Yazarlar, primat bitki gıdalarının östrojenik aktivitesini belirlemek için geçici transfeksiyon testlerinin kullanımındaki ilk eğitim için Dale Leitman'a minnettardır. Bradford Westrich ve C. Eric Johnson'a laboratuvar ekipmanlarının kurulmasına ve öğrencilerin ekstraksiyon yöntemlerine eğitmelerine yardımcı oldular. Son olarak, bu araştırmayı finanse ettiğiniz için Indiana Üniversitesi'ne teşekkür ederiz.

1. Bitki malzemelerinin hazırlanması
<ol><li>Bir liyofilzer kullanarak taze toplanan kuru bitki öğelerini dondurun.<ol>
<li>Numuneleri ışıktan korumak için, kurutma işlemi sırasında odaları alüminyum folyo ile örtün.</li>
		<li>Numunelerin tamamen kuru olduğundan emin olmak için, odalar dokunmak için artık soğuk hissetmeyene ve bitki malzemeleri tartıldığında kütle kaybetmeyene kadar liyofilize edin.</li>
		<li>Kurutulmuş bitkileri öğütülene kadar ışık yokluğunda steril düşük kalıntı torbalarında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,85 mm örgü ekranlı bir taşlama değirmeni kullanarak numuneleri ince öğütün.<ol>
<li>Zemin örneklerini ekstraksiyona kadar ışık yokluğunda torbalarda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bitki ikincil metabolitlerinin ekstraksiyonu
<ol><li>İkincil bitki metabolitlerini çıkarmak için, 1 g kurutulmuş numune ile 10 mL HPLC sınıfı metanol oranı kullanın.<ol>
<li>Örneği analitik bir teraziye tartın ve uygun boyutta bir Erlenmeyer şişesine (125 – 250 mL) ekleyin. Daha sonra uygun miktarda metanol ekleyin. Ayıklanan numune kütlesini kaydedin.</li>
		<li>Bitki-metanol çözeltisini alüminyum folyo ile örtün ve daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcıda 3 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) 100 rpm hızında dönmeye ayarlayın ve potansiyel olarak östrojenik bileşiklerin metanol içinde çözünmesini sağlar.</li>
		<li>Süpernatantı filtre kağıdı (125 mm) kullanarak damlama filtrasyon sistemine dekantasyon.</li>
		<li>Bir döner evaporatör kullanarak, numune kalınlaşana kadar bitki özünü kurutun, ancak 300 mL yuvarlak tabanlı bir şişede dökülebilir. Numuneyi 50 mL yuvarlak tabanlı bir şişeye dökün, büyük şişeyi az miktarda metanol ile durulayın. Metanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi küçük şişede kurutmaya devam edin.</li>
		<li>Analitik bir terazi kullanarak numune kalıntısını tartın. Kayıt kalıntısı kütlesi.</li>
		<li>Bitki ekstresini 0,1 g'lık bir ekstrakt ile 2 mL DMSO konsantrasyonunda dimetil sülfit (DMSO) içinde çözün. Homojenleşene kadar girdap.</li>
		<li>Bitki özü-DMSO çözeltisini test edilene kadar kehribar cam şişelerde 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>DİkKAT: Bitkiler bilinmeyen biyolojik olarak aktif kimyasallar üretebilir ve DMSO onları hücre zarları arasında taşıyabilen bir araçtır. Bu numuneleri kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman ve özeni kullanın.
3. İnsan östrojen reseptörü β transfeksiyon tahlil12
NOT: Test protokolünün 1.
