이 프로젝트는 네브라스카 대학 의료 센터 (창업 자금, MC S);에 의해 투자 되었다 NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) 및 미국 화학 학회, PRF # 57434-DNI7(MC-S).

1. 일반 프로토콜 PPAs의 합성에 대 한
<ol><li>종합 (보통 mmol)의 규모를 계산 합니다. 이 규모는 대상 PPA의 질량을 기반으로 합니다. SPPS의 반응 효율 아미노산의 증가 함께 점차적으로 감소 하는 유의 하십시오. 따라서, 정확한 반응 효율을 계산 하기가 어렵습니다.</li>
	<li>수 지의 로드에 따라 사용 되는 수 지의 무게를 계산 합니다. 로드는 컨테이너 또는 수 지의 분석 프로토콜 이며 mmol/g로 표현. 다음 수식은 수 지의 무게를 계산에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>2 chlorotrityl 염화 비닐 수 지에 밖으로 조심 스럽게 무게 (우리의 경우에는 로드는 ~0.85 mmol)</li>
	<li>다음 사양과 fritted 합성 용기에 수 지를 배치: 용량-50ml, Fritted 디스크-25 mm, 다공성-매체.</li>
	<li>수 지에 dichloromethane (DCM)의 15 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>가변 속도 기계 통 (플라스 크 쉐이 커/활동가), 합성 그릇을 부착 하 고 45 ° 각도 (또는 가로) 혈관 동요를 최대화 하기 위해.</li>
	<li>팽창 수 지 구슬 허용 15 분에 대 한 붓기 향상 반응의 수확량 분자 확산 및 활성 사이트 접근성 용이 하 게 결합 효율 향상.</li>
	<li>수 지에 원하는 polyamine (Spermine, Spermidine, Diethyelenetriamine, diaminopropane 1, 3, 등)의 8 등가물 (0.25 mmol 규모 2 mmol)을 추가 하 고 5 h에 대 한 반응을 수 있습니다. 참고: 덜 반응 기간 수익률을 줄일 것 이다.</li>
	<li>할는 카이 저 테스트 ( 재료의 표참조) 수 지에 polyamine의 성공적인 연결을 확인 합니다. 1 차 아민의 성공적인 결합 자유로운 아민에 해당 바이올렛/블루 색상을 생성 합니다.</li>
	<li>1 차 아민 그룹 반응 혼합물 하룻밤11떨고 무수 메탄올 (15 mL)에 녹 (Dde), 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl의 4 등가물을 사용 하 여 보호 합니다. 참고: 낮은 반응 시간 수확량을 감소 시킨다.</li>
	<li>카이 저 테스트를 수행 합니다. 수 지 구슬에서 파란색의 부재는 성공적인 보호를 확인 한다. 1 차 아민의 실패 보호 경우 이전 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>DCM을 배수 하 고 두 번 DCM와 DMF (2:1, 15 mL)의 혼합물으로 수 지를 세척.</li>
	<li>디-tert 부 틸 디-탄산 (Boc) DCM (20 mL)에서 20 등가물 (5 mmol)을 녹이 고 허용 3 h에 대 한 진행 하는 반응.</li>
	<li>chloranil을 할 2 차 아민의 완벽 한 보호를 확인 ( 재료의 표참조) 테스트. 긍정적인 시험 (보호) 무색 또는 밝은 노란색 컬러를 생성합니다. 무료 2 차 아민 주 아민에 게 붉은 색 어두운 녹색/파랑 색상을 제공 합니다.</li>
	<li>용 매 혼합물 배수와 DCM와 DMF (2:1, 15 mL)의 혼합물으로 두 번 세척.</li>
	<li>DMF (10 mL)에 히드라 진의 2% 솔루션을 추가 하 고 1 시간 흔들어.</li>
	<li>1 차 아민의 성공적인 deprotection를 확인 하는 카이 저 테스트지 않습니다.</li>
