저자는 영장류 식물 성 식품의 에스트로겐 활동을 결정하기 위해 일시적인 과실 작용 작용의 사용에 초기 교육에 대한 데일 라이트먼에 감사드립니다. 브래드포드 웨스트리치와 C. 에릭 존슨 덕분에 실험실 장비를 설치하고 학생들을 추출 방법으로 교육하는 데 도움을 주었습니다. 마지막으로, 이 연구에 자금을 지원해 주신 인디애나 대학교에 감사드립니다.

1. 식물 재료의 준비
<ol><li>리오필라이저를 사용하여 신선한 수거된 건조 식물 아이템을 동결하십시오.<ol>
<li>빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 건조 공정 중에 알루미늄 호일로 챔버를 덮습니다.</li>
		<li>샘플이 완전히 건조하도록 하기 위해 챔버가 더 이상 차갑게 느껴지지 않고 계량시 더 이상 질량을 잃지 않도록 합니다.</li>
		<li>분쇄 될 때까지 빛이없는 멸균 낮은 잔류 물 봉투에 말린 식물을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.85mm 메쉬 스크린을 갖춘 분쇄 공장을 사용하여 샘플을 미세하게 연마합니다.<ol>
<li>추출 될 때까지 빛이없는 가방에 접지 샘플을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 식물 이차 대사 산물 추출
<ol><li>이차 식물 대사 산물을 추출하려면 HPLC 급 메탄올의 10 mL에 건조 된 샘플 1 g의 비율을 사용합니다.<ol>
<li>분석 균형에 샘플을 무게와 적절한 크기의 Erlenmeyer 플라스크 (125 – 250 mL)에 추가합니다. 그런 다음 메탄올의 적절한 볼륨을 추가합니다. 추출된 샘플의 질량을 기록합니다.</li>
		<li>알루미늄 호일로 식물 메탄올 용액을 덮은 다음 궤도 셰이커에서 3일 동안 실온(RT)에서 100rpm 속도로 회전하여 잠재적으로 에스트로겐 화합물이 메탄올에 용해될 수 있도록 설정합니다.</li>
		<li>필터 용지(125mm)를 사용하여 상체를 드립 여과 시스템에 넣습니다.</li>
		<li>회전 증발기는 시료가 두꺼워질 때까지 식물 추출물을 건조하지만 300mL 의 둥근 바닥 플라스크에 붓습니다. 샘플을 50mL 원형 플라스크에 붓고, 소량의 메탄올로 큰 플라스크를 헹구세요. 메탄올이 완전히 증발 될 때까지 작은 플라스크에서 샘플을 계속 건조시.</li>
		<li>분석 균형을 사용하여 샘플 잔류물을 계량합니다. 잔류물 질량을 기록합니다.</li>
		<li>DMSO의 2mL에 0.1 g의 추출물 농도로 디메틸 설산화물(DMSO)에 식물 추출물을 용해한다. 균질화 될 때까지 소용돌이.</li>
		<li>식물 추출물-DMSO 용액을 호박유리 바이알에 4°C에 저장하여 분석할 때까지 보관한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>주의: 식물은 알려지지 않은 생물학적 활성 화학 물질을 생산할 수 있으며, DMSO는 세포막을 통해 운반할 수 있는 차량입니다. 이러한 샘플을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비와 관리를 사용하십시오.
3. 인간 에스트로겐 수용체 β 트랜스페션 분석12
참고: 무균 기술과 라미나르 플로우 후드는 분석 프로토콜의 1일째에 필요합니다.
