수상 번호 R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946에 수여 번호로 국립 보건 원의 NIAMS에 의해 지원되었다.  BCM 광학 이미징 및 바이탈 현미경 코어와 BCM 첨단 기술 코어 의 M.E. 디킨슨과 T.J. Vadakkan에 NIH(AI036211, CA125123 및 DK056338)의 자금 지원을 제공합니다.
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모든 마우스는 병원체가 없는 조건에서 유지되었고, 모든 절차는 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 준비
<ol><li>크로스 Mx1-Cre17 및 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (톰)18 마우스 (잭슨 연구소에서 구입) αSMA-GFP 마우스 (박사에 의해 여기에 제공) 이보 칼라지치와 헨리 크로넨버그)는 Mx1-Cre+Rosa26-tomato+α SMA-GFP+(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스(그림 2A)를 생성한다.</li>
	<li>Mx1-Cre 유도의 경우, 10 일 동안 격일로 25 mg / kg pIpC로 마우스를 주입하십시오.</li>
	<li>야생형 C57BL/6 마우스(WT-BMT)19에서 1 x 106개의 전체 골수 단핵 세포의 정맥 이식 전 9.5 Gy 1일 마우스를 조사한다.</li>
	<li>6-8주 간의 회복 후, 아래에 설명된 페리오스텔스 세포 이동 프로토콜의 생체 내 이미징에 대상 마우스를 입력하였다. 참고: Mx1-Cre 마우스의 조사 및 WT-BMT는 상해에 반응할 수 있는 내인성 Mx1 표지된 조혈 세포를 제거하기 위하여 필요합니다. 6~8주 후 조사 후, 호스트의 조혈 세포 수는 <5%에 이르므로 이미징19에 대한 준비가 되어 있습니다.</li>
</ol>2. 마우스 구속 및 이미징 마운트
<ol><li>50mL 원문 튜브로 마우스 구속을 만듭니다(그림 1A).<ol>
<li>뾰족한 가위를 사용하여 원물 바닥을 뚫고 구멍을 뚫습니다. 아래 구멍에서 원식 의 상단으로 잘라냅니다 (절단 면은 구속의 상단이 될 것입니다).</li>
		<li>이전 컷과 평행하게 약 4~5cm 길이의 컷을 만들고 구속의 상단에서 중간(~2cm)을 줄입니다. 원식의 이 섹션을 제거하고 가장자리가 필요했던 매끄러운.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조정 가능한 각도 플레이트, 0.5" 광학 포스트 및 0.5" 게시물에 대한 직각 클램프, 0.1875" 헥스(그림 1B 및 재료 표)를 사용하여 원적 튜브 이미징 마운트를 구성합니다.<ol>
<li>각도 플레이트를 35° 각도로 조정합니다. 각도 플레이트의 왼쪽에, 플레이트의 뒷면에서 두 번째 구멍에 광학 포스트를 나사.</li>
		<li>조정 가능한 플레이트의 오른쪽에스프링로드 0.1875" 육석 잠금 0.25" 엄지손가락나사를 플레이트의 앞면과 마지막 구멍에서 두 번째 구멍에 삽입합니다. 직각 클램프는 광학 포스트와 함께 사용되어 원물 마우스 구속을 제자리에 고정시합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수술 전 수술
<ol><li>마우스 마취<ol>
<li>통증 관리를 위해 수술 전 30-60분 동안 지속적인 방출 부프레노르핀(1 mg/kg BW)으로 마우스를 피하한다.</li>
