NS088206 및 ES026892 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 보조금에 의해 지원되었다. 더블유 유진과 린다 로이드 기증 의자 AGK하고 AK에 학장 교수도 인정된다.

동물 및 프로토콜 절차의 사용 승인과 기관 동물 케어 및 사용 아이오와 주립 대학위원회 (IACUC) (에임스, IA, USA)에 의해 감독되었다 1. 혼합 배양 성장 폐해 <ol><li> 5.5 인치 운영 가위 1 이일 된 새끼 빨리 목을 베다, 얼음에 50 ML의 튜브에 즉시 머리를 놓습니다. 이 잘린 안락사의 모드입니다 있습니다. </li><li> 층류 기류 후드, 두개골 및 4.5 인치의 직선 해부 마이크로 가위를 사용하여 수막에 작은 절개 부위를 만든다. 입쪽 끝 (코)로 꼬리 단부에서 절단 시작한다. 잘린 형성된 개구부를 사용하여 피부 아래에 가져옵니다. <ol><li> 절개 한 후 옆으로 반구 중 하나를 껍질. 그리고 뇌 전체를 제거하는 곡선 또는 후크 핀셋을 사용합니다. </li></ol></li><li> 0.25 % 트립신 - ethylenediaminetetraacet를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에서 뇌 (들)을 담가37 ° C의 물 중탕에서 15 분 동안 아세트산 (EDTA)를 먹었다. 뇌 당 트립신 EDTA의 2 용액을 사용합니다. </li><li> 추가하고 제거하여 신선한 성장 배지 (10 % FBS, DMEM / F12, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L- 글루타민, 1 % 소듐 피루 베이트 및 1 % 비 필수 아미노산)가 뇌 (들)을 씻어 미디어. 이 배를 반복합니다. </li><li> 각 뇌의 경우, 성장 배지를 함유하는 개의 T-75 플라스크 접시. 따라서, 튜브에 뇌 당 성장 미디어의 2 mL를 넣어. 따라서, T-75 플라스크의 성장 배지 당 8-9 ㎖의 균질화 뇌 1 ㎖의 등가 일 것이다. </li><li> 가장 작은 행하기 위해, 개구 크기가 상이한 피펫으로 뇌 (들)에 의해 분쇄하여 균질. 뇌 조직은 다음 피펫 전환을 작아지고 있지 않은지를 볼 수있는 경우. 분쇄의 끝에서, 서스펜션은 눈에 보이는 덩어리, 명확해야한다. <ol><li> 25 mL의 피펫, 5 ㎖ 피펫 한 다음 10 ㎖ 피펫을 순차적으로 사용한다. </li></ol></li><li> 각 homog 전달70 μm의 세포 여과기를 통해 enous 뇌 현탁액을 단일 세포 배양 물로 만들려면. </li><li> (T-75 플라스크의 성장 배지 당 8-9 mL로 균질화 뇌 1 ㎖) 단계 1.5에 기재된 바와 같이 각각의 뇌 균질 플레이트 개의 T-75 플라스크의 성장 배지를 함유. </li><li> 6 D 후 성장 미디어를 변경하고 16 일 날에 분리 될 때까지 성장한다. </li></ol> 미세 아교 세포의 2. 분리 <ol><li> 십육일 후, 플라스크에서 성장 미디어를 제거하고 신선한 50ml의 튜브에 넣습니다. 각각의 T-75 플라스크에 3 ㎖의 0.25 % 트립신 EDTA를 추가한다. 오비탈 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 진탕 플라스크. <ol><li> 원심 분리 한 성장을 5 분 동안 0.4 XG에 용지 및 후속 단계에서 트립신 EDTA 반응을 정지 사용. </li></ol></li><li> 5 분 동안 진탕 한 후, 트립신 EDTA 반응을 정지 성장 (신선 또는 2.1.1에서 사용되는 매체) 미디어 4mL의 최소 추가. </li><li> 보장하기 위해 씹다 그 모든 CELL 학생이 분리되어있다. </li><li> 분쇄 후, 단일 세포로 배양을 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달 셀 카운트를 수행 한 다음 5 분 동안 0.4 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 각 100 × 106 세포 (약 15 X T-75 플라스크)를 위해, 세포 펠렛을 재현 탁하는 추천 미디어 (2 % FBS, DPBS (칼슘 및 마그네슘 클로라이드 무), 1 mM의 EDTA) 1 ㎖를 사용한다. 참고 : 모든 다음 단계는 1 ML의 분리에 맞게 조정됩니다. </li><li> , 5 ML의 폴리스티렌 튜브를 타고 권장 미디어의 1 mL를 넣어 반월 상 연골을 표시합니다. 2.5 mL의 최대 권장 미디어를 추가하고도이를 표시합니다. 권장 미디어를 폐기하고 5 ㎖ 폴리스틸렌 튜브에 재 현탁 세포를 옮긴다. </li><li> 부유 세포의 매 1 mL를 위해 쥐의 혈청 50 μL를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 성분 (A)의 25 μL와 성분 (B)의 25 μL 이들 컴포넌트 독점을 혼합하여 선택 칵테일을 준비한다. </li><li> 50 추가(1) 상기 셀 선택 칵테일 L. RT에서 5 분 동안 인큐베이션. 참고 : 순수한 문화를 들어, 단계를 반복 2.9 (권장하지만 필수는 아닙니다). </li><li> 45 초 동안 소용돌이 미소. 시료 1 ㎖ 당 미립자의 80 μL를 추가한다. RT에서 3 분 동안 인큐베이션. </li><li> 권장 미디어를 추가하여 폴리스티렌 튜브에 2.5 ㎖의 부피를 준비한다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 자석에 튜브를 넣고. 순도를 높이기 위해 배양을 조정합니다. 천천히 폴리스티렌 튜브에 여전히 자석을 15 mL의 튜브에 권장 미디어를 붓는다. </li><li> 단계를 반복 2.12 세 번 이상. 추가 인큐베이션은 자기 순도를 증가시키기 위해 수행 될 수있다. </li><li> 성장 배지 3 mL를 첨가하고, 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 계산. </li><li> 따라서, 폴리 D 라이신 (PDL) 치료를위한 코팅 된 플레이트에서 세포를 플레이트. inPDL - 코팅 된 플레이트를 세포 파종 후 48 시간 동안 처리한다. 이것은 세포 분리의 스트레스로부터 복구 할 수 있습니다. 참고 : 체앞서 설명한 바와 같이 면역 세포 (15)를 사용하여 배양 물의 순도 CK. </li><li> 대부분 성장 배지의 T-75 플라스크에서 아스트로 사이트를 포함 (15 ㎖의 튜브에 수집 된) 부의 일부를 접시. </li><li> 37 ° C의 배양기에서 배양 중 적어도 6 시간 후, 배지를 변경하고 / N을 O 성장하자. 치료를 위해 다음날 성상 세포를 분할합니다. </li></ol>