<ol><li>Standart eğri için 17β-Estradiol seyreltmeleri hazırlayın.<ol>
<li>Hücre Geri Kazanımı Orta ve Bileşik Tarama Ortamını (CSM) dondurucu deposundan aktarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.</li>
		<li>Etiket mikrosantrifüj tüpleri Orta 1 ve 2 (INT1, INT2) ve 1-8.</li>
		<li>INT1'i 995 μL CSM ile, INT2'yi 615 μL CSM ile, tüp 1'i 900 μL CSM ile ve 2-8 tüpleri 600 μL CSM ile doldurun. Tüp 8'i kenara koyun.</li>
		<li>100 μM 17β-Estradiol Stoğunun 5 μL'lik kısmını INT1'e aktarın. Ucu atın. Girdap.</li>
		<li>Her aktarımdan önce pipetleri 3 kez durulayın ve ardından INT1'den INT2'ye 10 μL aktarın. Ucu atın.</li>
		<li>Pipetleri 3 kez durulayın ve ardından INT2'den 100 μL'yi tüp 1'e aktarın. Ucu atın. 300 μL'i tüp 1'den tüp 2'ye aktarın. 3 ile 7 arasında tüpler için tekrarlayın. 300 μL'yi tüp 7'den atık kabına atın. Tüp 8 bir Sıfır'dır ve estradiol almaz. Kaplamalı standartların son konsantrasyonları şunlardır: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ve 0 pM estradiol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numune bileşikleri hazırlayın.<ol>
<li>Girdap örnekleri.</li>
		<li>DMSO'daki her tesis örneğinden 4 μL alın ve %0,8 DMSO çözeltisi elde etmek için 496 μL CSM ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muhabir Hücrelerini hızla çözün.<ol>
<li>Hücre Kurtarma Ortamı tüpünü 37 °C su banyosundan alın. % 70 etanol kullanarak dış yüzeyi dezenfekte edin.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış CRM'nin 10 mL'lik kısmını donmuş hücrelerin tüpüne aktararak -80 °C depolamadan Reporter Hücrelerini alın ve çözün.</li>
		<li>Reporter Cells tüpünü kapatın ve 5-10 dakika boyunca 37°C su banyosuna aktarın.</li>
		<li>Muhabir Hücre Süspansiyonu tüpünü su banyosundan alın. Hücre agregalarını parçalamak ve homojen bir süspansiyon üretmek için hücre tüpünü birkaç kez nazikçe ters çevirin. Tüpün yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tahlil kaplaması<ol>
<li>Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 100 μL Reporter Hücre Süspansiyonu dağıtın.</li>
		<li>100 μL numuneleri uygun tahlil kuyularına üç taraflı olarak dağıtın.</li>
		<li>Plakayı22-24 saat boyunca nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatörü olan 37 °C'ye aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2. Güne hazırlanmak için bir gecede koyu renkli bir buzdolabında Çözülme Algılama Substratı ve Algılama Tamponu.</li>
	<li>Plaka inkübasyonunun bitiminden hemen önce, Algılama Substratı ve Algılama Tamponunu buzdolabından çıkarın ve RT'ye dengeleninceye kadar düşük ışık alanına yerleştirin. RT'ye girdikten sonra, çözeltileri iyice karıştırmak için her tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin.<ol>
<li>İnkübasyon tamamlanmadan hemen önce, Luciferaz Algılama Reaktifi oluşturmak için Algılama Arabelleği'nin tüm içeriğini Algılama Substratı tüpüne dökün. Köpük üretmemek için hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Kuluçka tamamlandıktan sonra, içeriği uygun bir atık kabına atmak için plakayı ters çevirin. Kuyulardan son damlacıkları çıkarmak için plakaya temiz emici bir kağıt havluya hafifçe dokunun.</li>
		<li>Her kuyuya 100 μL Lucifease Algılama Reaktifi ekleyin. Test plakasının RT'de 15 dakika dinlenmesine izin verin. Tabağı sallamayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>96 kuyulu plaka okuma luminometresi kullanarak lüminesansı ölçün.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+(Procolobus+rufomitratus)+hormonal+state+and+behavior.">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li><li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution.">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li><li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal.">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li><li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Despr&#233;s-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primate Diet &amp; Nutrition. , (2020).</li><li>Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergroup+variation+in+oestrogenic+plant+consumption+by+black-and-white+colobus+monkeys.">Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys.</a> African Journal of Ecology. , (2019).</li><li>Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+breeding+problem+of+sheep+on+subterranean+clover+pastures+in+Western+Australia.">A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia.</a> Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).</li><li>Tubbs, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+captive+southern+white+rhinoceros+diets+and+their+association+with+fertility.">Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility.</a> General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model.">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).