		<li>설치류 III CCM 조합(콤보 III)을 사용하여 마취생쥐를 마취하여 37.5 mg/mL 케타민, 1.9 mg/mL 자일라진, 및 0.37 mg/mL 아세프로마진을 함유하고 있다. 마우스에 대 한 적절 한 복용량은 0.75-1.50 체중의 1 kg 당 mL. 복용량 지속 됩니다 30-45 분.</li>
		<li>마우스가 마취되면 안과 연고를 멸균 면봉으로 눈에 바르면 눈탈수림을 방지하십시오.</li>
		<li>장기 이미징(>45분)의 경우 마취를 다시 투여하여 다음과 같이 적절한 마취 깊이를 유지하십시오.<ol>
<li>계획된 이미징 지속 시간(추가 체디션 의 30분 당 0.75 mL/kg BW)에 대한 마취를 유지하기에 충분한 양의 콤보 III로 1mL 주사기를 준비한다. 25 G 나비 바늘 주입 세트를 12인치 튜브로 주사기에 부착하고 튜브와 바늘을 통해 마취제를 밀어 넣습니다.</li>
			<li>나비 바늘을 인과간으로 삽입한 다음 바늘을 제자리에 테이프로 놓습니다. 참고: 이것은 추가 콤보 III가 동물을 움직이거나 보기의 평면을 방해할 필요가 없다는 것을 화상 진찰 도중 관리되는 방법입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시술 내내 37°C에 보관된 가열 패드로 열 지원을 제공합니다. 장기간 이미징(>1hr)의 경우 추가적인 유체 지원이 필요합니다.  보조 유체는 이미징 중 추가 콤보 III 또는 33 mL/kg 식염수(0.9 NaCl) 피하시 I.P.를 제공할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 구속 및 수술 부위의 준비<ol>
<li>클리퍼를 사용하여 머리 꼭대기에서 가능한 한 많은 머리카락을 제거합니다. 면도 부위에 탈모 크림을 바르면 수술 부위에 남은 모발을 제거하십시오.</li>
		<li>발가락 핀치에 대한 응답이 부족하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다. 15 분 후, 마우스가 완전히 마취되지 않은 경우, 콤보 III (<0.75 mL / kg BW)의 두 번째 작은 복용량을 투여한다.</li>
		<li>마우스를 구속 꼬리에 먼저 놓고, 코가 원물 의 가장자리에 약간 걸려 있도록 충분히 뒤로 슬라이딩합니다.</li>
		<li>의료 용 테이프를 사용하여 원적 튜브의 바닥에 앞발을 테이프로 테이프.</li>
		<li>35° 각도로 설정된 이미징 마운트에 마우스로 원식 튜브를 배치하고 직각 클램프(그림 1C)를 사용하여 고정합니다.</li>
		<li>마우스가 이미징 마운트에서 안전해지면 베타딘 스크럽과 70%의 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 3배 청소하십시오. 다시 말하지만, 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>마우스를 깨끗한 흡수 패드로 옮기고 커다란 멸균 장을 만들기 위해 마우스 위에 커튼을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 외과 적 절차
<ol><li>개구부 절개<ol>
<li>미세 한 팁 포셉을 사용하여, 피부를 즉시 오른쪽 귀에 내간을 선택합니다. 미세 절 가위를 사용하면 집게가 들고있는 피부를 잘라냅니다. 참고: 위에서 설명한 방법을 사용하여 절개를 시공하면 절차 후 봉합에 더 적합한 둥근 절개가 생성됩니다.</li>
		<li>왼쪽 귀(<1cm)를 향한 초기 절개에서 시작하여 횡방향 절개를 합니다.  초기 절개에서 시작하여 동물의 코로 다시 절개를 하십시오 (오른쪽 눈을 지나 ~ 2-3 mm).</li>