<ol>
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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

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미세 아교 세포는 C-KIT + / CD45- 차별화 중배엽 기원 MYB 독립적 상주 식세포, 난황 1, 2의 혈액 섬 전구 세포를 erythromyeloid이다. 배아 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)을 식민되면, 그들은 분지 형태 3에 아메바에서 전환. 그들의 역동적 인 파급 효과가 잠재적 인 모욕 4 건강한 뇌 실질을 조사하고 있기 때문 성인 미세 아교 세포는 감시자로 분류됩니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계의 세포 인구의 약 10 %에 기여하지만, 서로의 사이에 타일에 대한 그들의 능력은 실질 4, 5의 최대 스캐닝을 보장합니다. 이러한 α-synuclein의 6, 7, 아밀로이드 β-8, P 등의 위험 - 관련 분자 패턴 (DAMPS)예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (9)와 같은 athogen - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)는 고전 아메바 액티브 상태로 복귀하고 산화 질소의 생산, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터루킨 1β 특징으로하는 염증 반응을 촉진하는 미세 아교 세포를 활성화 (IL-1β), IL-6, IL-12, 및 CC 케모카인 리간드 모티프 2 내지 9, 10, 11. 병원성 α-synuclein의 축적 가지고있는 파킨슨 병과 같은 신경 염증성 조건에서, 신경 퇴행성주기는 더 미세 아교 세포 (7)의 고전적인 활성화를 추진,보다 통합 된 α-synuclein의 출시 도파민 신경 세포의 죽음에서 생성됩니다. 주변 대 식세포와 마찬가지로, 미세 아교 세포는 대안 항 염증성 사이토 카인 IL-4 및 IL-10의 존재 하에서 활성화하는 능력을 갖고 그들에게 효능을 제공 할 수있다염증이 11 신경 수리를 장려하고 감쇠 IAL. 이외에도 CNS에서의 면역 학적 역할에서, 미세 아교 세포는 개발 과정에서 시냅스 가지 치기를하여 신경 회로의 중요 규제로 기술되었다. 예를 들어, Cx3cr1- KO 마우스는 저밀도 및 미세 아교 세포 돌기 쪽 미성숙 시냅스 및 미개발 CNS (12)의 전기 생리 패턴 넘쳐나 리드 감소 시냅스 치기를 갖는다. 중추 신경계의 항상성에 이러한 생리 학적 복잡성과 미세 아교 세포의 다양한 기능적 역할을 이해하는 것은 신경 퇴행성 질환을 대상으로 치료제에 대한 검색에 매우 중요합니다. neuroimmunology의 영역에서 생체 외 실험 때문에 역학적 연구에 대한 더 큰 가능성의 매우 바람직하며, 낮은 유지 보수 비용과 시간이 적게 걸리고 힘이 덜 드는 것에 대해. Furthermo다시, 세포 집단을 분리하는 능력은 소정의 조건에 따라 그 표적 세포의 기능을 묘사하는 것이 중요하다. 수많은 소교 분리 방법이 존재하지만, 그들은 광범위한 실험 13, 14, 15에 대해 상대적으로 높은 번호 및 순도를 얻을 수있는 능력에 의해 제한된다. 예를 들어, 분화 (11b)의 클러스터 (는 CD11b)는 단핵구, 대 식세포와 미세 아교 세포 (16)의 공통 표면 마커이다. CD11b를 악용하여 자기 분리하는 방법은 제 17 뇌 신생아 당 열 기반 접근법 수득 ~ 99.5 % 순도 및 ~ 1.6 × 106 미세 아교 세포로서 설명 하였다. 본 연구실은 최근 우리가 피코 에리 트린 접합하는 모노클로 날 항체 (PE)와 CD11b를 태깅하여 폴리스티렌 튜브에서 수행되는 열없는 CD11b를 자성 분리 방법 (15)을 개발 하였다. 특이 적 secondaRY 항체 PE 및 PE와 덱스 트란 착물한다. 일단 결합 된 덱스 트란 - 코팅 된 자성 입자는 항체 복합체의 덱스 트란 단부에 결합되는 도입된다. 마지막으로, 폴리스티렌 튜브는 미세 아교 분리를위한 자석에 배치됩니다. 이 방법은에 수율을 두 배로 ~ 신생아 뇌 당 만 ~ 97 %로 순도 감소의 비용으로 3.2 × 10 (6) 미세 아교 세포. 여기서, 우리는 신속하고 세련된 열이없는 CD11b를 자기 분리 프로토콜 (그림 1)를 보여줍니다. CD11b를 자기 분리 키트의 가격이 동일하기 때문에 이러한 개선 된 방법은 오리지널 열없는 방법처럼 가능한 남아있다. 완료 시간은 세포 생존 및 수율을 최대화 결정적 일 수 절반으로 감소된다. 특히,이 최적화 된 방법에서 얻어지는 ~ 순도&gt; 99 %, 15 실험실에서 개발 원래 열없는 방법에서 얻어지는 순도 이상 현저한 개선이다. 가장 중요한 것은, CD11b를-PE빛으로부터 배양의 필요성을 제거하고 형광 현미경에 대한 빨강 채널의 사용을 허용, 사용되지 않습니다. 마지막으로, 원래는 CD11b 방법에서와 같이, 높은 수율 및 순도의 성상 세포 분획이 개선 된 방법으로 얻어진다. 성상은 항상성 기능 병태 생리 (18)과 관련하여 필수 불가결하다는 생각을지도하는 CNS에서 가장 많은 신경 교세포이다. 이 아교 세포는 아교 자신의 조사의 가능성을 예시, 영양 지원을 제공, 혈액 - 뇌 장벽을 형성하는 신경 전달 물질의 항상성을 유지, 손상, 신경에 대한 응답으로 아교 흉터를 형성, 학습 및 메모리 및 신경 염증 등 다양한 생리 기능에 중요한 역할을 생물학 (19). 형태와 미세 아교 세포와 성상 세포의 기능은 공 초점 현미경, 웨스턴 블롯, 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR), G를 통해 확인되었다RIESS 아질산 분석하고, 루미 넥스 다중 사이토 카인 분석. 이 프로토콜에 의해 제공되는 정제는 시험관 실험에 중요한 모두, 미세 아교 또는 성상 세포의 순도, 빨강 채널의 가용성과 형광 현미경의 폭 넓은 응용에 관한 신뢰를 증가하고, 시간을 절약 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