</li><li>Bou&#233;, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens.">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li><li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements.">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li><li>Nishikawa, J. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+screening+methods+for+chemicals+with+hormonal+activities+using+interaction+of+nuclear+hormone+receptor+with+coactivator.">New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).</li><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+foods+of+red+colobus+monkeys+and+mountain+gorillas+in+uganda.">Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda.</a> American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).</li><li>Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+of+estrogen+receptor-&#946;+target+genes+by+3,+3'-diindolylmethane.">Selective activation of estrogen receptor-&#946; target genes by 3, 3'-diindolylmethane.</a> Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).</li><li>Whitten, P. L., Patisaul, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+and+interassay+comparisons+of+phytoestrogen+action.">Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action.</a> Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).</li><li>Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).</li><li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors:+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding.">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li><li>Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquatic+Photochemistry+of+Isoflavone+Phytoestrogens:+Degradation+Kinetics+and+Pathways.">Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).</li><li>Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3/B6/F10+pituitary+tumor+cells.">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li><li>Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoestrogens.">Phytoestrogens.</a> Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).</li><li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+&#946;.">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor &#946;.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li><li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).</li><li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure.">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Farmasötik ajanları tek tek taramak için geliştirilen ERβ muhabir testi, ERβ aracılığıyla biyolojik olarak aktif olan fitoöstrojenler için bitkisel gıdaların taranmasını da uygundur. Protokoldeki önemli hususlar arasında bitki örneklerinin özenle ele alınması yer almaktadır: küflenmeyi veya diğer biyolojik bozulmaları önlemek için taze bitki materyalinin hızlı bir şekilde kurutulması ve bileşiklerin fotolizini önlemek için ışıktan uzak tutulması gerekir18. Üretici tarafından sağlanan tahlil protokolü12 açıktır ve tarama amacıyla çok az değişikliğe ihtiyaç duyar. Üretici tarafından önerilen standart eğri, üst ve alt platoları korurken eğrinin üstel aralığına düşen nokta sayısını artırmak için bu protokolde değiştirilmiştir (Şekil 1). Bu tahlilleri nicel analiz için kullanmak mümkündür, ancak amacımız yüksek aktiviteye sahip bitkileri biyolojik etkilere, yiyecek seçimine ve onları tüketen hayvanlardaki diğer davranışlara ilişkilendirmektir.
Ekstraksiyonun etkinliğini daha fazla göstermek ve test etmek için soya özü ile bir doz yanıt eğrisi dahil ettik (Şekil 2) ve normal ekstraksiyon protokolünün gücü göz önüne alındığında, sinyal maksimum% 50'ye düşmeden önce soyanın kapsamlı bir şekilde seyreltilmesi gerektiğini belirledik. Bu, yüksek fitoöstrojen konsantrasyonlarında sinyal platolarının kararlı bir maksimum sinyalde olduğu gerçeğini vurgular. Çok düşük konsantrasyonlarda sinyal arka plandan ayırt edilecek kadar güçlü olmayabilir. Bir numunede düşük miktarlarda bulunan fitoöstrojenleri tespit etmek ve yanlış negatifleri en aza indirmek için yüksek konsantrasyonlarda ekstraktlarla çalışmak önemlidir. Başlangıçta laboratuvar, metanol ekstraksiyonundan kaynaklanan bitki kalıntısına göre daha fazla miktarda DMSO kullandı (yani, 10 mL'den 0,1 g bitki kalıntısına). Numuneler pozitif örneklerde güçlü bir lüminesansa neden olamayacak kadar seyreltilmişti. Muhabir hücre canlılığı için maksimum DMSO yüzdesi ve plakadaki kuyulardaki hacim kısıtlamaları nedeniyle, bitki kalıntılarına DMSO eklendiğinde numune özü konsantrasyonu optimize edilmelidir. Hücrelerin canlı ve lüminesans yeteneğine sahip olduğunu ve ekstrakt konsantrasyonunun bir yanıt elde etmek için yeterli olduğunu doğrulamak için soya gibi pozitif bir kontrol her plakaya dahil edilmelidir.