		<li>포셉과 가위를 사용하여 피부와 분리하여 피부와 갈바리아 골막수로부터 피부를 분리하는 결합 조직을 부드럽게 잘라냅니다.</li>
		<li>멸균 면봉을 사용하여 피부 플랩 상단에 안과 연고를 바르습니다.  부드럽게 피부 플랩을 집어 왼쪽 눈 위에 접습니다. 궁수와 관상 봉합사의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다(그림 1E). 참고: 안과 연고는 피부 플랩을 제자리에 유지하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>모든 혈액과 잔류 모발의 영역을 청소하기 위해 멸균 PBS로 열린 표면을 플러시하십시오. 참고 : 필요한 경우 미세 한 양면을 사용하여 홍조 후 남아있는 머리카락을 제거하지만 음막 이 손상되지 않도록주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 골절<ol>
<li>calvaria에 미세 골절을 생성하려면 29 G 인슐린 주사기의 플런저를 제거하고 주사기의 백 엔드를 300-400 uL 마크 주위로 자른다. 참고: 이 단계를 사용하면 부상을 생성할 때 해부 범위 하에서 기동하기가 더 쉬워집니다.</li>
		<li>관상 봉합사로부터 코쪽으로 베벨(1~2개의 바늘 폭)의 끝을 놓고, 1~2개의 바늘 폭을 궁합봉의 오른쪽에 놓는다(도 1E).</li>
		<li>주사기를 시계 방향으로 부드럽게 회전한 다음 시계 반대 방향으로 여러 번 회전합니다. 참고: 젊은 쥐에서는 원형 미세 골절을 만들기 위해 매우 적은 양의 하방 압력이 필요합니다. 이 출혈을 일으키는 원인이 되고 화상 진찰을 방해할 것이기 때문에, 바늘이 두뇌를 관통하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>27 G 바늘을 사용하여 미세 골절을 ~0.4 mm로 넓습니다. 뼈 조각이 미세 골절에 남아 있으면 PBS로 영역을 플러시하십시오. 뼈 조각이 여전히 미세 골절에 남아 있는 경우 29 G 바늘을 사용하여 부드럽게 스쿱하십시오.</li>
		<li>4.2.1-4.2.4단계를 반복하여 좌측에 부상을 입습니다. 참고: 이 시점에서, 두 가지 옵션이 있습니다: 1) 즉시 CCL5 치료로 진행 (섹션 4.3) 및 이미징 (섹션 5); 또는 2) 6절 수술 후 수술 후 수술 부위를 닫습니다. 24 시간 후에 마우스를 다시 마취하고 수술 시력을 다시 열고 CCL5 (섹션 4.3)로 부상을 치료하고 인포탈 이미징 (섹션 5) 및 수술 후 치료 (섹션 6)를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 치료<ol>
<li>RANTES (100 ng /mL)의 주식에서 지하 멤브레인 매트릭스 (재료의 표)를 사용하여 10 ng / mL의 용액을 만듭니다. 이 용액을 얼음위에 두어 매트릭스를 액체 형태로 유지합니다.</li>
		<li>2-20 μL 파이펫을 사용하여 CCL5(10 ng/μL)의 2μL(10 ng/μL)으로 각 부상을 치료합니다(이 파이펫 팁은 점성 액체를 사용할 때 더 효과적입니다). 행렬을 굳게 할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>매트릭스가 고화되면, 부드럽게 조직이 탈수되지 않도록 피부 플랩으로 calvaria를 커버. 이미징 전에 1시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 인트라바이탈 이미징
<ol><li>현미경 설정<ol>
<li>멀티 광자 레이저 (펨토초 티타늄 사파이어 레이저)를 켭니다. 파장을 880nm로 설정하고 뼈의 제2 고조파 생성(SHG) 이미징(440nm)의 힘을 조절한다.</li>