미세 아교 세포는 중추 신경계에 욕설 차 응답자이다; 그러나, 많은 신경 염증을 조절하는 역할에 대한 알 수없는 남아있다. 미세 아교 세포는 염증 스트레스를 측량에서 대 식세포 유사한 기능을 중배엽 세포이다. 고전 (M1 형) 및 대체 (M2 형) 대 식세포의 활성화는 더 나은 이러한 표현형은 파킨슨 병, 알츠하이머, 헌팅턴의 질병과 같은 신경 염증성 조건이 기본 상호 작용을 이해하기위한 노력의 일환으로 미세 아교 세포로 확장되었습니다. 시험관 실험에서 생체 환경에 확장 될 수있다 신속하고 신뢰할 수있는 결과는 차 미세 아교 세포를 제공 활용. 이것은 도전했다 최적 순도 적당한 수율을 달성하면서 미세 아교 세포를 단리 생체 실험을 통해 명백한 장점 않는다. 현재 사용중인 일반적인 방법 중 하나는 낮은 복구, 낮은 순도, 또는 두 가지 모두에서 고통 받고 있습니다. 여기서, 우리는 민주시간의 절반의 양으로 높은 세포 복구 및 순도 향상을 달성 열없는 CD11b를 자기 분리 방법의 구체화를 onstrate. 우리는 신경 염증과 신경 퇴행을 연구의 목적으로 차 미세 아교 분리의 매우 유용한 모델로이 최적화 방법을 제안한다.

