Die Autoren danken Dale Leitman für die Erstausbildung in der Verwendung von transienten Transfektions-Assays zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von Primatenpflanzen. Vielen Dank an Bradford Westrich und C. Eric Johnson für die Unterstützung bei der Einrichtung von Laborgeräten und der Ausbildung von Studenten in Extraktionsmethoden. Abschließend möchte ich mich bei der Indiana University für die Finanzierung dieser Forschung bedanken.

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien
<ol><li>Einfrieren von trockenen Pflanzenartikeln, die frisch mit einem Lyophilizer gesammelt wurden.<ol>
<li>Um Proben vor Licht zu schützen, decken Sie Kammern mit Aluminiumfolie während des Trocknungsprozesses ab.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass die Proben vollständig trocken sind, lyophilisieren, bis sich die Kammern nicht mehr kalt anfühlen und Pflanzenmaterialien beim Wiegen nicht mehr an Masse verlieren.</li>
		<li>Trockene Pflanzen in sterilen Säcken mit geringem Rückstand lagern, wenn bis zum Mahlen kein Licht entsteht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fein schleifen von Proben mit einer Schleifmühle mit 0,85 mm Maschensieb.<ol>
<li>Bewahren Sie die Bodenproben in den Säcken in Abwesenheit von Licht bis zur Extraktion auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraktion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten
<ol><li>Um die sekundären pflanzlichen Metaboliten zu extrahieren, verwenden Sie ein Verhältnis von 1 g getrockneter Probe zu 10 ml HPLC-Methanol.<ol>
<li>Proben auf einer analytischen Waage wiegen und zu einem entsprechend großen Erlenmeyerkolben (125 – 250 ml) hinzufügen. Fügen Sie dann das entsprechende Volumen Methanol hinzu. Zeichnen Sie die Masse der extrahierten Probe auf.</li>
		<li>Bedecken Sie die Pflanzen-Methanol-Lösung mit Aluminiumfolie und drehen Sie dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbital-Shaker mit 100 Umdrehungen bei 100 Umdrehungen, sodass sich die potenziell östrogene Verbindungen in das Methanol auflösen können.</li>
		<li>Dekantieren Sie den Überstand mit Filterpapier (125 mm) in ein Tropffiltersystem.</li>
		<li>Trocknen Sie den Pflanzenextrakt mit einem Rotationsverdampfer, bis die Probe verdickt, aber gießbar ist, in einem 300 ml Rundbodenkolben. Gießen Sie die Probe in einen 50 ml Rundbodenkolben und spülen Sie den großen Kolben mit einer kleinen Menge Methanol. Trocknen Sie die Probe im kleinen Kolben weiter, bis das Methanol vollständig verdampft ist.</li>
		<li>Wiegen Sie den Probenrückstand mit einem analytischen Gleichgewicht. Rekordrückstandmasse.</li>
		<li>Den Pflanzenextrakt in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,1 g Extrakt auf 2 ml DMSO auflösen. Wirbel bis homogenisiert.</li>
		<li>Bewahren Sie die Pflanzenextrakt-DMSO-Lösung bei 4 °C in Bernsteinglasfläschchen bis zum Test auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>VORSICHT: Pflanzen können unbekannte biologisch aktive Chemikalien herstellen, und DMSO ist ein Fahrzeug, das sie über Zellmembranen transportieren kann. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Pflege bei der Handhabung dieser Proben.
3. Humaner Östrogenrezeptor β Transfektionstest12
HINWEIS: Aseptische Technik und eine laminare Durchflusshaube sind für Tag 1 des Assay-Protokolls erforderlich.