		<li>GFP-및 tdTomato 표현 세포의 흥분을 위해 488 nm 및 561 nm 고체 상태 레이저를 각각 켭니다.</li>
		<li>두 번째 고조파 생성(405-455 nm 검출) 및 GFP(505-550 nm 검출) 신호를 위해 PMT(광증튜브) 검출기를 켭니다. 토마토 (590-620 nm 검출) 신호에 대한 HyD 3 검출기를 켭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장착<ol>
<li>마우스를 스코프로 이동하기 전에 마우스 머리 뒤쪽을 부드럽게 눌러 칼바리아의 시각적 평면을 확인합니다. 평면이 평평하지 않은 경우 마우스 구속을 왼쪽 또는 오른쪽으로 부드럽게 회전하여 위치를 조정합니다. 참고: 충분한 이미지 품질을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.</li>
		<li>멸균 2% 메틸셀룰로오스를 물(w/v)에 바르면 칼바리아와 피부 플랩 전체를 덮고 조직의 건조를 방지합니다.</li>
		<li>XYZ 축 전동 현미경 단계(그림 1G)에 마우스를 놓습니다. 상피광을 이용하여, 마우스를 정렬하여 1) 현미경에 직면하고 2) 관상 및 처탈 봉합사의 교차점이 단계의 중심 기준점이다.</li>
		<li>이미징 영역에 유리 커버를 놓고 정렬을 다시 확인합니다(그림 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>시간 경과 이미징<ol>
<li>낮은 배율 렌즈(NA = 0.95로 25배 물 침수 목표)를 사용하여 calvaria를 스캔합니다. 궁수 및 관상 봉합사 교차의 참조 이미지를 획득합니다.</li>
		<li>세포에서 SHG 및 형광 신호를 사용하여 각 부상 시력을 찾아 XYZ 좌표뿐만 아니라 처상 및 관상 봉합사로부터의 거리(도 2B)를 기록합니다.</li>
		<li>장기간 이미징을 위해 관상 또는 좌활봉에 위치를 선택합니다. 이미징 중에 참조에서 이 영역의 자세한 Z 스택 이미지를 촬영합니다. 참고: 봉합사는 알려진 P-SSC 틈새 시장을 나타내기 때문에 칼바리아 손상에 대한 응답으로 세포가 마이그레이션되는 곳입니다.</li>
		<li>시간 경과 소프트웨어 설정을 사용하여 최소 1시간 동안 1분마다 이미지를 기록합니다. 스냅숏 사이의 시간에 현재 시야 필드를 초기 시야 필드와 비교합니다. 서로 다른 경우 Z 스택 이미지를 사용하여 뷰 필드를 조정해야 하는 방향을 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수술 후 동물 관리
<ol><li>이미징 후, 노출된 칼바리아를 멸균 PBS로 헹구어 메틸셀룰로오스를 제거합니다.</li>
	<li>절개를 닫기 위해 피부 플랩을 칼바리아 위에 부드럽게 놓습니다. 멸균 면봉을 사용하여 잔류 안연고를 제거하고 절개 부위를 건조시다.</li>
	<li>모노필라멘트 나일론 5-0 사이즈 비흡수성 봉합사를 C-1 역절단 바늘로 사용하여 수술 부위를 닫습니다. 멸균 면봉을 사용하여 밀폐 절개에 트리플 항생제 연고를 적용하십시오. 참고 : 흉터는 고품질의 봉합 기술과 최소 출혈로 감소됩니다.</li>
	<li>따뜻한 표면에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓고 흉골 재정이 달성 될 때까지 매 15 분마다 확인하십시오.</li>
	<li>지속적인 방출 buprenorphine의 두 번째 복용량을 관리 72 수술 후 h.</li>
	<li>봉합사(~1주)가 제거될 때까지 매일 허들 동작, 주름이 있는 모피 및/또는 어약이 부족한 경우 모니터링합니다.</li>
</ol>