미세 아교 II는 높은 순도는 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 격리 기본 마우스 미세 아교 세포는 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여 절연 및 절연의 순도를 확인하는 폴리 D 라이신 코팅 커버 슬립에 도금했다. 만 개 세포를 단리 미세 아교 세포의 순도를 확인하기 위해 미세 아교 세포 및 성상 세포의 마커로서 글 리아 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)의 마커로서 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1)를 사용하여 수행 하였다 웰 면역 분석 당 도말 . 단리 배양은 배양 된 미세 아교 세포는 순수했다 절연 것을 시사 GFAP 발현 (도 2A)없는 표현 Iba1. 이 방법을 이용하여 ~ 97 %의 순도를 달성 차 소교 분리 이전에 발행 된 다른 방법과 달리 우리는 시간을 반 ~&gt; 99 % 순도를 획득. 더 일의 순도를 확인하려면<html> 문화, 우리는 Iba1 및 GFAP에 대한 웨스턴 블롯 (20)를 달렸다. 면역 블롯 분석을 상기 혼합 신경교 배양 물에서이 분리가 거의 순수한 소교 배양 (도 2b)를 것을 알았다. 수정 된 격리 절차는 자기 구슬에서 어떤 자동 형광이없는 고든 등의 등에 의해 언급 된 바와 같이 소교 분리 이전 CD11b를 분리 키트를 이용하면 적색 채널은 면역 세포 화학 (ICC)를 사용할 수 없습니다. 때문에 분리시 PE 라벨의 사용 (15). 이 새로운 PE-무료로 분리 키트를 사용하여, 우리는 면역 분석 (그림 3)에 대한 빨강 채널을 사용할 수 있습니다. 이 ICC에서,이 새로운 방법은 우리가 흐름 세포 계측법 또는 다른 형광 이미징 연구를위한 모든 채널을 사용할 수 있음을 알 수있다. ve_step &quot;FO : 유지 - together.within 페이지는 =&quot;1 &quot;&gt; 고립 된 미세 아교 문화는 기능적으로 LPS 자극에 반응 분리 된 미세 아교 세포가 기능적으로 활성화되어 있는지 확인하려면, 우리는 다양한 염증성 요인 프로빙 전에 24 시간 동안, 미세 아교 세포를 활성화, LPS와 함께 널리 사용되는 자극제 9 세포를 처리 하였다. 클래식 미세 아교 활성화는 미디어에 아질산염 및 다양한 염증성 사이토 카인의 방출을 동반한다. 따라서, 우리는 우리의 고립 된 미세 아교 세포의 기능 활동을 확인하기 위해 여러 보완적인 분석을 사용했다. 먼저, LPS 극적 절연 미세 아교 세포 (도 4a)에서 아질산 분비를 유도하는 것을 보여주기 위해 Griess의 분석을 사용 하였다. 더 고립 된 미세 아교 세포의 활동을 확인하려면, 우리는 QRT-PCR은 NOS2, 미세 아교 염증의 또 다른 특징의 mRNA 수준을 (메신저 리보 핵산)를 표시하는 데 사용, 크게 향상된 WI제 LPS 처리 (도 4b). 다음에는 LPS 크게 소교 배양 (도 5a)에서 염증성 사이토 카인의 분비를 촉진하는 것이 확인 비드 기반 다중 분석, 루미 넥스 (21)를 사용했다. 더욱이, 우리는 LPS 처리는 IL-1β 및 TNFα (도 5b) 등 여러 가지 전 염증성 사이토 카인 유전자 발현 수준을 강화하는 것이 QRT-PCR 분석을 통해 확인 하였다. 이러한 모든 데이터는 함께 차 미세 아교 세포가 새로 정제 방법을 이용하여 분리하는 것이 좋습니다 기능적으로 활성 및 기본 미세 아교 세포가 이전에 출판 된 방법을 사용하여 격리와 유사한 활성화 프로필을 보여줍니다. 고립 된 미세 아교 세포 연구를 신호에 사용할 수 있습니다 서양 BLO을, 미세 아교 분리의 이전 방법을 사용하여 실행신호 연구를위한 t으로 인해 낮은 수율과 순도 어렵고 불가능했다. 이전에, 우리는 퓐하는의 Src 가족 키나제는, 미세 아교 세포 (9)의 염증성 신호 캐스케이드에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 12 웰 플레이트에 백만 미세 아교 세포를 도금 및 48 시간 후, 우리는 기본 퓐 서구 말을 실행하기 위해 세포를 수집의 Src는 티로신 잔류 물 416 (P-의 Src-Y416)의 인산화 키나제. 우리는이 방법이 연구 신호 웨스턴 블로 팅 기술에 적용 할 수 있음을 보여주는, 우리의 고립 된 미세 아교 세포 (그림 6)에 퓐 및 P-의 Src-Y416 모두 레벨을 감지 할 수 있었다. 소교 분리의 부정적 분획 시그널링 연구에 사용될 수 성상을 포함 성상 세포는 신경 염증에 중요한 선수이며, ASTR 뒤에 신호 메커니즘을 이해ocytic 염증과 신경 세포 성상 세포 크로스 토크가 중요 (19)이다. 여기에서는 소교 분리에서 제외 분획 GFAP 양성 성상 세포 (도 7A)에 포함되어 있음을 보여준다. 또한, Fyn에 그리고 P-Src에-Y416 (도 7b)에 대한 우리의 웨스턴 블롯 분석은이 단백질의 양뿐만 아니라 음의 부분에서 검출 할 수 있었다. 