<ol><li>표준 곡선을 위해 17β-Estradiol의 희석을 준비합니다.<ol>
<li>37°C 수조에서 냉동고 저장에서 세포 회수 배지 및 화합물 스크리닝 배지(CSM)를 전송합니다.</li>
		<li>라벨 마이크로 센심 분리기 튜브 중간 1 및 2 (INT1, INT2) 및 1-8.</li>
		<li>CSM의 995 μL, CSM의 615 μLINT2, CSM의 900 μL을 가진 튜브 1, 그리고 600 μL의 튜브 2-8로 INT1을 채웁니다. 튜브 8을 따로 설정합니다.</li>
		<li>100 μM 17β-Estradiol 스톡의 5 μL을 INT1로 옮기. 팁을 삭제합니다. 소용돌이.</li>
		<li>각 전송 전에 파이펫을 3번 헹구고 INT1에서 INT2로 10 μL을 전송합니다. 팁을 삭제합니다.</li>
		<li>파이펫을 3번 헹신 다음 INT2에서 100 μL을 튜브 1로 옮킨다. 팁을 폐기합니다. 튜브 1에서 튜브 2로 300 μL을 옮기습니다. 튜브 3에서 7까지 반복하십시오. 튜브 7에서 300 μL을 폐기하여 폐기물 용기에 넣습니다. 튜브 8은 제로이며 에스트라디올을 받지 않습니다. 도금 기준의 최종 농도는 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 및 0 pM estradiol입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 화합물을 준비합니다.<ol>
<li>소용돌이 샘플.</li>
		<li>DMSO의 각 식물 샘플의 4 μL을 취하고 CSM의 496 μL에 추가하여 0.8 % DMSO 솔루션을 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기자 셀을 급속히 해동합니다.<ol>
<li>37°C 수조에서 세포 회수 배지의 튜브를 회수합니다. 70% 에탄올을 사용하여 외부 표면을 소독합니다.</li>
		<li>-80°C 저장에서 리포터 셀을 검색하고 냉동 셀의 튜브로 미리 따뜻워진 CRM의 10mL를 전송하여 해동합니다.</li>
		<li>기자 세포의 튜브를 닫고 5-10 분 동안 37 ° C 수조로 옮습니다.</li>
		<li>수조에서 리포터 셀 서스펜션의 튜브를 검색합니다. 세포의 튜브를 여러 번 부드럽게 반전하여 세포의 응집체를 분해하고 균일한 현탁액을 생성합니다. 70% 에탄올로 튜브 표면을 청소합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 도금<ol>
<li>다중 채널 파이펫을 사용하여 리포터 셀 서스펜션의 100 μL을 각 우물에 분배합니다.</li>
		<li>시료 100μL을 삼중시로 분배하여 적절한 분석 우물에 넣습니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C로 옮기고, 22-24h의 가습5%CO2 인큐베이터로 옮김한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2일째를 준비하기 위해 밤새 어두운 냉장고에서 검출 기판 및 검출 버퍼를 해동합니다.</li>
	<li>플레이트 인큐베이션이 끝나기 직전에 냉장고에서 검출 기판 및 검출 버퍼를 제거하고 RT에 평형될 때까지 저조도 영역에 배치합니다. RT에서 한 번, 철저하게 솔루션을 혼합하기 위해 부드럽게 여러 번 각 튜브를 반전.<ol>
<li>인큐베이션이 완료되기 직전에 검출 버퍼의 전체 내용을 검출 기판 튜브에 부어 루시파아제 검출 시약을 만듭니다. 거품을 생산하지 않도록 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>인큐베이션이 완료되면 플레이트를 뒤집어 콘텐츠를 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 깨끗한 흡수성 종이 타월에 접시를 부드럽게 두드려 우물에서 마지막 물방울을 제거합니다.</li>
		<li>각각의 우물에 루시파아제 검출 시약의 100 μL을 추가합니다. 분석 접시를 RT에서 15분 동안 쉬게 하십시오. 접시를 흔들지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>96웰 플레이트 판독 광등계를 사용하여 발광을 정량화합니다.</li>
</ol>

<ol>
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개별적으로 검사하는 의약품 제제에 개발된 ERβ 리포터 분석체는 ERβ를 통해 생물학적으로 활성된 식물성 에스트로겐을 위한 식물성 식품을 선별하는 데도 적합하다. 프로토콜에서 중요한 고려 사항은 식물 샘플을 신중하게 치료하는 것을 포함합니다 : 신선한 식물 재료는 성형 또는 기타 생물학적 저하를 방지하기 위해 신속하게 건조되어야하며 화합물(18)의광분해를 방지하기 위해 빛으로부터 멀리 보관해야합니다. 제조업체에서 제공하는 분석프로토콜(12)은 명확하며 스크리닝 을 위해 거의 수정이 필요합니다. 제조업체가 제안한 표준 곡선은 상부 및 하단 고원을 유지하면서곡선(그림 1)의지수 범위에 속하는 점수를 증가시키기 위해 이 프로토콜에서 수정되었습니다. 정량 분석을 위해이 분석을 사용할 수 있지만, 우리의 목적은 식물을 생물학적 효과, 음식 선택 및 동물을 소비하는 동물의 다른 행동에 높은 활성을 연결하는 것입니다.