<ol><li>Bereiten Sie Verdünnungen von 17-Estradiol für die Standardkurve vor.<ol>
<li>Das Cell Recovery Medium und Compound Screening Medium (CSM) aus dem Gefrierlager übertragen und in einem 37 °C-Wasserbad auftauen.</li>
		<li>Mikrozentrifugenrohre Zwischen- und 2 (INT1, INT2) und 1-8 beschriften.</li>
		<li>Füllen Sie INT1 mit 995 l CSM, INT2 mit 615 l CSM, Tube 1 mit 900 l CSM und Rohre 2-8 mit 600 l CSM. Rohr 8 beiseite stellen.</li>
		<li>Übertragen Sie 5 l von 100 m 17-Estradiol-Bestand in INT1. Entsorgen Sie die Spitze. Vortex.</li>
		<li>Vor jeder Übertragung pipette 3 mal ausspülen und dann 10 l von INT1 in INT2 übertragen. Entsorgen Sie die Spitze.</li>
		<li>Spülen Sie die Pipette 3 Mal, und übertragen Sie dann 100 l von INT2 in Rohr 1. Entsorgen Sie die Spitze. Übertragen Sie 300 l von Rohr 1 in Rohr 2. Wiederholen Sie dies für Rohre 3 bis 7. Entsorgen Sie 300 l aus Rohr 7 in Abfallbehälter. Tube 8 ist eine Null und erhält kein Estradiol. Die Endkonzentrationen der beschichteten Normen sind: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 und 0 pM Estradiol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Probenverbindungen vor.<ol>
<li>Vortex-Proben.</li>
		<li>Nehmen Sie 4 l jeder Pflanzenprobe in DMSO und fügen Sie 496 L CSM hinzu, um eine 0,8% DMSO-Lösung zu ergeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schnell auftauen Reporterzellen.<ol>
<li>Rufen Sie das Rohr von Cell Recovery Medium aus dem 37 °C-Wasserbad auf. Desinfizieren Sie die Außenfläche mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Holen Sie Reporterzellen aus -80 °C-Speicherung ab und tauen Sie auf, indem Sie 10 ml des vorgewärmten CRM in die Röhre gefrorener Zellen übertragen.</li>
		<li>Schließen Sie die Röhre der Reporterzellen und übertragen Sie sie für 5-10 min in ein 37°C Wasserbad.</li>
		<li>Holen Sie sich die Röhre der Reporter Cell Suspension aus dem Wasserbad. Invertieren Sie das Zellrohr mehrmals vorsichtig, um Aggregate von Zellen aufzubrechen und eine homogene Suspension zu erzeugen. Reinigen Sie die Oberfläche des Rohres mit 70% Ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assay-Beschichtung<ol>
<li>Geben Sie 100 l der Reporter Cell Suspension mit einer Mehrkanalpipette in jeden Brunnen.</li>
		<li>Geben Sie 100 l Proben in Dreifacharbeit in geeignete Assaybrunnen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Platte in einen 37 °C, befeuchtet 5% CO2-Inkubator für 22-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauenerkennungssubstrat und Detektionspuffer in einem dunklen Kühlschrank über Nacht, um sich auf Tag 2 vorzubereiten.</li>
	<li>Kurz vor dem Ende der Platteninkubation, entfernen Sie Detektionssubstrat und Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in einen schwachen Lichtbereich, bis sie mit RT ausgeglichen werden. Einmal bei RT, invertieren Sie jedes Rohr vorsichtig mehrmals, um Lösungen gründlich zu mischen.<ol>
<li>Unmittelbar vor Abschluss der Inkubation den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Rohr des Erkennungssubstrats gießen, um Einfeinerungsreagenz zu erstellen. Mischen Sie sanft, um keinen Schaum zu produzieren.</li>
		<li>Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, invertieren Sie die Platte, um den Inhalt in einen geeigneten Abfallbehälter zu entsorgen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Brunnen zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 100 L des Luciferase Detection Reagenz hinzu. Lassen Sie die Assayplatte bei RT für 15 min ruhen. Schütteln Sie die Platte nicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Lumineszenz mit einem 96-Well-Plattenlese-Luminometer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+(Procolobus+rufomitratus)+hormonal+state+and+behavior.">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li><li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution.">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li><li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal.">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li><li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Despr&#233;s-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primate Diet &amp; Nutrition. , (2020).</li><li>Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergroup+variation+in+oestrogenic+plant+consumption+by+black-and-white+colobus+monkeys.">Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys.</a> African Journal of Ecology. , (2019).</li><li>Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+breeding+problem+of+sheep+on+subterranean+clover+pastures+in+Western+Australia.">A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia.</a> Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).</li><li>Tubbs, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+captive+southern+white+rhinoceros+diets+and+their+association+with+fertility.">Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility.</a> General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model.">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).