Bu tahlil, ERβ'ye bağlanan bileşikleri tespit eder, ancak tüm fitoöstrojenler aynı etki mekanizmasına sahip değildir. Bu tahlil protokolü, bir örnek 9,12'deantiestrojen aktivitesiolupolmadığını tespit etmek için hücreleri estradiol ve bitki bileşiklerinin bir kombinasyonu ile inkübe ederek değiştirilebilir. Estradiol ACIL'ye büyük bir yakınlığa sahiptir, bu nedenle fitoöstrojenlerin varlığı, reseptörleri bloke ederek estradiol varlığında antiestrojenik biyolojik aktiviteye sahip olabilir ve bu da östrojenlere yanıtı azaltır. Antistrojenik aktivite, artan bitki özü konsantrasyonu ile toplam aktivasyonda bir azalma ile tespit edilecektir. Bu tahlil, membran bağlı ERs19'abağlanma gibi diğer eylem yöntemlerini algılamaz. Ayrıca, bazı fitoöstrojenler bağırsak mikropları tarafından metabolize edilene kadar biyolojik olarak aktif değildir20. Unmetabolize durumunda östrojenik aktivitesi olmayan veya düşük olan bazı bitkilerin, bu tahlilde tespit etmeyeceği metabolizasyon sonrası östrojenik aktivitenin daha yüksek olması mümkündür.
ERβ muhabiri tahlili, fitoöstrojenlerin bitkilerdeki aktivite için taranmasını örneklendirmek için seçilmiştir, çünkü fitoöstrojenler ERβ'ye ERα21'dendaha güçlü bir şekilde estradiol ile bağlanmak için rekabet ederler. ERα aktivitesinin taranması, hücrelerin ERβ yerine ERα geni ile trans enfekte olduğu benzer bir test yoluyla mümkündür.
Aktif fitoöstrojenler için pozitif taramadan sonra, aktif bileşikler kromatografi yöntemleri ile tanımlanabilir. Gerçekten de, bu noktada izole bileşikler bu test kullanılarak test edilebilir ve yarım maksimal etkili konsantrasyonlar (EC50),bileşiğin gücünün bir ölçüsü olarak bir seyreltme serisi kullanılarak belirlenebilir.
Bu tahlil, östrojenik aktivite mekanizmalarının genişliğindeki sınırlamalarını göz önünde bulundurarak biyolojik östrojenik aktiviteyi test etmenin güvenilir ve basit bir yoludur. Geçici transfeksiyon tahlilleri üzerinde çeşitli iyileştirmelere sahiptir, özellikle kullanım kolaylığı, hücrelerin stabilitesi ve tahlil hassasiyeti.
İnsanlar veya vahşi hayvanlar tarafından tüketilen yabani bitki gıdalarında fitoöstrojenlerin yaygınlığı hakkında çok az şey bilinmektedir22, ancak çalışmalar diyette östrojenik PSM'lere maruz kalmanın uzun süreli etkileri olabileceğini göstermektedir23. Bu bileşikleri tespit eden basit ve sağlam bir teste sahip olmak, yenilen miktarları ve ne zaman yenildiklerini değerlendiren çalışmalarla birlikte, östrojenik gıdaların diyete dahil etme işlevini ve bu bileşiklerin fizyolojik sistemler üzerindeki etkilerini belirlemede güçlü bir adımdır.

Bitkiler birçok hayvan için gerekli bir besin kaynağıdır, hayatta kalma, üreme, büyüme, gelişme ve davranış için kritik öneme sahip kalori ve besin maddeleri sağlar1. Bitkiler, birçoğu kendi büyümeleri, stomatik bakımları ve üremeleri için adaptasyonlar olarak binlerce kimyasal üretir. Bitki ikincil metabolitleri (PSM' ler) olarak kabul edilen diğer bileşikler, daha az net işlevlere sahiptir, ancak bazıları toksiktir ve muhtemelen otçul ve parazite karşı bir savunma olarak kullanılır (örneğin, alkaloidler, tanenler)2,3. Bu kimyasalların bazıları, hayvanlarda endokrin işleyişi gibi uzun süreli fizyolojik süreçleri etkileme yeteneğine sahiptir, ancak bu endokrin aktif fitokimyasalların omurgalı endokrin sistemle neden etkileşime girdiği hala belirsizdir2,4.