추출 및 분석의 효과를 보다 자세히 설명하기 위해 대두추출물(도 2)을함유한 용량 반응 곡선을 포함하고 정상적인 추출 프로토콜의 효능을 감안할 때, 대두는 신호가 최대 50%까지 떨어지기 전에 광범위하게 희석되어야 한다고 판단하였다. 이것은 식물성 에스트로겐의 고농도에서 안정적인 최대 신호에서 신호 고원이라는 사실을 강조한다. 매우 낮은 농도에서 신호는 배경과 구별 될 만큼 강하지 않을 수 있습니다. 시료의 저량에 존재하는 식물성 에스트로겐을 감지하기 위해 고농도의 추출물로 작업하여 거짓 네거티브를 최소화하는 것이 중요합니다. 처음에 실험실은 메탄올 추출에서 식물 잔류물 (즉, 식물 잔류물의 0.1 g에 DMSO의 10 mL)에 비해 DMSO의 더 큰 양을 사용했다. 샘플은 양수 샘플에서 강한 발광을 유도하기에 너무 희석되었습니다. 리포터 셀 생존가능성 및 플레이트 내의 부피 제약에 대한 최대 DMSO 백분율로 인해 식물 잔류물에 DMSO를 추가할 때 샘플 추출 농도를 최적화해야 합니다. 간장과 같은 양성 조절은 세포가 실행 가능하고 발광능력이 있는지 확인하고, 추출물 농도가 응답을 유도하기에 충분하다는 것을 확인하기 위해 모든 플레이트에 포함되어야 한다.
이 분석체는 ERβ에 결합하는 화합물을 검출하지만, 모든 식물성 에스트로겐이 동일한 작용 메커니즘을 가지고 있는 것은 아닙니다. 이러한 분석 프로토콜은 에스트라디올과 식물 화합물의 조합으로 세포를 배양하여 샘플9,12에서항에스트로겐 활성이 있는지 검출할 수 있다. Estradiol은 ER에 큰 친화력을 가지고 있으므로 식물성 에스트로겐의 존재는 에스트로겐에 대한 반응을 감소시키는 수용체를 차단하여 estradiol의 존재시 항에스트로겐 생물학적 활성을 가질 수 있습니다. 항에스트로겐 활성 식물 추출의 농도 증가와 총 활성화의 감소에 의해 감지 될 것 이다. 이 분석법은 멤브레인 바인딩RRs(19)에바인딩하는 것과 같은 다른 동작 방법을 감지하지 않습니다. 더욱이, 몇몇 식물성 에스트로겐은 창자 세균에 의해 대사될 때까지 생물학으로 활성화되지 않습니다20. 그들의 미전증 상태에서 아무 또는 낮은 에스트로겐 활성이 없는 몇몇 식물이 이 분석이 검출하지 않을 것이라는 더 높은 에스트로겐 활동 사후 대사가 있을 수 있습니다.