</li><li>Bou&#233;, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens.">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li><li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements.">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li><li>Nishikawa, J. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+screening+methods+for+chemicals+with+hormonal+activities+using+interaction+of+nuclear+hormone+receptor+with+coactivator.">New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).</li><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+foods+of+red+colobus+monkeys+and+mountain+gorillas+in+uganda.">Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda.</a> American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).</li><li>Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+of+estrogen+receptor-&#946;+target+genes+by+3,+3'-diindolylmethane.">Selective activation of estrogen receptor-&#946; target genes by 3, 3'-diindolylmethane.</a> Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).</li><li>Whitten, P. L., Patisaul, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+and+interassay+comparisons+of+phytoestrogen+action.">Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action.</a> Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).</li><li>Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).</li><li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors:+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding.">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li><li>Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquatic+Photochemistry+of+Isoflavone+Phytoestrogens:+Degradation+Kinetics+and+Pathways.">Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).</li><li>Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3/B6/F10+pituitary+tumor+cells.">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li><li>Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoestrogens.">Phytoestrogens.</a> Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).</li><li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+&#946;.">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor &#946;.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li><li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).</li><li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure.">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der eR-Reporter-Assay, der entwickelt wurde, um pharmazeutische Wirkstoffe einzeln zu überprüfen, eignet sich auch für das Screening von pflanzlichen Lebensmitteln auf Phytoöstrogene, die biologisch durch die ER aktiv sind. Wichtige Überlegungen im Protokoll sind die behandlung der Pflanzenproben mit Sorgfalt: Frisches Pflanzenmaterial muss schnell getrocknet werden, um Schimmelbildung oder anderen biologischen Abbau zu verhindern, und es muss von Licht ferngehalten werden, um eine Photolyse der Verbindungen zu verhindern18. Das vom Hersteller zur Verfügung gestellte Assay-Protokoll12 ist klar und benötigt nur sehr wenige Änderungen zu Screening-Zwecken. Die vom Hersteller vorgeschlagene Standardkurve wurde in diesem Protokoll geändert, um die Anzahl der Punkte zu erhöhen, die in den exponentiellen Bereich der Kurve fallen (Abbildung 1), wobei die oberen und unteren Plateaus erhalten bleiben. Es ist möglich, diesen Test für quantitative Analysen zu verwenden, aber unser Ziel ist es, Pflanzen mit hoher Aktivität mit biologischen Effekten, Nahrungsauswahl und anderen Verhaltensweisen bei den Tieren, die sie konsumieren, zu assoziieren.
Um die Wirksamkeit der Extraktion und des Assays weiter zu veranschaulichen, haben wir eine Dosis-Antwort-Kurve mit Sojabohnenextrakt(Abbildung 2) aufgenommen und festgestellt, dass angesichts der Wirksamkeit des normalen Extraktionsprotokolls Soja ausgiebig verdünnt werden muss, bevor das Signal auf maximal 50 % fällt. Dies unterstreicht die Tatsache, dass bei hohen Konzentrationen von Phytoöstrogenen die Signalplateaus bei einem stabilen Maximalsignal. Bei sehr niedrigen Konzentrationen ist das Signal möglicherweise nicht stark genug, um vom Hintergrund unterschieden zu werden. Es ist wichtig, mit hohen Konzentrationen von Extrakten zu arbeiten, um Phytoöstrogene in geringen Mengen in einer Probe zu erkennen, falsche Negative zu minimieren. Ursprünglich verwendete das Labor ein größeres DmSO-Volumen im Verhältnis zu den Pflanzenrückständen aus der Methanolextraktion (d. h. 10 ml DMSO bis 0,1 g Pflanzenrückstand). Die Proben waren zu verdünnt, um eine starke Lumineszenz in positiven Proben zu induzieren. Aufgrund eines maximalen DMSO-Prozentsatzes für die Lebensfähigkeit der Reporterzellen und Volumeneinschränkungen in den Brunnen auf der Platte sollte die Probenextraktkonzentration bei Zugabe von DMSO zu den Pflanzenrückständen optimiert werden. Eine positive Kontrolle wie Soja sollte auf jeder Platte enthalten sein, um zu bestätigen, dass Zellen lebensfähig und lumineszenzfähig sind und dass die Extraktkonzentration ausreicht, um eine Reaktion auszulösen.
