Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Reinigung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn. Diese Stammzellen sind für die spätgeborenen molekular verstümmelten Interneuronen verantwortlich, aber sie sind auch für postnatal abgeleitete Kleinhirnastrozyten verantwortlich. Daher ist das Studium dieser Zellen eindeutig wichtig für das Verständnis der Entwicklung des Kleinhirns.
Mit diesem Protokoll ist die Ausbeute der Stammzelle mit der der FACS-basierten Strategie vergleichbar, die in der Regel zehnmal teurer ist. Dieses Protokoll kann verallgemeinert werden, um Prominin-1-exemittierende Stammzellen aus anderen Geweben wie Darm und Knochenmark zu extrahieren. Beginnen Sie, indem Sie die Schale mit dem Gehirn unter einem Seziermikroskop platzieren.
Verwenden Sie feine Zahl fünf Zangen, um die Hirnhirne und große Blutgefäße aus dem Kleinhirn zu entfernen, dann trennen Sie das Kleinhirn vom Hirnstamm mit dem Spachtel. Übertragen Sie das Kleinhirn in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit fünf Millilitere eiskalte HBSS-Lösung. Spülen Sie es dann dekantieren die HBSS.
Wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male. Nach der letzten Spülung, fügen Sie fünf Milliliter Papain-basierte Gewebe dissoziationslösung, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Inkubieren Sie das Gewebe für 15 Minuten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad und mischen Sie langsam den Inhalt des Rohres, indem Sie es drei bis fünf Mal alle drei Minuten umkehren.
Bereiten Sie einen breiten Durchmesser und schmalen Durchmesser Glas Pasteur Pipette durch Feuer polieren über einem Bunsen Brenner. Nach der Inkubation waschen Sie das Gewebe dreimal mit fünf Millilitern HBSS-Lösung, um zu vermeiden, dass Gewebe beim Dekantieren verloren geht. Nach der letzten HBSS-Wäsche fünf Milliliter DPBS mit 250 Mikroliter DNAse in das Gewebe geben und durch sanftetrituierende 10 bis 15-fache Trituierung mit der Pasteur-Pipette mit breitem Durchmesser dissoziieren.
Dann verwenden Sie die schmale Pasteur Pipette, um die Gewebeschlämme 10 Mal weiter zu trituieren. Wenn größere Gewebestücke übrig bleiben, drücken Sie sie mit der Pipettenspitze gegen den Boden des Rohres und führen Sie das Pipettieren fort, bis eine feine Suspension erreicht ist. Die Zentrifugenrohre auf Eis legen.
Dann die dissoziierten Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr abseihen. Den Filter mit 10 Millilitere eiskalte HBSS-Lösung bedecken, um sicherzustellen, dass die Zellen durch das Netz gelangen. Übertragen Sie die gefilterten Zellen in ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und zentrieren Sie die Suspension bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie dann einen Vakuum-Aspirator, um den Überstand vollständig zu entfernen. Setzen Sie das Zellpellet in 160 Mikrolitere eiskalte magnetische Säulenpuffer aus. Fügen Sie 40 Mikroliter Anti-Prominin-1-Mikroperlen in die Zellsuspension.
Dann die Schläuche für 15 Minuten in einen Kühlschrank brüten, damit sich der Antikörper an die Prominin-1-exemitten Zellen bindet. Waschen Sie die Zellen mit einem bis zwei Milliliter Säulenpuffer X und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 mal g. Den Überstand ansaugen und das Pellet in einem Milliliter Säulenpuffer X wieder aufhängen. Die Magnetsäulen auf den Magnetischen Ständer legen und einmal mit 500 Mikroliter Puffer X abspülen. Tragen Sie die beschriftete Zellsuspension auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss in frischen 15-Milliliter-Röhren.
Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikroliter Puffer X.Dann entfernen Sie die Säulen aus dem Magnetfeld und legen Sie sie in 1,5 Milliliter Rohre. Fügen Sie einen Milliliter Kulturmedium hinzu und schieben Sie den Kolben in die Säule, um die zellenmarkierten Mitprominin-1-Perlen auszuspülen. Um die Neurosphären zu durchziehen, übertragen Sie sie zusammen mit dem Kulturmedium in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenrohr.
Pellet die Neurosphären durch Zentrifugation bei 300 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter dissoziationsmedien mit Papain oder 0,05%Trypsin-Lösung aus und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wieder.
Dann setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter neurosphären Medium s aus und dissoziieren Sie sie, indem Sie sie langsam 10 Mal mit einer Pasteurpipette auf und ab pfeifen. Die Zellen in Neurosphärenmedien, wie im Textprotokoll beschrieben, plattieren und nach sieben bis zehn Tagen in der Kultur wie zuvor beschrieben mit sekundären Neurosphären anreichern. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer und verschichten Sie die optimale Anzahl von Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten Platten für zukünftige Experimente.
Spalte gereinigt Prominin-1 positive postnatale Kleinhirnstammzellen bildeten Neurosphären in Wachstumsfaktor reichen Neurosphären Medium. Diese Neurosphären waren positiv für Prominin-1, ihren Marker für die Isolierung und für andere Stammzellmarker wie Nestin und GFAP. Zellen im Durchfluss gefärbt negativ für Stammzellmarker Prominin-1 und Nestin und positiv für neuronalen Marker beta-III Tubulin.
Bei Entzug von Wachstumsfaktoren und in Gegenwart von Leukämie-Hemmfaktor oder PDGF-AA, die Prominin-1 positive Neurosphären differenziert in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Neurosphären für Prominin-1-Antikörper durchgedrückt werden und sie können durchdrungen werden, weil normale Zellen auch dazu neigen, Klumpen zu bilden, die wie Neurosphären aussehen können. Mit dieser Isolationsmethode kann man seine abgeleiteten Linien wie Neuronen und Glia in Gesundheit und Krankheit Charakterisieren.
Diese Methode ist wertvoll und bietet neue Einblicke in die Rolle von Kleinhirnstammzellen bei der Entwicklung von Kleinhirn und Erkrankungen wie spinozerebellara Ataxie und Krebs.