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L.C.O. 및 D.P.는 "뼈 수리에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포"라는 제목의 출원 중인 특허를 공개합니다(BAYM. P0264US. P1). 나머지 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

뼈 치유 하는 동안, periosteal 세포는 새로 분화 된 연골 세포와 부상 callus3 내에서 골세포의 주요 소스입니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다. 내인성 P-SSC 기능적 특성을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 일입니다. 종종 SSC의 철새 역학은 시험관 내에서 평가되므로 생체 시스템의 해당 해석이 어려워지는 경우가 많습니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스 (Mx1/토마토/αSMA-GFP)의 생성에 최근 발전으로 인해 개별 세포의 생체 내 추적이 가능해졌습니다. 따라서, 이 방법은 실시간으로 CCL5 유도 된 P-SSC 마이그레이션의 생체 내 기록을 허용한다.
이미징 일관성에 영향을 미칠 수 있는 이 방법과 관련된 몇 가지 기술적 과제가 있습니다. 이 방법의 주요 기술적 과제는 보기의 Z 축 평면을 유지하는 것입니다. Z축 드리프트(Z-drift)는 고정 및 라이브 샘플의 장기 이미징에서 흔히 볼 수 있는 문제이며, 이미징 환경의 온도 변화에 크게 기인한다.  이 아티팩트는 완전히 대응할 수 없지만 스테이지, 목표 렌즈 및 지지 구조를 덮면 Z 드리프트21을 줄이는 데 도움이 됩니다.
더욱이, 시간 경과 이미징 전에 이미징 위치의 Z-스택 시리즈를 획득하면 이미지 수집 사이에 언급될 수 있는 Z축의 기준을 확립할 것이다(즉, 이미지는 일반적으로 30-60초마다 촬영되며, 이는 필요한 경우 Z축을 조정할 시간을 허용한다). 또 다른 기술적 과제는 calvaria 봉합사에서 동일한 크기, 모양 및 거리인 일관된 미세 골절을 만드는 것입니다. 칼바리아 봉합사는 정지 SSCs10에 대한 틈새 시장이기 때문에 관상 및 처진 봉합사에서의 거리는 매우 중요합니다. 미세 골절의 가변성을 감소시키는 가장 좋은 방법은 최종 분석에 포함되지 않은 마우스에서 이 기술을 연습하는 것입니다.
한계에도 불구하고,이 방법은 뼈 부상에 생체 내에서 개별 세포 반응을 평가하는 독특한 시스템을 제공합니다. 골절 수리는 여러 세포 유형을 포함하는 매우 복잡한 과정이기 때문에 완전히 이해되지 않는 여러 측면이 있습니다. 이들 중 하나는 부상을 향해 P-SSC의 초기 마이그레이션 응답을 포함한다. CCR5/CCL5는 P-SSC를 부상으로 채용하는 독특한 메커니즘이지만, 추가 사이토카인과 성장 인자가 골절 치유에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 이전에는 다양한 사이토카인과 성장 인자를 가진 골절의 치료는 전반적인 골절 치유22에서 매우 가변적인 결과를 초래했습니다. 이 화상 진찰 방법은 개별적인 세포 반응에 잠재적인 약/사이토카인/성장 인자 치료의 생리적인 효력을 결정하는 유일한 플랫폼을 제공합니다. 마지막으로, 골절 치유의 특정 치료의 향상을 지원할 수 있는 생체 내 기계성 데이터를 제공합니다.