Dieser Test detektiert Verbindungen, die an ER binden, aber nicht alle Phytoöstrogene haben den gleichen Wirkmechanismus. Dieses Assay-Protokoll kann durch Inkubation der Zellen mit einer Kombination von Estradiol und den pflanzlichen Verbindungen modifiziert werden, um zu erkennen, ob es Antiöstrogen-Aktivität in einer Probe9,12. Estradiol hat eine große Affinität zu ER, so dass das Vorhandensein von Phytoöstrogenen antiöstrogene biologische Aktivität in Gegenwart von Estradiol durch Blockierung der Rezeptoren haben kann, die die Reaktion auf Östrogene reduziert. Antiöstrogene Aktivität würde durch eine Verringerung der Gesamtaktivierung mit zunehmender Konzentration von Pflanzenextrakt nachgewiesen werden. Dieser Test erkennt keine anderen Wirkmethoden, wie z. B. die Bindung an membrangebundene ERs19. Darüber hinaus sind einige Phytoöstrogene nicht biologisch aktiv, bis sie von Darmmikroben20metabolisiert wurden. Es ist möglich, dass einige Pflanzen, die keine oder niedrige östrogene Aktivität in ihrem unmetabolisierten Zustand haben höhere östrogene Aktivität nach der Metabolisierung, die dieser Assay nicht erkennen würde.
Der ER-Reporter-Assay wurde ausgewählt, um das Screening von Phytoöstrogenen auf Aktivität in Pflanzen zu veranschaulichen, da Phytoöstrogene um die Bindung mit Estradiol stärker an ER konkurrieren als anER. Das Screening auf die ER-Aktivität ist durch einen ähnlichen Assay möglich, bei dem die Zellen mit dem ER-Gen und nicht mit ER transfiziert werden.
Nach einem positiven Screening auf aktive Phytoöstrogene können die Wirkstoffe mit Chromatographiemethoden identifiziert werden. Tatsächlich können zu diesem Zeitpunkt die isolierten Verbindungen mit diesem Test getestet werden und die halbmaximal wirksamen Konzentrationen (EC50) können anhand einer Verdünnungsreihe als Maß für die Wirksamkeit der Verbindung bestimmt werden.
Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen, unter Berücksichtigung seiner Grenzen in der Breite der Mechanismen der östrogene Aktivität. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.
Wenig ist über die Prävalenz von Phytoöstrogenen in wilden pflanzlichen Lebensmitteln von Menschen oder wilden Tieren konsumiert22bekannt, aber Studien zeigen, dass die Exposition gegenüber östrogene PSMs in der Ernährung langanhaltende Auswirkungen haben kann23. Mit einem einfachen robusten Assay, der diese Verbindungen erkennt, in Verbindung mit Studien zur Bewertung der gegessenen Mengen und wenn sie gegessen werden, ist ein mächtiger Schritt bei der Bestimmung der Funktion der Einbeziehung östrogene Lebensmittel in die Ernährung und die Auswirkungen dieser Verbindungen auf physiologische Systeme.

Pflanzen sind eine notwendige Nahrungsquelle für viele Tiere und liefern Kalorien und Nährstoffe, die für Überleben, Fortpflanzung, Wachstum, Entwicklung und Verhalten entscheidend sind1. Pflanzen produzieren Tausende von Chemikalien, viele als Anpassungen für ihr eigenes Wachstum, stomatische Wartung und Reproduktion. Andere Verbindungen, als pflanzliche Sekundärmetaboliten (PSMs), haben Funktionen, die weniger klar sind, obwohl einige toxisch sind und wahrscheinlich als Schutz gegen Kraut und Parasitismus (z. B. Alkaloide, Tannine)2,3verwendet werden. Einige dieser Chemikalien haben die Fähigkeit, langfristige physiologische Prozesse bei Tieren zu beeinflussen, wie endokrine Funktion, obwohl, warum diese endokrin-aktiven Phytochemikalien mit dem Wirbeltier endokrinsystem interagieren ist noch unklar2,4.
Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, sind polyphenolische PSMs, die Östrogene strukturell und funktionell imitieren und direkt mit der Hypothalomo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Wirbeltiersystems interagieren5. Die Einnahme von Phytoöstrogenen in der menschlichen Ernährung ist mit dem Schutz gegen einige Krebsarten, Herzerkrankungen und Wechseljahrssymptome verbunden, obwohl andere Effekte Fruchtbarkeitsprobleme umfassen. Tatsächlich wurden die physiologischen Wirkungen dieser Verbindungen in den 1940er Jahren entdeckt, als Unfruchtbarkeit bei Schafen auf ihre Beweidung auf phytoöstrogenreichem Klee (Trifolium subterrareum)6zurückgeführt wurde. Bei der Verunstaltung können Phytoöstrogene in Zellen übergehen und die Wirkung von Östrogen imitieren. Während Phytoöstrogene negative Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit von Schafen hatten, ist die Beziehung zwischen Phytoöstrogenen und Physiologie nicht einfach. Wie Schafe zeigen südliche weiße Nashörner empfindlichkeit gegenüber östrogenen Verbindungen in Futtermitteln, die aus hohen Mengen an Soja und Luzerne gewonnen werden. Töchter von Frauen, die diese Diät während der Schwangerschaft gefüttert werden, sind weniger wahrscheinlich,7zu reproduzieren. Jedoch, andere Studien haben gezeigt, dass Phytoöstrogene können auch positive Effekte haben, einschließlich reifung der Eierstockfollikel bei älteren Mäusen8, Prävention bestimmter Krebsarten, antioxidative Aktivität, und antiproliferative Effekte9.
Die Breite der Wirkung von Phytoöstrogenen sind nicht überraschend, da Östrogene eine breite Palette von biologischen Funktionen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Entwicklung, und Regulierung der reproduktiven und zentralen Nervensysteme10. Obwohl es viele Wirkmechanismen gibt, Phytoöstrogene haben oft die Fähigkeit, Östrogen-Signalisierung durch ihre Fähigkeit, als Liganden für die intranuklearen Östrogen-Rezeptoren Alpha und Beta (ER) zu modifizieren, zu verbessern oder zu stören. Viele Phytoöstrogene haben eine phenolische Ringstruktur ähnlich wie Östrogene, die es ihnen ermöglicht, Östrogenrezeptoren zu binden. Diejenigen mit agonistischer östrogener Aktivität funktionieren wie Östrogen und bilden einen aktivierten ER-Ligand-Komplex, der an ein Östrogen-Antwortelement (ERE) dimerieren und binden kann und die Gentranskription11auslösen kann. So, Östrogene und Phytoöstrogene regulieren Zellaktivität und Systemfunktionen durch ihre Aktionen als Transkriptionsfaktoren.
Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Test verwendet chinesische Hamster-Ovarial-CHO-Zellen, die entwickelt wurden, um ER hoch auszudrücken, die mit der Galle (Photinus pyralis) Luziferase-Gen in Verbindung mit einem ERE-Promotor12transfiziert wurden. Wenn östrogene Verbindungen vorhanden sind, binden sie an den ER, dimerisieren und binden an die ERE, was zur Transkription des Luziferase-Gens führt. Nach Zugabe einer Substratlösung katalysiert die Luziferase eine Reaktion, die zur Photonenemission führt. Daher produzieren positive Proben leichte und negative Proben nicht.
Dieser kommerziell erhältliche Assay eliminiert die Notwendigkeit für Laboratorien, die Säugetierzellen mit dem Reportergen und dem Östrogenrezeptor13,14zu transfekieren, was instabil und variabel in der Wirksamkeit war. Der Assay bietet eine stabile Transfektionsplattform, die es ermöglicht, schnell und einfach zu bestimmen, ob eine Pflanze über Rezeptorbindung östrogene Aktivität hat.