이들 결과는 함께 음의 분획 염증성 신호 전달 캐스케이드 중요한 단백질을 확인하는 목적으로 연구 성상 이상적인 제제임을 나타낸다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig1.jpg" /> 도 1 : 1-2 일 - 산후 새끼들까지 잔치에서 소교 세포의 분리의 개략도. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55364/55364fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig2.jpg" /> 그림 2 : 미세 아교 세포 II는 높은 순도는 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여입니다. 녹색 채널에 빨강 채널과 IBA1에서 GFAP에 대한 프로빙 고립 된 미세 아교 문화의 (A) 면역 세포 화학. GFAP (~ 51 kDa의) IBA1 (~ 15 kDa의) 및 β 액틴 (~ 42 kDa의) 프로빙 절연 소교 배양 (B) 면역 블롯. 스케일 바는 20 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55364/55364fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig3.jpg" /> 그림 3 : 수정 된 분리 절차 자석 구슬에서 어떤 자동 형광이 없습니다. </strong&gt; 면역 세포 화학 적색 채널 녹색 채널 및 PE 형광에 IBA1 프로빙 새로운 분리 방법 및 이전 (일본어) 방법을 이용하여 분리 소교 배양. 스케일 바는 30 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55364/55364fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig4.jpg" /> 그림 4 : 미세 아교 문화 LPS 자극 증가 아질산염 생산. (A) 절연 된 소교 세포는 24 시간 동안 1 ㎍ / ㎖의 LPS로 처리하고, 처리 매체은 Griess 분석으로 아질산염 방출을 결정하기 위해 수집 하였다. 24 시간 동안 LPS로 처리 된 미세 아교로부터 격리 Nos2 대 (B) Q-RT-PCR. 수치는 2 개 이상의 독립적 인 실험에서 SE ± 평균을 나타냅니다. 데이터 학생의 t 테스트를 (사용하여 분석 하였다 * P0, 0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55364/55364fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig5.jpg" /> 그림 5 : 미세 아교 세포에서 염증성 사이토 카인 출시 LPS 유발. (A) 루미 다중 분석법을 24 시간 동안 1 ㎍ / ㎖의 LPS로 처리 격리 된 소교 세포에서 수집 처리 매체상에서 수행 하였다. 24 시간 동안 LPS로 처리 된 미세 아교 세포에서 IL 절연-1βand TNFα에 대한 (B) Q-RT-PCR. 수치는 2 개 이상의 독립적 인 실험에서 SE ± 평균을 나타냅니다. 데이터는 학생의 t-test를 이용하여 분석 하였다 (* p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55364/55364fig5large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a><html> 이 도면의 확대보기. <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig6.jpg" /> 그림 6 : 분리 된 미세 아교 세포는 신호 연구에 사용할 수 있습니다. 웨스턴 블롯 분석 퓐 및 P-의 Src-Y416가 새로 세련된 방법으로 분리 된 미세 아교 세포에서 감지 할 수 있음을 보여줍니다. <img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55364/55364fig7.jpg" /> 그림 7 : 미세 아교 분리의 부정적 분수는 신호 연구에 사용할 수 성상을 포함합니다. (A)는 웨스턴 블롯 네거티브 분획 GFAP 양성 세포가 포함되어 있음을 보여준다. (B) 웨스턴 블롯 분석 및 Fyn이 P-Src에-Y416는 GFAP 양성 세포에서 검출 될 수 있다는 것을 보여준다.target = &quot;_ blank&quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 매개 변수 </td><td> 현재 방법 </td><td colspan="2"> 수정 방법 </td></tr><tr><td> 비용 </td><td> $ (620) </td><td colspan="2"> $ (620) </td></tr><tr><td> 시각 </td><td> 55 분 </td><td colspan="2"> 25 분 </td></tr><tr><td> 형광 </td><td> 예 (빨강 채널) </td><td colspan="2"> 아니 </td></tr><tr><td> 청정 </td><td> ~ 97 % </td><td colspan="2"> ~ 99 % </td></tr></tbody></table> 표 1 : 정제 된 소교 분리 방법 및 격리 원래 방법 간의 비교 분석.