골절 수리는 배아 골격 발달 및 리모델링과 구별되는 동적 다세포 과정입니다. 이 과정에서 손상된 조직으로부터의 부상 신호 유도는 골격 줄기/전구 세포의 신속한 모집, 증식 및 후속 분화로 이어지며, 이는 골절의 전반적인 안정성 과 고정에 모두 중요합니다1. 특히, 골절 치유의 초기 단계는 주로 periosteal 상주 세포2에 기인하는 부드러운 callus 형성을 필요로한다2. 뼈가 다치면, periosteal 세포의 부분 집합은 급속하게 반응하고 periosteum 내의 명백한 골격 줄기/선조 세포 집단의 존재를 연루하는 callus3 내의 새로 분화한 연골 중간체 및 골에 기여합니다. 따라서, periosteum-거주자 골격 줄기 세포(SSC)의 식별 및 기능적 특성화는 퇴행성 뼈 질환 및 뼈 결함에 대한 유망한 치료 접근법을 구성한다4.
SSC는 골수를 포함하여 다중 조직 위치에 상주하는 것으로 생각됩니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다.  이러한 periosteal SSC (P-SSC)는 태아 뼈 발달 동안 초기 중간 엽 계보 마커 (즉, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 및 Axin2-CreER8)로 표시 될 수 있습니다4,7,8,9,10. 이러한 단일 유전 계보 추적 모델의 중요한 한계는 표지된 세포 집단 내의 상당한 이질성이 있다는 것입니다. 또한 라벨이 부착된 SSC를 생체 내에서자손과 구별할 수 없습니다. 이러한 제한을 해결하기 위해 최근 이중 리포터 마우스(Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+)를 개발하여 골수 SSC(BM-SSC)11에서 P-SSC를 뚜렷하게 시각화했습니다. 이 모델을 사용하면 P-SSC가 Mx1+αSMA+ 듀얼 라벨링으로 표시되는 반면, 보다 분화된 Mx1+ 세포는 골수, 내피 스텔스 및 페리오스핑 표면, 피질 및 궤적 골격11,12에 상주하는 반면, 더 분화된 Mx1+ 세포로 표시됩니다.
여러 사이토카인과 성장 인자는 뼈 리모델링 및 수리를 조절하는 것으로 알려져 있으며 중요한 세그먼트 결함1,13에서 골격 수리의 향상을 위해 테스트되었습니다. 그러나, 뼈 구획의 물리적 장벽의 중단을 통해 생성 된 부상 모델의 세포 복잡성으로 인해, 내인성 P-SSC 마이그레이션 및 치유 중 활성화에 이러한 분자의 직접적인 영향은 불분명하다. SSC의 기능적 특성 및 철새 역학은 종종 다른 세포 집단에서 이주를 유도하는 것으로 알려진 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 트랜스웰 또는 스크래치 분석을 수행함으로써 시험관 내에서 평가됩니다. 따라서, 생체 내 시스템에서 해당 되는 생체 내 시스템에서 적용을 위한 이러한 체외 실험의 결과 해석은 도전적이다. 현재, 골격 줄기/전구 세포 이동의 생체 내 평가는 전형적으로 실시간으로 관찰되지 않는다; 오히려, 그것은 골절 후 고정 된 시점에서 측정5,7,14,15,16.
이 방법의 제한은 마이그레이션이 단일 셀 수준에서 평가되지 않는다는 것입니다. 오히려 세포 집단의 변화를 통해 측정됩니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스의 생성에 있는 최근 발전 때문에, 개별 적인 세포의 생체 내 추적은 지금 가능합니다. 살아있는 동물 내 생명 현미경 을 사용하여, 우리는 Mx1/토마토/αSMA-GFP 마우스에 있는 24-48 시간 상해 내의 뼈 상해에 calvaria 봉합 틈새 틈새에서 P-SSCs의 명백한 이동을 관찰했습니다.
CCL5/CCR5는 최근 조기 부상 대응 중 채용 및 활성화 P-SSC에 영향을 미치는 규제 메커니즘으로 확인되었습니다. 흥미롭게도, 실시간으로 부상에 대한 응답으로 상당한 P-SSC 마이그레이션의 검출이 없었다. 그러나 CCL5로 부상을 치료하면 실시간으로 캡처할 수 있는 P-SSC의 강력하고 방향별 별다른 마이그레이션이 생성됩니다. 따라서, 이 프로토콜의 목적은 CCL5로 처리한 후에 실시간으로 P-SSC의 생체 내 이동을 기록하는 상세한 방법론을 제공하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; optical post</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G needle</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G insulin syringe</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicol tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>For mouse restraint</td></tr><tr><td>Adjustable angle plate</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine surgical scrub</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sustained Release</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Obtained from staff veterinarian</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Fine tip forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Nonabsorbable sutures</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td></tr><tr><td>Opthalmic ointment</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Right-angle clamp for &amp;frac12;&amp;rdquo; post, 3/16&amp;rdquo; Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Spring-loaded 3/16&amp;rdquo; Hex-locking &amp;frac14;&amp;rdquo; thumbscrew</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterile DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer blood collection set</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G butterfly needle infusion set with 12&quot; tubing</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Periosteal 골격 줄기 세포 (P-SSC)는 평생 뼈 유지 보수 및 수리에 필수적이며 골절 치유를 향상시키기 위한 치료법 개발에 이상적인 초점입니다.  Periosteal 세포는 골절 치유를 위한 새로운 연골 세포 및 골세포를 공급하기 위하여 상해로 급속하게 이동합니다. 전통적으로, 세포 이동을 유도 하는 사이토카인의 효능은 트랜스웰 또는 스크래치 분석 능력을 수행 하 여 체외에서 만 실시 되었습니다. 다광원 여기를 이용한 인트라바이탈 현미경법의 발전과 함께, 최근 1) P-SSC가 CCL5로 알려진 CCR5 리간드를 이용한 철새 유전자 CCR5 및 2) 치료를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, CCL5에 대응하여 골절 치유및 P-SSC의 이동을 향상시킨다. 이러한 결과는 실시간으로 캡처되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 CCL5로 치료 후 부상으로 칼변이 봉합사 골격 줄기 세포(SSC) 틈새 에서 P-SSC 마이그레이션을 시각화하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 마우스 구속 및 이미징 마운트의 구성, 마우스 칼바리아의 수술 준비, 칼바리아 결함 유도 및 시간 경과 이미징의 수집에 대해 자세히 설명합니다.