Wir testen die Hypothese, dass Sojabohnen eine höhere östrogene Aktivität haben als alle anderen Lebensmittel angesichts ihrer bekannten Konzentrationen von östrogeneisofen15 mit menschlichen Lebensmitteln von lokalen Lebensmittelhändlern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

Pflanzen sind eine Nahrungsquelle für viele Tiere, und sie können Tausende von Chemikalien produzieren. Einige dieser Verbindungen beeinflussen physiologische Prozesse in den Wirbeltieren, die sie verbrauchen, wie endokrine Funktion. Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, interagieren direkt mit der Hypothalamo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Systems der Wirbeltiere. Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Assay verwendet Säugetierzellen, die entwickelt wurden, um Östrogenrezeptor-Beta (ER) hoch auszudrücken und die mit einem Luziferase-Gen transfiziert wurden. Die Exposition gegenüber Verbindungen mit östrogener Aktivität führt dazu, dass die Zellen Licht produzieren. Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem, Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.

22 Extrakte von Obst und Gemüse, die häufig in der menschlichen Ernährung gefunden wurden, wurden auf das Vorhandensein von östrogene Verbindungen untersucht. Eine Vielzahl von Lebensmitteln wurden assayed, einschließlich Hülsenfrüchte, wie Sojabohnen, Schneeerbsen, und Schnapserbsen, wie die Erbsenfamilie ist eine bekannte Quelle von Phytoöstrogenen16, sowie Feigen, Datteln, Mais, Karotten, Äpfel, Bananen, Erdbeeren, Tomaten, Grünkohl und Kohl. Endokrine störende Verbindungen finden sich in gängigen Substanzen (z. B. Kunststoffe und Pestizide) und einige sind biologisch durch ERs17aktiv. Wenn möglich, wurden sowohl organische als auch nicht anorganisch angebaute Produkte als mögliche Mögliche angesehen, dass Pestizide mit östrogeneaktivität die Ergebnisse beeinflusst haben könnten.
Jedes pflanzliche Lebensmittel wurde in Dreifache plattiert und das Luminometer berichtete über die Aktivität jedes Brunnens in Relative Light Units (RLUs). Die Hintergrundebenen von RLUs werden in der Standardkurve mit Standard 8, der Nullkonzentration, bestimmt und als Referenz verwendet.  Der Falzaktivierungswert, der der Multiplikator über der RLU für den Nullpunkt auf der Kurve ist, wird durch die Gleichung berechnet:
Faltenaktivierung = Unbekannt (RLU) ÷ Standard 8 (RLU)
Zu Dolmetschzwecken wird die östrogene Aktivität in einer ordinalen, qualitativen Weise von High, Med, Low oder No Activity dargestellt. Hohes Aktivitätsregister über dem Standard 4-fach-Aktivierungswert. Medium fällt zwischen Standard 5 und Standard 4, und niedrige Werte liegen zwischen Standard 6 und Standard 5. Alle Proben mit Faltenaktivierungswerten unter Standard 7 werden als "Keine Aktivität" betrachtet. Unter Bezugnahme auf Tabelle 1wurden Sojabohnen, sowohl biologische als auch nichtökologische, mit hohem Aktivitätsniveau geprüft, während alle anderen Obst- und Gemüseerzeugnisse keine Tätigkeit verzeichneten. Der Vergleich der Sojabohnenergebnisse mit der Standardkurve (Abbildung 1) zeigt, dass sie bei dieser Konzentration bei Estradiol-Aktivitätsniveaus, unabhängig davon, ob sie organisch angebaut werden oder nicht, bei estradiolen Aktivitätsniveaus hoch punkten. Sojabohnenextrakt, eine bekannte potente Quelle der Isoflavone daidzein und genistein9, wurde weiter verwendet, um die Verdünnung zu bestimmen, die ein 50%-Signal zum Maximum ergibt (Abbildung 2). Dieser Extrakt benötigt 422-mal mehr Verdünnung, um die Hälfte des Signals unseres Standard-Verdünnungsprotokolls zu erzeugen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Artikel produzieren</td>
			<td>Bio/ Nicht-bio</td>
			<td>Relative Lichteinheiten (Lum)</td>
			<td>Faltenaktivierung</td>
			<td>Faltenaktivierung (Mittelwert)</td>
			<td>Phytoöstrogen Aktivität</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Sojabohnen</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>1687</td>
			<td>29.016</td>
			<td rowspan="3">31.06</td>
			<td rowspan="3">Hoch</td>
		</tr><tr><td>2023</td>
			<td>34.796</td>
		</tr><tr><td>1706</td>
			<td>29.353</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Sojabohnen</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>2041</td>
			<td>35.106</td>
			<td rowspan="3">32.05</td>
			<td rowspan="3">Hoch</td>
		</tr><tr><td>1956</td>
			<td>33.647</td>
		</tr><tr><td>1593</td>
			<td>27.399</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Schneeerbsen</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>53</td>
			<td>0.919</td>
			<td rowspan="3">0.92</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>49</td>
			<td>0.836</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Snap Erbsen</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>66</td>
			<td>1.142</td>
			<td rowspan="3">1.21</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>60</td>
			<td>1.032</td>
		</tr><tr><td>85</td>
			<td>1.462</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Mais</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>29</td>
			<td>0.502</td>
			<td rowspan="3">0.53</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.513</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.575</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Erdbeere</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>35</td>
			<td>0.609</td>
			<td rowspan="3">0.77</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.808</td>
		</tr><tr><td>51</td>
			<td>0.884</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Erdbeere</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>56</td>
			<td>0.956</td>