ERβ 기자 분석법은 식물성 에스트로겐이 ERβ에 더 강하게 결합하기 때문에 식물에서의 활성에 대한 식물성 에스트로겐의 스크리닝을 예시하도록 선택되었다21. ERα 활성에 대한 스크리닝은 유사한 분석을 통해 가능하며, 여기서 세포는 ERβ가 아닌 ERα 유전자로 전염된다.
활성 식물성 에스트로겐에 대한 긍정적 인 스크리닝 에 이어 활성 화합물은 크로마토그래피 방법으로 식별 할 수 있습니다. 실제로, 그 시점에서 격리된 화합물은 이 분석기 및 반 최대 유효 농도(EC50)를사용하여 시험될 수 있으며, 화합물의 효능의 척도로서 희석 계열을 사용하여 결정될 수 있다.
이 분석은 생물학적 에스트로겐 활성을 테스트하는 신뢰할 수 있고 간단한 방법이며, 에스트로겐 활성 메커니즘의 폭에 대한 한계를 염두에 두고 있습니다. 그것은 일시적인 과도 분석, 특히 사용의 용이성, 세포의 안정성 및 분석의 감도에 대한 몇 가지 개선이 있습니다.
인간이나 야생 동물이 소비하는 야생 식물성 식품에서 식물성 에스트로겐의 보급에 대해서는 거의 알려져없지만,연구에 따르면 식단에서 에스트로겐 PSM에 노출되면 오래 지속되는 효과가 있을 수있습니다(23). 이러한 화합물을 감지 하는 간단한 강력한 분석, 먹는 금액을 평가 하는 연구와 함께 그리고 그들은 먹을 때, 다이어트에 에스트로겐 식품을 포함 의 기능 및 생리 시스템에 이러한 화합물의 효과 결정하는 강력한 단계.

식물은 생존, 번식, 성장, 발달 및 행동1에중요한 칼로리와 영양소를 제공하는 많은 동물에게 필요한 식량 공급원입니다. 식물은 수천 개의 화학 물질을 생산하며, 많은 화학 물질은 자체 성장, 금식 유지 보수 및 재생을 위한 적응으로 많은 것을 생산합니다. 다른 화합물, 간주 식물 이차 대사 산물 (PSM), 덜 명확한 기능을 가지고, 일부는 독성과 가능성이 약초 및 기생에 대한 방어로 사용하지만 (예를 들어, 알칼로이드, 탄닌)2,3. 이러한 화학 물질 중 일부는 내분비 기능과 같은 동물의 장기 생리 적 과정에 영향을 미칠 수있는 능력을 가지고 있지만, 이러한 내분비 활성 식물화학 물질이 척추 동물 내분비 시스템과 상호 작용하는 이유는 여전히 불분명2,4.
가장 잘 연구된 내분비 활성 식물화학 물질인 식물성 내스트로겐은 구조적으로 나기능적으로 에스트로겐을 모방하여 척추동물 내분비 시스템5의hypothalomo-뇌하수체 고나달 축과 직접 상호 작용하는 폴리페놀식 PSM입니다. 인간 규정식에 있는 식물성 에스트로겐의 섭취는 몇몇 암, 심장병 및 갱년기 현상에 대하여 보호와 연관됩니다, 그밖 효력은 불임 문제를 포함하더라도. 사실, 이러한 화합물의 생리적 효과는 1940년대에 양에서 불임이 식물에스트로겐이 풍부한 클로버(Trifolium지하)에방목된 것으로 인해발견되었습니다. 섭취 할 때, 식물성 에스트로겐은 세포로 전달하고 에스트로겐의 효과를 모방 할 수 있습니다. 식물성 에스트로겐은 양 불임에 부정적인 영향을 주었지만, 식물성 에스트로겐과 생리학 사이의 관계는 간단하지 않습니다. 양처럼, 남부 흰 코뿔소는 대두와 알팔파의 다량에서 파생 된 사료에 에스트로겐 화합물에 감도를 표시합니다. 임신 중이 다이어트를 먹이 여성의 딸은7을재현 할 가능성이 적습니다. 그러나, 다른 연구는 식물성 에스트로겐뿐만 아니라 긍정적 인 효과를 가질 수 있음을 보여 주었다, 이전 마우스에서 난소 여포의 성숙을 포함8,특정 암의 예방, 항산화 활성, 및 항증식 효과9.
