최근, 뇌성 동맥낭의 역할은 신경 장애 및 뇌 기능에서 분명하게 되고있다. 따라서 이러한 세포에 대한 신뢰할 수 있는 배양 방법의 개발이 필수적이다. 뮤린 대뇌 회낭의 추출을 위한 우리의 프로토콜은 체외 연구 및 고순도 및 세포 수율을 가진 pericytes를 제공하기 위한 믿을 수 있는 공구를 나타냅니다.
아우피야 메라와 함께 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 루시 데후크(Lucie Dehouck)가 될 것입니다. 먼저 특정 병원균이 없는 4~6주 된 남성 C57BL/6 마우스에서 멸균 건조 보풀이 없는 닦아내고 곡선팁 집게를 사용하여 소뇌, 무염 및 후신신경을 제거합니다. 면 봉면을 사용하여 눈에 보이는 수막을 모두 제거하고 뇌 조직을 거꾸로 돌립니다.
가벼운 바깥쪽 스트로크로 로브를 열고 눈에 보이는 혈관을 모두 제거합니다. 그런 다음 수막이 없는 뇌 조직을 100밀리미터 페트리 접시에 넣고 조직을 균질화 B.To하고, 뇌 샘플을 Dounce 조직 분쇄기 박격포 튜브로 옮기고, 튜브에 3~4밀리리터의 세척 완충제 B를 추가합니다. 느슨한 유봉을 사용하여 조직을 55 번 다진 다음 세척 버퍼 B로 유봉을 헹구고 단단한 유봉으로 조직 슬러리를 25 번 다진다.
균질화의 끝에서, 동등하게 두 50 밀리리터 튜브 사이의 슬러리를 알리쿼트와 감기 30 %소 세럼 알부민 dextran의 1.5 배 볼륨을 추가합니다. 그런 다음 적극적으로 슬러리를 혼합튜브를 흔들어. 혈관 분획을 분리하기 위해 세포를 원심분리에 의한 퇴적물을 2개의 새로운 튜브로 이송한다.
펠릿을 세척 버퍼 B에 얼음 위에 보관합니다. 얼음에 차가운 세척 버퍼 B의 세 밀리리터에 펠릿을 다시 중단합니다. 수확한 중첩자를 원심분리하고 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
슈퍼네이션을 버리고 3밀리리터의 세탁 버퍼 B.Then를 다시 매달린 펠릿을 풀링하고 풀링된 셀 서스펜션의 최종 부피를 신선한 냉기 세척 버퍼 B.The Further는 10mm 파이펫으로 세포를 6번 분리하고 진공 필터 조립및 용저 필터 를 사용하여 청소 필터를 사용한다. 페트리 접시에 여과기를 넣고 신선한 세척 버퍼 B로 메쉬를 치우고 모세혈관을 회수합니다. 그런 다음 신선한 필터로 두 번째 여과를 수행합니다.
두 개의 튜브 사이에 여과물을 균등하게 나누고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 수퍼나탈을 폐기한 후, 펠릿을 효소로 미리 데워진 세척 버퍼 B를 포함하는 단일 튜브에 풀을 넣고 예온된 콜라게나제/디스파제를 튜브에 추가합니다. 튜브를 37도에서 정확하게 33분 동안 흔들어 놓고 차가운 세척 버퍼 B.의 30 밀리리터로 반응을 멈추고 원심분리로 세포를 수집하고 상퍼를 조심스럽게 폐기하십시오.
신속 하지만 신중 하 게 세척 버퍼 B에 펠 릿을 6 번 다시 하 고 원심 분리 현 탁 을 다시. 상체를 폐기한 후, 완전한 DMEM 배지의 18 밀리리터에서 펠릿을 회수하고 3개의 Matrigel 코팅 6웰 플레이트의 9개의 우물에서 완전한 DMEM에서 셀 서스펜션의 2밀리리터를 시드한다. 세포 배양을 멸균 섭씨 37도 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 각 우물에서 이물질을 조심스럽게 제거하고 신선한 DMEM 미디어를 추가합니다.
48시간 후에는 48시간마다 매 음씩 매질을 변경합니다. 세포가 100%에 도달하면 8일에서 10일째에, 세포가 100%에 도달하면, 새로운 젤라틴 코팅 된 6 웰 플레이트에 백혈구 배양 배지의 세포를 통과하고 모니터링을 통해 6 ~ 7 일 동안 세포 배양 배양 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 그런 다음 17일째에 다시 세포를 회고배지로 새로운 젤라틴 코팅 플레이트로 분할합니다.
통로 0에서 2통로까지, 내피 세포와 회낭의 점진적 증가를 식별할 수 있는 특정 형태학적 특성이 있다. 통로 제로 배양에서, 마이크로 혈관에서 발전하는 길쭉한 내피 세포는 풍부합니다. 이 풍요로움은 1번 통로 후 감소하고 2번 통로 후에 결석한다.
반대로, 회낭은 초기 배양에서 드문 사분면 세포로 나타나고 2번 통로에 의해 풍부해진다. NG2, CD146 및 PDGFR 베타의 발현에 대한 평가는 정량적 PCR, 면역 세포화학 및 서양 블롯에 의한 pericyte 배양의 순도를 평가하는 데 사용될 수 있다. 효소 소화는 프로토콜의 성공을 위한 중요한 단계입니다.
효소 농도와 잠복기 시간을 엄격하게 모니터링하십시오.
