이 프로토콜은 산후 소뇌에서 줄기 세포를 정화하는 쉽고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 줄기 세포는 늦게 태어난 분자 왜곡 된 인터뉴런을 차지하지만, 그들은 또한 산후 유래 소뇌 성 상살 세포를 차지합니다. 따라서, 이 세포를 공부하는 것은 소뇌의 발달을 이해하는 것을 명확하게 중요합니다.
이 프로토콜을 사용하여 줄기 세포의 수율은 일반적으로 10 배 더 비싼 FACS 기반 전략의 수율과 유사합니다. 이 프로토콜은 장 및 골수와 같은 다른 조직에서 줄기 세포를 발현하는 프로민-1을 추출하기 위해 일반화될 수 있다. 먼저 해부 현미경 아래에 뇌와 함께 접시를 배치합니다.
미세 한 숫자 다섯 집게를 사용 하 여 소뇌에서 수막과 큰 혈관을 제거 하 고 주걱을 사용 하 여 뇌간에서 소뇌를 분리. 소뇌를 얼음 차가운 HBSS 용액 5밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 헹도 다음 HBSS를 데산합니다.
세탁을 두 번 더 반복합니다. 마지막 헹구기 후에, 섭씨 37도로 미리 온온된 파팡 계 조직 해리 용액의 5밀리리터를 추가하십시오. 37도 수조에서 15분 동안 조직을 배양하고 3분마다 3~5회 반역하여 튜브의 내용물을 천천히 섞어 냅니다.
분젠 버너 위로 불을 닦아 직경이 넓고 좁은 직경의 유리 파스퇴르 파이펫을 준비합니다. 인큐베이션 후, HBSS 용액의 5 밀리리터로 조직을 세 번 세척하여 탈수하면서 조직을 잃지 않도록 하십시오. 마지막 HBSS 세척 후, 조직에 DNAse의 250 마이크로 리터와 DPBS의 5 밀리리터를 추가하고 부드럽게 넓은 직경 파스퇴르 파이펫으로 10 ~ 15 시간을 세화하여 해리.
그런 다음 좁은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직 슬러리를 10번 더 세화시합니다. 조직의 큰 조각이 남아있는 경우, 파이펫 팁튜브의 바닥에 그들을 누르고 미세 현탁액이 달성 될 때까지 파이펫을 계속. 원심분리관을 얼음 위에 놓습니다.
그런 다음 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 해리된 세포를 50 밀리리터 튜브로 변형시합니다. 10 밀리리터의 얼음 차가운 HBSS 용액으로 필터를 위로 하여 세포가 메시를 통과하도록 합니다. 여과 된 세포를 신선한 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10 분 동안 300 배 g에서 서스펜션을 원심분리합니다.
그런 다음 진공 흡인기를 사용하여 상복부을 완전히 제거합니다. 얼음 차가운 자기 컬럼 버퍼의 160 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액에 프로미닌-1 마이크로비드 40마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 항체가 프로민-1 발현 세포에 결합할 수 있도록 15분 동안 냉장고에 튜브를 배양한다. 컬럼 버퍼 X의 1~2밀리리터로 세포를 씻고 원심분리기는 10분 동안 300배 g로 세척합니다. 상류체를 흡인하고 열 버퍼 X.의 1 밀리리터에 펠릿을 재보행하여 마그네틱 컬럼을 자기 스탠드에 놓고 500 마이크로리터의 완충X.기둥에 라벨이 붙은 셀 서스펜션을 적용하고 신선한 15 밀리리터 튜브로 흐름을 수집합니다.
버퍼 X의 500 마이크로 리터로 컬럼을 세 번 씻은 다음 자기장에서 컬럼을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 배양 배지의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 플런저를 컬럼에 밀어 프로미닌-1 구슬로 태그된 세포를 플러시합니다. 신경구를 통과하려면 배양 배지와 함께 멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기십시오.
신경구는 5분 동안 300배 g에서 원심분리로 신경구를 배출하고 상체를 폐기합니다. papain 또는 0.05%의 트립신 용액으로 해리 질의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. 세포 현탁액을 다시 원심 분리합니다.
그런 다음 신경권 배지의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 파스퇴르 파이펫으로 10번 천천히 피펫을 피펫으로 분리합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 신경권 배지에서 세포를 플레이트하고 이전에 설명한 바와 같이 문화에서 7~10일 후에 이차 신경구로 세포를 풍부하게 한다. 혈전계에 세포를 계산하고 향후 실험을 위해 폴리 D-lysine 코팅 플레이트에 최적의 세포 수를 플레이트.
컬럼 정제 프로민-1 양성 산후 소뇌 줄기 세포는 성장 인자가 풍부한 신경권 배지에서 신경구를 형성하였다. 이러한 신경구는 프로민-1에 대 한 긍정적인, 격리에 대 한 사용 하는 그들의 마커 및 nestin와 GFAP 같은 다른 줄기 세포 마커에 대 한. 줄기 세포 마커 프로민-1 및 네신 및 뉴런 마커 베타-III 튜룰린에 대한 양성에 대한 유량에 있는 세포.
성장 인자의 철수시 백혈병 억제 인자 또는 PDGF-AA의 존재, 프로민-1 양성 신경 구신경 뉴런으로 분화, 성상 세포와 oligodendrocytes. 이 기술을 시도할 때, 신경구가 prominin-1 항체를 통해 밀려나고 일반적인 세포가 또한 신경구 같이 보일 지도 모르다 덩어리를 형성하는 경향이 있기 때문에 통과될 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 격리 방법을 사용하여, 하나는 건강과 질병 조건에서 뉴런과 신경교와 같은 유도 혈통을 특성화 할 수 있습니다.
이 방법은 귀중하며 소뇌 발달및 척추 학력 실조 및 암과 같은 질병 조건에서 소뇌 줄기 세포의 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