식물성 에스트로겐의 효과의 폭은 에스트로겐이 생식 및 중추 신경계의 성장, 발달 및 조절을 포함한 다양한 생물학적 기능에 영향을 미친다는 점을 감안할 때 놀라운 일이 아니다10. 행동의 많은 메커니즘이 있지만, 식물에스트로겐은 종종 수정 하는 능력을 가지고, 강화, 또는 핵 내 에스트로겐 수용 체 알파 와 베타에 대 한 리간드로 작동 하는 그들의 능력을 통해 에스트로겐 신호를 방해 (ERα 및 ERβ). 많은 식물성 에스트로겐은 에스트로겐 수용체를 결합 할 수 있도록 에스트로겐과 유사한 페놀 링 구조를 가지고 있습니다. 에스트로겐과 같은 고뇌에 탄성 적 활성 기능을 가진 사람들은 에스트로겐 반응 요소 (ERE)에 이질하고 결합할 수 있는 활성화된 ER-리간드 복합체를 형성하고 유전자 전사를 유발한다11. 따라서, 에스트로겐과 식물성 에스트로겐은 전사 요인으로 그들의 행동을 통해 세포 활동 및 시스템 기능을 조절합니다.
여기서 우리는 에스트로겐성 생물학적 활성을 갖는 화합물의 존재를 위해 식물 추출물을 선별하기 위해 세포 기반 분석의 새로운 사용을 제시합니다. 이 분석은 ERE프로모터(12)에연결된 반딧불(Photinuspyralis)루시파라제 유전자로 전염된 ERβ를 높게 발현하도록 설계된 중국 햄스터 난소 CHO 세포를 사용한다. 에스트로겐 화합물이 존재할 때, 그들은 ER에 결합, 이질, 그리고 ERE에 결합, 루시 파 제 유전자의 전사로 이어지는. 기판 용액을 추가하면, 루시파라제는 광자 방출로 이어지는 반응을 촉매합니다. 따라서 양수 샘플은 빛을 생성하고 음의 샘플은 생성하지 않습니다.
이러한 시판상 분석은 항성 및 용이성에서 불안정하고 가변적이었던 리포터 유전자 및 에스트로겐수용체(13,14)로포유류 세포를 이식할 실험실의 필요성을 제거한다. 분석법은 식물이 수용체 결합을 통해 에스트로겐 활성을 가지고 있는지 여부를 신속하고 간단하게 결정할 수있는 안정적인 트랜스펙트 플랫폼을 제공합니다.
우리는 콩이 현지 식료품에서 인간의 음식을 사용하여 에스트로겐 이소플라본15의 알려진 농도주어진 다른 모든 식품보다 더 높은 에스트로겐 활성을 가지고 가설을 테스트합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

식물은 많은 동물을위한 음식의 원천이며 수천 개의 화학 물질을 생산할 수 있습니다. 이러한 화합물 중 일부는 내 분 비 기능 등 그들을 소비 하는 척추 동물에 생리 적 과정에 영향을. 가장 잘 연구된 내분비 활성 식물화학 물질인 식물성 물질은 척추동물 내분비 시스템의 시상라모-뇌하수체 골나달 축과 직접 상호 작용합니다. 여기서 우리는 에스트로겐성 생물학적 활성을 갖는 화합물의 존재를 위해 식물 추출물을 선별하기 위해 세포 기반 분석의 새로운 사용을 제시합니다. 이 분석체는 고도의 발현 에스트로겐 수용체 베타 (ERβ)로 설계된 포유류 세포를 사용하고 루시파아제 유전자로 감염되었습니다. 에스트로겐 활성 화합물에 노출 빛을 생산 하는 세포 결과. 이 분석은 생물학적 에스트로겐 성 활동을 테스트하는 신뢰할 수 있고 간단한 방법입니다. 그것은 일시적인 과도 분석, 특히, 사용의 용이성, 세포의 안정성 및 분석의 감도에 대한 몇 가지 개선이 있습니다.