			<td rowspan="3">0.88</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>59</td>
			<td>1.015</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.678</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Banane</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>32</td>
			<td>0.544</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.489</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Banane</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>33</td>
			<td>0.564</td>
			<td rowspan="3">0.60</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>41</td>
			<td>0.712</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.533</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Wegerich</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>37</td>
			<td>0.64</td>
			<td rowspan="3">0.70</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>47</td>
			<td>0.805</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kale</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>26</td>
			<td>0.447</td>
			<td rowspan="3">0.47</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>26</td>
			<td>0.444</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.519</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kale</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>40</td>
			<td>0.685</td>
			<td rowspan="3">0.63</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>28</td>
			<td>0.485</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.719</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kohl</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>33</td>
			<td>0.568</td>
			<td rowspan="3">0.54</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>27</td>
			<td>0.468</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.588</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Kohl</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>44</td>
			<td>0.757</td>
			<td rowspan="3">0.66</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>34</td>
			<td>0.585</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.626</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Apfel</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>30</td>
			<td>0.523</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>0.437</td>
		</tr><tr><td>30</td>
			<td>0.509</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Apfel</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>41</td>
			<td>0.705</td>
			<td rowspan="3">0.62</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>31</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>37</td>
			<td>0.63</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tomaten</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>51</td>
			<td>0.874</td>
			<td rowspan="3">0.87</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>57</td>
			<td>0.974</td>
		</tr><tr><td>44</td>
			<td>0.76</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tomaten</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>61</td>
			<td>1.056</td>
			<td rowspan="3">1.19</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>81</td>
			<td>1.386</td>
		</tr><tr><td>66</td>
			<td>1.128</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Karotte</td>
			<td rowspan="3">Organische</td>
			<td>33</td>
			<td>0.575</td>
			<td rowspan="3">0.51</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>33</td>
			<td>0.561</td>
		</tr><tr><td>22</td>
			<td>0.382</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Karotte</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>31</td>
			<td>0.53</td>
			<td rowspan="3">0.52</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>21</td>
			<td>0.365</td>
		</tr><tr><td>38</td>
			<td>0.657</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Feige</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>29</td>
			<td>0.506</td>
			<td rowspan="3">0.61</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>42</td>
			<td>0.716</td>
		</tr><tr><td>36</td>
			<td>0.619</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Termine</td>
			<td rowspan="3">Nicht-biologisch</td>
			<td>29</td>
			<td>0.495</td>
			<td rowspan="3">0.59</td>
			<td rowspan="3">Keine Aktivität</td>
		</tr><tr><td>39</td>
			<td>0.667</td>
		</tr><tr><td>35</td>
			<td>0.602</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse des ER-Reporter-Assay-Systems zum Screening von Obst- und Gemüseartikeln auf Phytoöstrogen-Aktivität. Positive Aktivität wird durch High, Med, Low oder No Activity angezeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig1.jpg"> Abbildung 1. Serielle Verdünnung des17-Estradiol-Standards(Standard 1 bis 8 Konzentrationen = 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 bzw. 0 pM) mit dem ER-Reporter-Assay-System. Bitte klicken <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig1large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61005/61005fig2.jpg"> Abbildung 2. Der ER-Reporter-Assay mit einer seriellen Verdünnung des Sojabohnenextrakts, um die Verdünnung zu bestimmen, die ein Signal-Hintergrund-Verhältnis ergab, das 50% des maximalen Signals beträgt. Von der Standardextraktionsmethode, die den Pflanzenextrakt in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,1 g Extrakt bis 2 ml DMSO auflöst, muss Sojabohnen 422-mal verdünnt werden, um ein Signal von 50% der maximalen Reaktion zu entlocken. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61005/61005fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃŽÂ² Reporter Assay at JoVE.com

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K Aufrufe.  Indiana University. Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.