En iyi çalışılan endokrin-aktif fitokimyasallar olan fitoöstrojenler, yapısal ve işlevsel olarak östrojenleri taklit eden, omurgalı endokrin sistemin hipotaomo-hipofiz gonadal ekseni ile doğrudan etkileşime giren polifenolikPSM'lerdir 5. fitoöstrojenlerin insan diyetinde yutulması, bazı kanserlere, kalp hastalıklarına ve menopoz semptomlarına karşı koruma ile ilişkilidir, ancak diğer etkileri doğurganlık problemlerini içerir. Aslında, bu bileşiklerin fizyolojik etkileri 1940'larda koyunlardaki kısırlığın fitoöstrojen bakımından zengin yonca (Trifolium subterrareum)6üzerinde otlatmalarına atfedildiği zaman keşfedilmiştir. Yutildiğinde, fitoöstrojenler hücrelere geçebilir ve östrojenin etkilerini taklit edebilir. Fitoöstrojenlerin koyun doğurganlığı üzerinde olumsuz etkileri olsa da, fitoöstrojenler ve fizyoloji arasındaki ilişki basit değildir. Koyunlar gibi, güney beyaz gergedanları da yüksek miktarlarda soya ve yoncadan elde edilen yemlerdeki östrojenik bileşiklere duyarlılık gösterir. Hamilelik sırasında bu diyeti besleyen kadınların kızlarının üreme olasılığı daha düşüktür7. Bununla birlikte, diğer çalışmalar fitoöstrojenlerin, yaşlı farelerde yumurtalık köklerinin olgunlaşması da dahil olmak üzere olumlu etkileri olabileceğini göstermiştir8, bazı kanserlerin önlenmesi, antioksidan aktivite ve antiproliferatif etkiler9.
Östrojenlerin üreme, gelişme ve üreme ve merkezi sinir sistemlerinin düzenlenmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik işlevleri etkilediği göz önüne alındığında, fitoöstrojenlerin etkilerinin genişliği şaşırtıcı değildir10. Birçok etki mekanizması olmasına rağmen, fitoöstrojenler genellikle intranükleer östrojen reseptörleri alfa ve beta (ERα ve ERβ) için ligand görevi görebilme yetenekleri sayesinde östrojen sinyalini değiştirme, geliştirme veya bozma yeteneğine sahiptir. Birçok fitoöstrojen, östrojen reseptörlerini bağlamalarını sağlayan östrojenlere benzer fenolik bir halka yapısına sahiptir. Östrojen gibi agonistik östrojenik aktivite işlevine sahip olanlar, bir östrojen yanıt elemanına (ERE) küçültebilen ve bağlanabilen ve gen transkripsiyonunu tetikleyebilen aktif bir ER-ligand kompleksi oluşturur11. Böylece östrojenler ve fitoöstrojenler transkripsiyon faktörleri olarak yaptıkları eylemlerle hücre aktivitesini ve sistem fonksiyonlarını düzenlerler.
Burada, östrojenik biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin varlığı için bitki özlerini taramak için hücre tabanlı bir testin yeni kullanımını sunuyoruz. Bu tahlil, ere promotörü12ile bağlantılı ateş böceği (Photinus pyralis) luciferaz geni ile transfekte edilmiş ERβ'yi yüksek oranda ifade etmek için tasarlanmış Çin hamster yumurtalık CHO hücrelerini kullanır. Östrojenik bileşikler mevcut olduğunda, acil servise bağlanırlar, küçülürler ve ERE'ye bağlanırlar, bu da luciferaz geninin transkripsiyonuna yol açtı. Bir substrat çözeltisi eklenmeden sonra, luciferaz foton emisyonuna yol açan bir reaksiyonu katalize eder. Bu nedenle, pozitif numuneler ışık üretir ve negatif numuneler üretmez.
Piyasada bulunan bu tahlil, laboratuvarların memeli hücrelerini muhabir geni ve östrojen reseptörü13,14ile dönüştürme ihtiyacını ortadan kaldırır. Test, bir bitkinin reseptör bağlama yoluyla östrojenik aktiviteye sahip olup olmadığını hızlı ve basit bir şekilde belirlemeye izin veren kararlı bir transfeksiyon platformu sağlar.