	<li>
역방향 시퀀스는 당신 것입니다 쓰기/그릴 그들에 원하는 아미노산을 추가 합니다. 펩 티 드 C 테르미니에 N 테르미니에서 얻을 수 있습니다 하지만 반대 방향으로 n C 합성 예를 들어 다음과 같은 펩 티 드를 필요로 하는 PPA에 대 한 코어-GLFD-, Aspartic 산 (D), 페닐알라닌 (F), 신 (L), 및 마지막으로 글리신 (G)를 추가. 참고: 대부분 아미노산에 대 한 다음 커플링 칵테일은 polyamine 로드 수 지에 첨부 파일에 대 한 적절 한입니다.<ol>
<li>Fmoc 보호 된 아미노산의 4 등가물 (1 mmol), 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexaﬂuorophosphate (HBTU)의 3.95 등가물와 15 diisopropylethyl 아민 (DIPEA)의 혼합.</li>
		<li>DCM와 DMF (1:1, 15 mL)의 혼합물에 그들을 녹이 고 (완전 한 해체)까지 2 분 동안 칵테일을 sonicate.</li>
		<li>아미노산에 carboxylic 산의 활성화 되도록 추가 3-5 분을 기다립니다.</li>
		<li>그릇에 반응 혼합물을 추가 합니다. 주위 온도에 2-4 h 반응 수행 합니다. 참고: 우리는 다음 발견 효율적인 대 안으로 HBTU (일반적으로 낮은 양의 아미노산와 커플링 에이전트 요구): DIC/Oxima, HATU, PyBOP, COMU.</li>
		<li>성공적인 연결을 확인 하는 카이 저 테스트지 않습니다.</li>
		<li>드 DMF에 4-메 틸 piperidine (10 mL)의 20% 솔루션을 추가 하 여 아미노산에서 Fmoc 그룹을 보호 합니다. 그것을 두 번, 각각의 시간 15 분에 대 한 반응 혼합물을 떨고. 참고: Fmoc 제거에 대 한 효율적인 대안 piperazine/DBU12입니다.<ol>
<li>추가 사이 DCM (15 mL) 세척을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>아미노산의 성공적인 드 보호를 확인 하는 카이 저 테스트지 않습니다.</li>
		<li>4-메 틸의 모든 흔적을 제거 철저 하 게 수 지를 세척. DMF (10 mL), 각 세척 5 분 지속으로 두 번 수 지 세척 그리고 마지막 10 분 동안 DCM (10 mL)와.</li>
		<li>커플링을 연속적으로 반복 하 여 모든 나머지 아미노산을 추가 하 고 드 보호 단계.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마지막으로, 모든 필수 아미노산을 결합 후 polyamine 펩 티 드 구성의 마지막 아미노산을 소수 성 꼬리 켤레:
	<ol>
<li>DCM와 DMF 혼합물 (1:1, 20 mL)에 녹아 있는 원하는 carboxylic 산 기능을 DIPEA의 HBTU의 9.5 등가물와 12의 10에 해당 추가 합니다. 참고: 명심 보다 일부 꼬리 용 매 (일반적으로: DCM의 큰 %) 또는 추가 또는 다른 용 매 N-methylpyrrolidone (NMP) 등의 다른 비율을 할 수 있습니다.</li>
		<li>(우리 본 완전히 해산 꼬리에 대 한 소요) 해산 때까지 5-10 분에 대 한 칵테일을 sonicate 선박 추가. 참고: 여러 반응 사이트를 포함 하는 꼬리에 대 한 그들은 그들을 결합 하기 전에 보호 될 필요 합니다.</li>
		<li>수행이 반응 (소수 성 꼬리 커플링) 적어도 5 시간, 비록 그것이 하룻밤 높은 수율에 대 한 그것을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PPA 분열 고체 지원에서
이 단계의 목적은 고 아미노산과 polyamine 잔류물에서 Boc 보호 그룹을 제거 하는 수 지에서 PPA의 분열 이다.