인간의 식단에서 흔히 발견되는 과일과 채소의 22추출물은 에스트로겐 화합물의 존재를 위해 선별되었습니다. 완두콩 가족은 식물성 식물성 식품16의알려진 공급원뿐만 아니라 무화과, 날짜, 옥수수, 당근, 사과, 바나나, 딸기, 토마토, 케일 및 양배추와 같은 콩류를 포함한 다양한 식품을 분석했습니다. 내분비 방해 화합물은 일반적인 물질 (예를 들어, 플라스틱 및 살충제)에서 발견되며 일부는 ERs17을통해 생물학적으로 활성화됩니다. 가능하면 유기 및 비무기 재배 품목 모두 에스트로겐 활성을 가진 살충제가 결과에 영향을 줄 수 있는 가능성을 설명하기 위해 분석되었습니다.
각 식물 식품 품목은 삼중으로 도금되었고 광미계는 상대 조명 단위 (RLUS)에서 각 우물의 활동을보고했습니다. RLUs의 배경 수준은 표준 8, 제로 농도와 표준 곡선에서 결정되며 참조에 사용됩니다.  곡선의 0점에 대한 RLU 위의 배율인 접이식 활성화 값은 방정식에 의해 계산됩니다.
접이식 = 알 수 없음(RLU) ÷ 표준 8(RLU)
해석 목적을 위해, 에스트로겐 활동은 높은, 메드, 낮은, 또는 활동의 정수, 질적 방식으로 제시된다. 높은 수준의 활동 은 표준 4 배 활성화 값 위에 등록됩니다. 중간값은 표준 5와 표준 4 사이이며 낮은 값은 표준 6과 표준 5 사이입니다. 표준 7 미만의 접이식 활성화 값이 있는 모든 샘플은 활동 없음으로 간주됩니다. 표 1을참조, 콩, 유기 및 비 유기, 활동의 높은 수준에서 선별, 다른 모든 과일과 야채 항목은 활동을 등록하지 않은 동안. 대두 결과를 표준곡선(그림 1)과비교하면 유기적으로 재배하든 그렇지 않든, 이러한 농도에서 에스트라디올 활성 수준에 대한 곡선에서 높은 점수를 받는 것을 보여준다. 대두 추출물은 이소플라본 디제인 및 제니스타인9의알려진 강력한 공급원으로서, 희석을 최대로 50% 신호를 산출하는 것을 결정하기 위해 더 많이사용되었다(도 2). 이 추출물은 표준 희석 프로토콜의 절반 신호를 생성하기 위해 422배 더 희석이 필요합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>아이템 생산</td>
			<td>유기농/비유기농</td>
			<td>상대 라이트 유닛(Lum)</td>
			<td>접이식 활성화</td>
			<td>접이식 활성화(평균)</td>
			<td>식물성 에스트로겐 활동</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">콩</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>1687</td>
			<td>29.016</td>
			<td rowspan="3">31.06</td>
			<td rowspan="3">높은</td>
		</tr><tr><td>2023</td>
			<td>34.796</td>
		</tr><tr><td>1706</td>
			<td>29.353</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">콩</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>2041</td>
			<td>35.106</td>
			<td rowspan="3">32.05</td>
			<td rowspan="3">높은</td>
		</tr><tr><td>1956</td>
			<td>33.647</td>
		</tr><tr><td>1593</td>
			<td>27.399</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">스노우 완두콩</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>53</td>
			<td>0.919</td>
			<td rowspan="3">0.92</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>49</td>
			<td>0.836</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">스냅 완두콩</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>66</td>
			<td>1.142</td>
			<td rowspan="3">1.21</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>60</td>
			<td>1.032</td>
		</tr><tr><td>85</td>
			<td>1.462</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">옥수수</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>29</td>
			<td>0.502</td>
			<td rowspan="3">0.53</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.513</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.575</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">딸기</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>35</td>
			<td>0.609</td>
			<td rowspan="3">0.77</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.808</td>
		</tr><tr><td>51</td>
			<td>0.884</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">딸기</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>56</td>
			<td>0.956</td>
			<td rowspan="3">0.88</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.678</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">바나나</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>32</td>
			<td>0.544</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.489</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">바나나</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>33</td>
			<td>0.564</td>
			<td rowspan="3">0.60</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>41</td>
			<td>0.712</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">질경이</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>37</td>
			<td>0.64</td>
			<td rowspan="3">0.70</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.805</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">양배추</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>26</td>
			<td>0.447</td>
			<td rowspan="3">0.47</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>26</td>