Soya fasulyesinin bilinen östrojenik izoflavon15 konsantrasyonları göz önüne alındığında, yerel bakkallardan gelen insan gıdalarını kullanarak diğer tüm gıdalardan daha yüksek östrojenik aktiviteye sahip olduğu hipotezini test ediyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

Bitkiler birçok hayvan için bir besin kaynağıdır ve binlerce kimyasal üretebilirler. Bu bileşiklerden bazıları, endokrin fonksiyon gibi onları tüketen omurgalılardaki fizyolojik süreçleri etkiler. En iyi çalışılan endokrin-aktif fitokimyasallar olan fitoöstrojenler, omurgalı endokrin sistemin hipotalamo-hipofiz gonadal ekseni ile doğrudan etkileşime girer. Burada, östrojenik biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin varlığı için bitki özlerini taramak için hücre tabanlı bir testin yeni kullanımını sunuyoruz. Bu tahlil, östrojen reseptör betasını (ERβ) yüksek oranda ifade etmek için tasarlanmış ve luciferaz geni ile trans enfekte olmuş memeli hücrelerini kullanır. Östrojenik aktiviteye sahip bileşiklere maruz kalmak, hücrelerin ışık üretmesine neden olur. Bu tahlil, biyolojik östrojenik aktiviteyi test etmenin güvenilir ve basit bir yoludur. Geçici transfeksiyon tahlilleri, özellikle kullanım kolaylığı, hücrelerin stabilitesi ve tahlil hassasiyeti üzerinde çeşitli iyileştirmelere sahiptir.

İnsan diyetlerinde yaygın olarak bulunan yirmi iki meyve ve sebze özü östrojenik bileşiklerin varlığı için tarandı. Bezelye ailesi bilinen bir fitoöstrojen kaynağı olduğu için soya fasulyesi, kar bezelyesi ve snap bezelye gibi baklagiller de dahil olmak üzere çeşitli yiyecekler test edildi16, ayrıca incir, hurma, mısır, havuç, elma, muz, çilek, domates, lahana ve lahana. Endokrin bozucu bileşikler ortak maddelerde (örneğin plastikler ve pestisitler) bulunur ve bazıları ERs17aracılığıyla biyolojik olarak aktiftir. Mümkün olduğunda, hem organik hem de nonorganik olarak yetiştirilen ürünler, östrojenik aktiviteye sahip pestisitlerin sonuçları etkilemiş olma olasılığını hesaba katmak için test edildi.
Her bitki gıda maddesi üç taraflı olarak kaplandı ve armatürometre her kuyunun Göreceli Işık Birimlerindeki (IDU' lar) etkinliğini bildirdi. RLU'ların arka plan düzeyleri Standart 8, sıfır konsantrasyonlu standart eğride belirlenir ve referans için kullanılır.  Eğrideki Sıfır noktası için RLU'nun üzerindeki çarpan olan katlama aktivasyon değeri denklem tarafından hesaplanır:
Kat aktivasyonu = Bilinmeyen (RLU) ÷ Standart 8 (RLU)
Yorumlayıcı amaçlar için, östrojenik aktivite yüksek, med, düşük veya etkinlik yok sıralı, nitel bir şekilde sunulur. Standart 4 kat aktivasyon değerinin üzerinde yüksek etkinlik seviyeleri kaydedilir. Orta standart 5 ve standart 4 arasında düşer ve Düşük değerler Standart 6 ve Standart 5 arasındadır. Standart 7'nin altında katlama aktivasyon değerlerine sahip tüm örnekler Etkinlik Yok olarak kabul edilir. Tablo 1'eatıfta bulunarak, hem organik hem de organik olmayan soya fasulyesi, yüksek aktivite seviyelerinde taranırken, diğer tüm meyve ve sebze maddeleri hiçbir aktivite kaydetmedi. Soya fasulyesi sonuçlarını standart eğri ile karşılaştırmak (Şekil 1), organik olarak yetiştirilse de yetiştirilmse de, bu konsantrasyonda estradiol aktivite seviyeleri için eğriden yüksek puan aldıklarını göstermektedir. Isoflavones daidzein ve genistein9'unbilinen güçlü bir kaynağı olan soya özü, maksimuma% 50 sinyal sağlayan seyreltmeyi belirlemek için daha fazla kullanılmıştır (Şekil 2). Bu ekstrakt, standart seyreltme protokolümüzün sinyalinin yarısını üretmek için 422 kat daha fazla seyreltme gerektirir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Madde Üret</td>
			<td>Organik/ Organik olmayan</td>
			<td>Göreli Işık Birimleri (Lum)</td>
			<td>Katlama Aktivasyonu</td>
			<td>Katlama Aktivasyonu (Ortalama)</td>
			<td>Fitoöstrojen Aktivitesi</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Soya fasulyesi</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>1687</td>
			<td>29.016</td>
			<td rowspan="3">31.06</td>
			<td rowspan="3">Yüksek</td>
		</tr><tr><td>2023</td>
			<td>34.796</td>
		</tr><tr><td>1706</td>
			<td>29.353</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Soya fasulyesi</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>2041</td>
			<td>35.106</td>
			<td rowspan="3">32.05</td>
			<td rowspan="3">Yüksek</td>
		</tr><tr><td>1956</td>
			<td>33.647</td>
		</tr><tr><td>1593</td>
			<td>27.399</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kar Bezelye</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>53</td>
			<td>0.919</td>
			<td rowspan="3">0.92</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>49</td>
			<td>0.836</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Snap Bezelye</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>66</td>
			<td>1.142</td>
			<td rowspan="3">1.21</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>60</td>
			<td>1.032</td>
		</tr><tr><td>85</td>
			<td>1.462</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Mısır</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>29</td>
			<td>0.502</td>
			<td rowspan="3">0.53</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.513</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.575</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Çilek</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>35</td>
			<td>0.609</td>
			<td rowspan="3">0.77</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.808</td>
		</tr><tr><td>51</td>
			<td>0.884</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Çilek</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>56</td>