<ol><li>DMF (8 mL 2 분)와 함께 두 번 DCM (8 mL, 5 분 동안 각 시간) 수 지를 세척. 각 추가 전에 용기에서 용 매 드레인. 마지막 세척을 수행 15 분 동안 진공에서 수 지를 건조.</li>
	<li>다음 혼합 비율을 사용 하 여 절단 솔루션 준비: 28:1:1 trifluoroacetic 산 (TFA): H2O: Triisopropyl silane (팁). 15 mL 칵테일 분열의 H2O 0.5 mL 및 팁의 0.5 mL, TFA의 14 mL를 추가 하십시오.</li>
	<li>수 지에이 분열 솔루션을 추가 하 고 실 온에서 2-4 h 흔들.</li>
	<li>25에 솔루션을 수집 또는 50 mL 둥근 바닥 플라스 크.</li>
	<li>TFA vacuo에서 40 ° C에 혼합물을가 열 하는 동안 감압 회전 증발 기를 사용 하 여 1-2 mL에 집중 (PPA의 분해를 피하기 위해 55 ° C를 능가 하지 마십시오).</li>
	<li>증발 후 무수 차가운 에테르 (15 mL)를 포함 하는 둥근 바닥 플라스 크를 얻은 TFA 솔루션을 (dropwise) 추가 합니다. 이 즉시 PPA 침전 됩니다.</li>
	<li>또한, 원래 플라스 크는 TFA는 집중을 무수 차가운 에테르 (5 mL)을 추가 합니다.</li>
	<li>이 플라스 크 추가 솔리드 복구 단계 2.6에서에서 에테르 솔루션 결합을 sonicate합니다 참고: 전송 피 펫 DCM의 작은 양으로 세척 될 수 있다. 젤 같은 물질을 형성 하는 경향이 있기 때문에 과정에서 DMF를 소개 하지 마십시오.</li>
	<li>(적용) 냉장고 내부에 플라스 크를 놓고 그것은 강수량을 최대화 하기 위해 밤새 서 보자.</li>
	<li>소 결된 디스크 필터 퍼 널을 사용 하 여 진공 여과 의해 침전 된 자료를 수집 합니다. 이상적인 기 공 크기 또는 매체는.</li>
	<li>모든 잔여 유기 물 제거를 차가운 에테르 (5-10 mL)로 두 번 침전을 세척.</li>
</ol>3. MALDI 건조 드롭 메서드를 사용 하 여 원유 제품의 식별
<ol><li>
매트릭스 긍정적인 모드에서 분석을 위한 준비:
	<ol>
<li>분자량 분석 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI) 질량 분석을 사용 하 여 시작, microcentrifuge 튜브를 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산의 10 ~ 20 mg을 추가 합니다.</li>
		<li>물/이기 (1:1, 1.0 mL) 0.1 %Trifluoroacetic 산 (TFA)의 솔루션을 추가 합니다. Vortexing에 의해 철저 하 게 혼합. 참고:이 매트릭스는 충전 된 펩 티 드에 대 한 사용 해야 합니다. MALDI 부정적인 모드와 유사 하지만 용 매 첨가제로 0.1% 암모니아와 9-aminoacridine를 포함 하는 매트릭스를 요구 한다.</li>
		<li>MALDI에 대 한 샘플의 1-2 µ L 스테인레스 강판 대상에 추가 하 고 건조 한 공기에 샘플. 매트릭스의 1-2 µ L을 추가 하 고 다시 그것을 건조. 참고: 판 있다 원형 표시 대상 접시 특정 자리를 찾는 데 도움이 함께 gridded.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그들의 신원을 확인 MALDI 악기에 샘플을 분석 합니다. 분무 이온화 (ESI)는 PPAs의 id를 확인 하는 유효한 대안 이다.</li>
</ol>4. 대리점 역 상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정화를 사용 하 여 PPAs의 정화
<ol><li>
이기와 물의 최소 금액에 PPA 침전을 용 해.
	<ol>
<li>엄지손가락의 규칙으로 서 100 mg 미만 이기와 물 5 mL에 건조 원유 PPA의 분해. 더 소수 PPAs 해산 이기의 더 큰 백분율을 필요할 수 있습니다 고 PPAs (표 1)의 net 요금에 따라 더 큰 양의 용 매를 일반적으로 요구 또한 수도 있습니다.</li>
		<li>완전 한 해체 되지 않는 경우 장소, 추가 1 %TFA (ACN 또는 H2O). 그것은 또한 상당량의 다른 호환 dimethylsulfoxide, 메탄올, 또는 소 프로 파 놀을 포함 하 여 추가할 수 (그들의 콘텐츠를 5%로 제한).</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>용 매</td>
			<td colspan="2">긍정적으로 위탁된 PPAs</td>
			<td colspan="2">PPAs 부정 청구</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0.1 물에 % TFA</td>
			<td colspan="2">0.1 물에 % NH3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">0.1% TFA ACN에</td>
			<td colspan="2">0.1 ACN에 % NH3</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 용 매 시스템. 긍정적으로 그리고 부정적으로 위탁 PPAs에 대 한 용 매 시스템을 제안 했다.
<ol start="2"><li>48%의 Amp1와 10 s 펄스에서 20 분 동안 또는 2-3 h는 초음파 목욕에 대 한 경적 sonicator를 사용 하 여 PPA sonicate</li>
	<li>
그런 다음, 0.45 μ m 주사기 필터 여과 0.20 μ m 소계 (PTFE) 주사기 필터를 사용 하 여 다음을 사용 하 여 필터링 합니다. PPA 솔루션 명확 하 고 모든 미 립 자 물질의 무료 되어야 합니다.