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Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

rapid-refined-cd11b-magnetic-isolation-primary-microglia-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K 조회수.  Iowa State University.  여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다. 

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The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of neurological and psychiatric disorders such as stroke and depression. Yet, the mechanisms underlying its ability to modulate brain excitability to improve clinical symptoms remains poorly understood 33. To help improve this understanding, proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) can be used as it allows the in vivo quantification of brain metabolites such as &#947;-aminobutyric acid (GABA) and glutamate in a region-specific manner 41. In fact, a recent study demonstrated that 1H-MRS is indeed a powerful means to better understand the effects of tDCS on neurotransmitter concentration 34. This article aims to describe the complete protocol for combining tDCS (NeuroConn MR compatible stimulator) with 1H-MRS at 3 T using a MEGA-PRESS sequence. We will describe the impact of a protocol that has shown great promise for the treatment of motor dysfunctions after stroke, which consists of bilateral stimulation of primary motor cortices 27,30,31. Methodological factors to consider and possible modifications to the protocol are also discussed.

This article aims to describe a basic protocol for combining transcranial direct current stimulation (tDCS) with proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) measurements to investigate the effects of bilateral stimulation on primary motor cortex metabolism.

일차 운동 피질 대사에 양성 반구 경 두개 전기 자극 효과의 측정을위한 도구로 자기 공명 분광학의 사용

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

연구

신경과학

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

등갈 뿌리 신경절 대식세포의 신속한 절연

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

성인 쥐 요로 방광에서 1 차신경및 glia의 격리 그리고 문화

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...