			<td>0.956</td>
			<td rowspan="3">0.88</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.678</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Muz</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>32</td>
			<td>0.544</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.489</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Muz</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>33</td>
			<td>0.564</td>
			<td rowspan="3">0.60</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>41</td>
			<td>0.712</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Muz</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>37</td>
			<td>0.64</td>
			<td rowspan="3">0.70</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.805</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kale</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>26</td>
			<td>0.447</td>
			<td rowspan="3">0.47</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>26</td>
			<td>0.444</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.519</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kale</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>40</td>
			<td>0.685</td>
			<td rowspan="3">0.63</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.485</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.719</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Lahana</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>33</td>
			<td>0.568</td>
			<td rowspan="3">0.54</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>27</td>
			<td>0.468</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.588</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Lahana</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>44</td>
			<td>0.757</td>
			<td rowspan="3">0.66</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.585</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.626</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Apple</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>30</td>
			<td>0.523</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>0.437</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.509</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Apple</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>41</td>
			<td>0.705</td>
			<td rowspan="3">0.62</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>37</td>
			<td>0.63</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Domates</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>51</td>
			<td>0.874</td>
			<td rowspan="3">0.87</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>57</td>
			<td>0.974</td>
		</tr><tr><td>44</td>
			<td>0.76</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Domates</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>61</td>
			<td>1.056</td>
			<td rowspan="3">1.19</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>81</td>
			<td>1.386</td>
		</tr><tr><td>66</td>
			<td>1.128</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Havuç</td>
			<td rowspan="3">Organik</td>
			<td>33</td>
			<td>0.575</td>
			<td rowspan="3">0.51</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.561</td>
		</tr><tr><td>22</td>
			<td>0.382</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Havuç</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>31</td>
			<td>0.53</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>21</td>
			<td>0.365</td>
		</tr><tr><td>38</td>
			<td>0.657</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Res</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>29</td>
			<td>0.506</td>
			<td rowspan="3">0.61</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.716</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.619</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tarih</td>
			<td rowspan="3">Organik olmayan</td>
			<td>29</td>
			<td>0.495</td>
			<td rowspan="3">0.59</td>
			<td rowspan="3">Etkinlik Yok</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>35</td>
			<td>0.602</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1. Fitoöstrojen aktivitesi için meyve ve sebze maddelerinin taranır için ERβ Reporter Tahlil Sisteminin temsili sonuçları. Pozitif aktivite Yüksek, Med, Düşük veya Etkinlik Yok ile gösterilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig1.jpg"> Şekil 1. 17β-Estradiol standardının seri seyreltilmesi (Standart 1 ile 8 konsantrasyon = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ve 0 pM, sırasıyla) ERβ Reporter Tahlil Sistemini kullanarak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig1large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig2.jpg"> Şekil 2. ERβ Reporter, maksimum sinyalin% 50'si olan bir sinyal-arka plan oranı veren seyreltmeyi belirlemek için soya özü seri bir seyreltme kullanarak tahlil eder. Bitki ekstresini dimetil sülfit (DMSO) içinde 0,1 g ekstrakt ile 2 mL DMSO konsantrasyonunda çözen standart ekstraksiyon yönteminden, soya fasulyesinin maksimum yanıtın% 50'si kadar bir sinyal elde etmek için 422 kez seyreltilmesi gerekir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃŽÂ² Reporter Assay at JoVE.com

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Ticari olarak mevcut bir östrojen reseptörü β muhabir testlerini, insan ve insan dışı primat gıdaları östrojenik aktivite için taramak için optimize ettik. Bilinen östrojenik insan gıda soyasının yüksek olduğunu, diğer gıdaların ise hiçbir aktivite göstermediğini göstererek bu tahlilini doğruladık.