	<ol>
<li>여과 너무 어려운 경우에, 시간의 연장된 기간에 대 한 sonicate. 그것은 좋습니다 PPA 솔루션 후 주사기 여과, 정화 즉시 는으로 장기간된 보관 될 수 있습니다 집계 하거나 gelate, 그것을 다시 쥡니다 그리고, 아마도, 다시 여과 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동안 그리고 정화 후에, HPLC 학년 용 매 또는 0.25 μ m 주사기 필터/멤브레인을 통해 필터링 된 것 들 중 하나를 사용 합니다. 참고: 가장 일반적인 용 매 조건 PPAs 정화 구성 H2의 그라데이션에서 O = 뉴스.</li>
	<li>표준 역 상 HPLC 악기를 사용 하 여이 프로토콜에 대 한. 그것은 차입 그라데이션 프로그래머, 이진 용 매 전달 시스템, 220 및 254 nm, 그리고 프로그래밍 가능한 분수 수집기에서 감지 수 있는 UV 검출기를 포함 해야 합니다. 최대 유량 50 mL/min 이어야 한다.</li>
	<li>사용 된 C-18 분리에 대 한 위상 열 반전. 다음 치수의 열 순화 되 고 고체의 질량에 따라 사용할 수 있습니다 그리고 그물 PPA (표 2)의 청구.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PPA 충전</td>
			<td>입자 크기</td>
			<td>열 크기</td>
			<td>원유 PPA의 질량</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 21.2 m m</td>
			<td>90 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>-ve 부과</td>
			<td>5 μ m</td>
			<td>150 x 21.2 m m</td>
			<td>90 밀리 그램</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 제안 열: 열 크기, 입자 크기 및 C18 주입 당 최대 부하 용량 역 상 HPLC 열
<ol start="7"><li>열 용량에 의해 결정는 HPLC의 주사 루프의 볼륨으로 볼륨 PPA를 주사. 표 3 (차입 시간 40 분) 설정에 따라 HPLC 그라데이션 메서드를 실행 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시간</td>
			<td>용 매 (이기)</td>
			<td>용 매 B (물)</td>
			<td>유량 (mL/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">유량 열 패킹 및 크기에 따라 달라 집니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
<tr>
<td>35</td>
			<td>95%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>38</td>
			<td>100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 제안된 그라데이션: 시간의 기간 동안 물 vs 이기의 상대 구성을 보여주는 역 위상 그라디언트를 제안 했다. 유량 열 사양에 따라 달라 집니다.
<ol start="8"><li>
MALDI를 사용 하 여 다양 한 테스트 튜브에 수집 된 분수를 분석 하 고 어떤 튜브 (또는 튜브) 포함 PPA 결정. 이것은 각 관에서 발견 하는 분자량을 공부 하 여 평가.
	<ol>
<li>분석 HPLC에 분수의 순도 확인 하십시오. 220에서 설정 하는 UV 검출기를 장착 하는 HPLC 그라데이션 시스템을 사용 하 여 nm.</li>
		<li>불순물 인 HPLC에 의해 정화의 추가 사이클을 할. 대리점 HPLC에 사용 되는 위의 그라데이션의 열 변환기 온라인 소프트웨어를 사용 하 여 분석 HPLC를 사용 하 여 확장할 수 있습니다. 각 분수는 많은 물리적 특성 또는 생물 학적 평가 대 한 순수한 ≥95% 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>큰 둥근 바닥 플라스 크 또는 증발 플라스 크에 분수를 수집 하 고 모든 이기와 물 대부분 제거. 최종 PPA 솔루션 10ml 더 이상 이어야 한다.</li>
	<li>이 집중 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송. PPAs 세제와 같은 물질;는 권고 따라서, 거품 용 매의 증발 하는 동안 생성 됩니다. 우리는 에틸 알코올의 거품 형성 감소 나타났습니다.</li>
	<li>진공 집중 집중. 진공 증발 동안 많은 양의 PPA 컨테이너의 벽에 준수 수 있습니다. 반복적으로 HPLC 물 플라스 크 벽을 rinsing 하 여이 복구 합니다. 집중된 PPA와 이트는의 결합 된 볼륨 30 mL 더 이상 이어야 한다.</li>
	<li>50 mL 튜브 내 용액을 놓습니다.</li>
	<li>
플래시는 액체 질소에이 PPA 솔루션을 고정: 참고: 것입니다 숭 고 한 빨리는 lyophilizer에 있는 작은 얼음 결정에 동결 결과 플래시. 또한, 느린 냉동 supramolecular 자기 조립 구조의 형성을 허용할 수 있습니다. 또 다른 대안 (하지만 덜 바람직한)은 점차-80 ° C 냉장고에서 동결 또는 드라이 아이스 + 아세톤 혼합물을 사용 하 여 고정<ol>
<li>lyophilizer에서 원심 분리기 튜브를 배치 하기 전에 구멍 또는 수 분 샘플을 탈출 하 고 냉장 장치에서 수집 된 수 있도록 튜브의 뚜껑을 푸 세요. -54 ° C와 0.016 mbar 설정 동결은 단위를 설정 합니다. 참고: 다른 옵션은 제거 하는 모자 고 개통 위에 (고무 밴드)와 지우기. 또한, 우리는 각도에서 샘플을 동결 하거나 작은 부분으로 얼음을 깨고 표면적 증가로 인해 빠르고 더 나은 동결은 대 한 수 있습니다 나타났습니다.</li>
		<li>솔리드 녹기 시작 하는 경우이 유기 용 매 (일반적으로 이기)의 흔적이 있는지 나타낼 수 있습니다. 동결 단계를 반복 하 고 동결은의 상태.</li>
		<li>녹는 지속 되 면, 두 가지 잠재적인 솔루션은:<ol>
<li>분할 (튜브에 배치)를 두 부분에서 샘플, 물으로 희석 하 고 다시 동결. 사용 하지 마십시오이 솔루션 종종 있기 때문에 많은 양의 유기 용 매는 장비 손상 될 수 있습니다.</li>
			<li>또는 술병에 샘플을 배치 하 고 더 진공에서 유기 용 매를 증발. 일반적으로 액체 형태로 샘플 lyophilizing 지원 해주 손실과 PPA 화합물의 리드.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. PPAs의 저장
<ol><li>저장소는 모자-20 ° C에 PPAs 강화 하 고 적절 한 상표를 가진 튜브에 Parafilm으로 밀봉.</li>