Serie: Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  β Reporter Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis disorder and damage of intestinal mucosa and seems to be associated with an increased risk of colon neoplastic transformation. Accumulating evidence indicates that estrogens and estrogen receptors affect not only hormone-sensitive tissues, but also other tissues not directly related to estrogens, such as the lungs or colon. Here, we describe the protocol for the successful immunofluorescence staining of estrogen receptors in colon obtained from a murine model of TNBS-induced Crohn&#39;s disease. A detailed protocol for the induction of Crohn&#39;s disease in mice and intestine preparation is provided as well as a step-by-step immunohistochemical procedure using formalin-fixed paraffin-embedded intestine sections. The described methods are not only useful for estrogen receptor detection and estrogen signaling investigation in vivo but can also be applied to for other proteins which may be involved in the development of colitis.

The protocol presents a complete validated TNBS-induced murine model of Crohn&#39;s disease and methods for visualization of estrogen receptors by immunohistochemistry using immunofluorescence of formalin-fixed colon sections embedded in paraffin.

Visualisierung von Östrogenrezeptoren bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn mit Immunfluoreszenz

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest advantage of NMR-based fragment screening is its ability not only to detect binders over 7-8 orders of magnitude of affinity but also to monitor purity and chemical quality of the fragments and thus to produce high quality hits and minimal false positives or false negatives. A prerequisite within the FBS is to perform initial and periodic quality control of the fragment library, determining solubility and chemical integrity of the fragments in relevant buffers, and establishing multiple libraries to cover diverse scaffolds to accommodate various macromolecule target classes (proteins/RNA/DNA). Further, an extensive NMR-based screening protocol optimization with respect to sample quantities, speed of acquisition and analysis at the level of biological construct/fragment-space, in condition-space (buffer, additives, ions, pH, and temperature) and in ligand-space (ligand analogues, ligand concentration) is required. At least in academia, these screening efforts have so far been undertaken manually in a very limited fashion, leading to limited availability of screening infrastructure not only in the drug development process but also in the context of chemical probe development. In order to meet the requirements economically, advanced workflows are presented. They take advantage of the latest state-of-the-art advanced hardware, with which the liquid sample collection can be filled in a temperature-controlled fashion into the NMR-tubes in an automated manner. 1H/19F NMR ligand-based spectra are then collected at a given temperature. High-throughput sample changer (HT sample changer) can handle more than 500 samples in temperature-controlled blocks. This together with advanced software tools speeds up data acquisition and analysis. Further, application of screening routines on protein and RNA samples are described to make aware of the established protocols for a broad user base in biomacromolecular research.

Fragment-based screening by NMR is a robust method to rapidly identify small molecule binders to biomacromolecules (DNA, RNA, or proteins). Protocols describing automation-based sample preparation, NMR experiments &#38; acquisition conditions, and analysis workflows are presented. The technique allows for optimal exploitation of both 1H and 19F NMR-active nuclei for detection.

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...