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K Görüntüleme.  Indiana University. Ticari olarak mevcut bir östrojen reseptörü β muhabir testlerini, insan ve insan dışı primat gıdaları östrojenik aktivite için taramak için optimize ettik. Bilinen östrojenik insan gıda soyasının yüksek olduğunu, diğer gıdaların ise hiçbir aktivite göstermediğini göstererek bu tahlilini doğruladık.

Video: Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  β Reporter Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Biyokimya

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Menopoz Sonrası Kardiyovasküler Disfonksiyon Exogenous Östrojen Tedaviler Tarama için Bir In Vivo Östrojen Eksikliği Fare Modeli

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis disorder and damage of intestinal mucosa and seems to be associated with an increased risk of colon neoplastic transformation. Accumulating evidence indicates that estrogens and estrogen receptors affect not only hormone-sensitive tissues, but also other tissues not directly related to estrogens, such as the lungs or colon. Here, we describe the protocol for the successful immunofluorescence staining of estrogen receptors in colon obtained from a murine model of TNBS-induced Crohn&#39;s disease. A detailed protocol for the induction of Crohn&#39;s disease in mice and intestine preparation is provided as well as a step-by-step immunohistochemical procedure using formalin-fixed paraffin-embedded intestine sections. The described methods are not only useful for estrogen receptor detection and estrogen signaling investigation in vivo but can also be applied to for other proteins which may be involved in the development of colitis.

The protocol presents a complete validated TNBS-induced murine model of Crohn&#39;s disease and methods for visualization of estrogen receptors by immunohistochemistry using immunofluorescence of formalin-fixed colon sections embedded in paraffin.

İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest advantage of NMR-based fragment screening is its ability not only to detect binders over 7-8 orders of magnitude of affinity but also to monitor purity and chemical quality of the fragments and thus to produce high quality hits and minimal false positives or false negatives. A prerequisite within the FBS is to perform initial and periodic quality control of the fragment library, determining solubility and chemical integrity of the fragments in relevant buffers, and establishing multiple libraries to cover diverse scaffolds to accommodate various macromolecule target classes (proteins/RNA/DNA). Further, an extensive NMR-based screening protocol optimization with respect to sample quantities, speed of acquisition and analysis at the level of biological construct/fragment-space, in condition-space (buffer, additives, ions, pH, and temperature) and in ligand-space (ligand analogues, ligand concentration) is required. At least in academia, these screening efforts have so far been undertaken manually in a very limited fashion, leading to limited availability of screening infrastructure not only in the drug development process but also in the context of chemical probe development. In order to meet the requirements economically, advanced workflows are presented. They take advantage of the latest state-of-the-art advanced hardware, with which the liquid sample collection can be filled in a temperature-controlled fashion into the NMR-tubes in an automated manner. 1H/19F NMR ligand-based spectra are then collected at a given temperature. High-throughput sample changer (HT sample changer) can handle more than 500 samples in temperature-controlled blocks. This together with advanced software tools speeds up data acquisition and analysis. Further, application of screening routines on protein and RNA samples are described to make aware of the established protocols for a broad user base in biomacromolecular research.

Fragment-based screening by NMR is a robust method to rapidly identify small molecule binders to biomacromolecules (DNA, RNA, or proteins). Protocols describing automation-based sample preparation, NMR experiments &#38; acquisition conditions, and analysis workflows are presented. The technique allows for optimal exploitation of both 1H and 19F NMR-active nuclei for detection.

Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...