			<td>0.444</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.519</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">양배추</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>40</td>
			<td>0.685</td>
			<td rowspan="3">0.63</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.485</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.719</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">양배추</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>33</td>
			<td>0.568</td>
			<td rowspan="3">0.54</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>27</td>
			<td>0.468</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.588</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">양배추</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>44</td>
			<td>0.757</td>
			<td rowspan="3">0.66</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.585</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.626</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">애플</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>30</td>
			<td>0.523</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>0.437</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.509</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">애플</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>41</td>
			<td>0.705</td>
			<td rowspan="3">0.62</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>37</td>
			<td>0.63</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">토마토</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>51</td>
			<td>0.874</td>
			<td rowspan="3">0.87</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>57</td>
			<td>0.974</td>
		</tr><tr><td>44</td>
			<td>0.76</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">토마토</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>61</td>
			<td>1.056</td>
			<td rowspan="3">1.19</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>81</td>
			<td>1.386</td>
		</tr><tr><td>66</td>
			<td>1.128</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">당근</td>
			<td rowspan="3">유기</td>
			<td>33</td>
			<td>0.575</td>
			<td rowspan="3">0.51</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.561</td>
		</tr><tr><td>22</td>
			<td>0.382</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">당근</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>31</td>
			<td>0.53</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>21</td>
			<td>0.365</td>
		</tr><tr><td>38</td>
			<td>0.657</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">그림</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>29</td>
			<td>0.506</td>
			<td rowspan="3">0.61</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.716</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.619</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">날짜</td>
			<td rowspan="3">비유기농</td>
			<td>29</td>
			<td>0.495</td>
			<td rowspan="3">0.59</td>
			<td rowspan="3">활동 없음</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>35</td>
			<td>0.602</td>
		</tr></tbody></table>표 1. 식물성 에스트로겐 활성과 과일 및 채소 품목의 검사를위한 ERβ 리포터 분석 시스템의 대표적인 결과. 양수 활동은 높음, Med, 낮음 또는 활동 없음으로 표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig1.jpg"> 그림 1. ERβ리포터 분석 시스템을이용하여 17β-Estradiol 표준(표준 1~8농도 = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 및 0 pM)의 직렬 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig1large.jpg" target="_blank">희석을 클릭하여 본 를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig2.jpg"> 그림 2. ERβ 리포터 분석은 대두 추출물의 직렬 희석을 사용하여 최대 신호의 50%인 신호 대 배경 비율을 산출한 희석을 결정합니다. 표준 추출 방법으로부터 디메틸 설산화물(DMSO)의 식물 추출물을 0.1g의 추출물 농도에서 DMSO의 2mL로, 대두는 최대 응답의 신호 50%를 유도하기 위해 422회 희석되어야 한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

우리는 에스트로겐 활성에 대한 인간 및 비 인간 영장류 식품을 선별하기위한 기자 분석 β 시판 가능한 에스트로겐 수용체를 최적화했습니다. 우리는 알려진 에스트로겐 성 인간 음식 콩 높은 등록 을 보여 줌으로써이 분석 확인, 다른 식품은 활동을 표시 하지 않는 동안.