골격 선조는 철새 또는 순환 잠재력을 가지고 제안되었습니다20. 최근, Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스가 생성되었으며, P-SSC는 Mx1+α SMA+ 듀얼 라벨링(그림 2A,B)으로 표시되어 있습니다. Mx1+α SMA+ P-SSC의 실질적인 마이그레이션은 상해 후 24-48h 11 내에서 봉합사 메센치메에서 발생했습니다.  또한 칼바리아 결함 후 실시간으로 24시간 동안 생체 내 P-SSC 마이그레이션을 검출할 수 있는 가능성을 테스트했습니다. Mx1+αSMA+ P-SSC의 거의 또는 전혀 이동이 이미징의 1h 내에서 관찰되었다(그림 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSC는 CCR511로 알려진 CCL5 수용체를 고유하게 표현한다. 따라서, CCL5를 가진 calvaria 결함 24h의 치료는 관상 봉합사에서 멀리 떨어져 부상 시력을 향해 방향적으로 구별된 이동을 유도하였다(도 2D, E). 이미징의 1 시간 이내에 Mx1 + αSMA + P-SSC 중 하나가 부상으로 약 50 μm을 이동 (그림 2E). 다른 Mx1+αSMA+ P-SSC도 CCL5 치료에 대응하지만 더 적은 범위에서 마이그레이션하는 것을 관찰했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61162/61162fig1.jpg"> 그림 1: 마우스 칼바리아의 생체 내 이미징을 위한 셋업. 라이브 이미징 중에 사용되는 마우스 구속(A) 및 이미징 마운트(B)의 대표적인 이미지. (C) 구속에 마우스와 이미징 마운트에 고정. (D) 마우스 칼바리아 구조의 회로도 표현, 정면 (FS), 관상 (CS), 처진 (SS), 및 람도이드 (LS) 봉합사를 식별. (E) 칼바리아 미세 골절 부상의 대표 배치. (F) 최적의 치유와 미래의 이미징을 위한 수술 후 봉합사 배치. 현미경 단계 (G) 및 커버 슬립 배치 (H)에 마운트 배치의 대표적인 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61162/61162fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61162/61162fig2.jpg"> 그림 2: Mx1+αSMA+ P-SSC 마이그레이션 의 실시간 생체 내 이미징. (A) Mx1/토마토/αSMA-GFP 듀얼 리포터 마우스 제제의 회로도.  마우스는 10 일 (1)에 대해 격일로 25 mg /kg pIpC로 회대적으로 주입되었다. Mx1/토마토/αSMA-GFP 마우스는 WT C57BL/6 마우스(3)로부터 1 x 106전체 골수 단일핵 세포의 정맥 이식 1일 전에 9.5 Gy(2)로 치명적으로 조사되었다.  6-8주 간의 회복 후(호스트의 조혈 세포가 5% 미만인 경우), 마우스는 뼈 부상 실험을 거쳤습니다. Mx1+(토마토+), αSMA+(GFP+), Mx1+α SMA+(토마토+GFP+), 뼈(파란색). (B) Mx1/토마토/αSMA-GFP 마우스의 좌활(SS) 및 관상(CS) 봉합사와 관련하여 대표적인 칼바리아 상해(white circle) 및 이미징(white square) 위치의 최대 Z 프로젝션.  점선은 칼바리아 봉합사를 나타냅니다. (C) Mx1+α SMA+ P-SSC 반응 24시간 후의 생체 내 이미징. 스케일 바 = 25 μm. (D) 24h 후 부상, CCL5는 부상 시력에서 투여되었고, 생체 내 이미징은 관상 봉합사(CS)와 관련하여 1시간 후에 수행되었다. 흰색 사각형은 (E)에 표시된 셀 마이그레이션 이미지의 위치를 나타냅니다. 스케일 바 = 75 μm.  (E) 뼈(파란색) 표면의 Mx1+α SMA+ P-SSC의 이주가 부상 시야(오른쪽 상단)를 향해 이동합니다. 스케일 바 = 25 μm. (C, D, E)에서 숫자는 이미징 시간을 나타냅니다. 노란색 화살표는 부상 위치의 방향을 나타냅니다. 별표는 Mx1+α SMA+ P-SSC의 철새 경로를 나타냅니다. 이미지는 3~5마리의 마우스의 결과를 대표한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61162/61162fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K 조회수.  Baylor College of Medicine. 이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

비디오: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

연구

발생학

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

신경과학

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

의학

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

면역학 및 감염병학

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

생물학

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

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