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K 조회수.  Indiana University. 우리는 에스트로겐 활성에 대한 인간 및 비 인간 영장류 식품을 선별하기위한 기자 분석 β 시판 가능한 에스트로겐 수용체를 최적화했습니다. 우리는 알려진 에스트로겐 성 인간 음식 콩 높은 등록 을 보여 줌으로써이 분석 확인, 다른 식품은 활동을 표시 하지 않는 동안.

비디오: Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  β Reporter Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

폐경 후 심장 혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 선별하기위한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis disorder and damage of intestinal mucosa and seems to be associated with an increased risk of colon neoplastic transformation. Accumulating evidence indicates that estrogens and estrogen receptors affect not only hormone-sensitive tissues, but also other tissues not directly related to estrogens, such as the lungs or colon. Here, we describe the protocol for the successful immunofluorescence staining of estrogen receptors in colon obtained from a murine model of TNBS-induced Crohn&#39;s disease. A detailed protocol for the induction of Crohn&#39;s disease in mice and intestine preparation is provided as well as a step-by-step immunohistochemical procedure using formalin-fixed paraffin-embedded intestine sections. The described methods are not only useful for estrogen receptor detection and estrogen signaling investigation in vivo but can also be applied to for other proteins which may be involved in the development of colitis.

The protocol presents a complete validated TNBS-induced murine model of Crohn&#39;s disease and methods for visualization of estrogen receptors by immunohistochemistry using immunofluorescence of formalin-fixed colon sections embedded in paraffin.

면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest advantage of NMR-based fragment screening is its ability not only to detect binders over 7-8 orders of magnitude of affinity but also to monitor purity and chemical quality of the fragments and thus to produce high quality hits and minimal false positives or false negatives. A prerequisite within the FBS is to perform initial and periodic quality control of the fragment library, determining solubility and chemical integrity of the fragments in relevant buffers, and establishing multiple libraries to cover diverse scaffolds to accommodate various macromolecule target classes (proteins/RNA/DNA). Further, an extensive NMR-based screening protocol optimization with respect to sample quantities, speed of acquisition and analysis at the level of biological construct/fragment-space, in condition-space (buffer, additives, ions, pH, and temperature) and in ligand-space (ligand analogues, ligand concentration) is required. At least in academia, these screening efforts have so far been undertaken manually in a very limited fashion, leading to limited availability of screening infrastructure not only in the drug development process but also in the context of chemical probe development. In order to meet the requirements economically, advanced workflows are presented. They take advantage of the latest state-of-the-art advanced hardware, with which the liquid sample collection can be filled in a temperature-controlled fashion into the NMR-tubes in an automated manner. 1H/19F NMR ligand-based spectra are then collected at a given temperature. High-throughput sample changer (HT sample changer) can handle more than 500 samples in temperature-controlled blocks. This together with advanced software tools speeds up data acquisition and analysis. Further, application of screening routines on protein and RNA samples are described to make aware of the established protocols for a broad user base in biomacromolecular research.

Fragment-based screening by NMR is a robust method to rapidly identify small molecule binders to biomacromolecules (DNA, RNA, or proteins). Protocols describing automation-based sample preparation, NMR experiments &#38; acquisition conditions, and analysis workflows are presented. The technique allows for optimal exploitation of both 1H and 19F NMR-active nuclei for detection.

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...