	<li>사용 하기 전에 PPA 다시 가져올는 PPAs에 수증기의 응축을 피하기 위해 진공 챔버에 주위 온도.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+and+x-ray-triggered+crystallization+at+long+range+in+self-assembling+filament+networks.">Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks.</a> Science. 327, 555-559 (2010).</li><li>Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+supramolecular+rigidity+of+peptide+fibers+through+molecular+structure.">Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).</li><li>Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+biomolecular+soft+matter.">Self-assembly of biomolecular soft matter.</a> Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).</li><li>Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterase-activated+release+of+naproxen+from+supramolecular+nanofibres.">Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres.</a> Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).</li><li>Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+biomolecules+for+nanoengineered+biomaterials+for+regenerative+medicine.">Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine.</a> Nanotechnology in Regenerative Medicine. , 39-49 (2012).</li><li>Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Polyamine-Based+Peptide+Amphiphiles+with+Tunable+Morphology+and+Physicochemical+Properties.">Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties.</a> Macromolecular bioscience. 17, (2017).</li><li>Nel, A. E., M&#228;dler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+biophysicochemical+interactions+at+the+nano-bio+interface.">Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface.</a> Nature Materials. 8, 543 (2009).</li><li>Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+cationic+lipid-based+nanoparticles+facilitate+endosomal+escape+and+reduction-triggered+cytosolic+siRNA+release.">Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release.</a> Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).</li><li>Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupicky&#769;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-immolative+polycations+as+gene+delivery+vectors+and+prodrugs+targeting+polyamine+metabolism+in+cancer.">Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer.</a> Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).</li><li>Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-containing+amine+oxidases+contribute+to+terminal+polyamine+oxidation+in+peroxisomes+and+apoplast+of+Arabidopsis+thaliana.">Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).</li><li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dde+-+A+selective+primary+amine+protecting+group:+A+facile+solid+phase+synthetic+approach+to+polyamine+conjugates.">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).</li><li>Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piperazine+and+DBU:+a+safer+alternative+for+rapid+and+efficient+Fmoc+deprotection+in+solid+phase+peptide+synthesis.">Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis.</a> RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).</li><li>Casero, R. A., Marton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+polyamine+metabolism+and+function+in+cancer+and+other+hyperproliferative+diseases.">Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).</li><li>Wuts, P. G. M., Greene, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , 696-926 (2006).</li><li>Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+racemization+and+aspartimide+formation+in+microwave-enhanced+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).</li></ol>

저자는 선언에 충돌의 관심을가지고

합성 파로 우물 및 펩타이드 기반 분자 (하이브리드 PA-peptoids) 등 관련 PPAs 하 여기에 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. SPPS를 사용 하 여 펩 티 드의 합성은 간단한 절차, 생물학 유도 분자를 포함 하는 펩 티 드의 종합 특히 도전 수 있습니다. Polyamines spermine, spermidine, diethyelenetriamine, 등, 유도 분자 암 세포13타겟팅으로 작동할 수 있습니다. PPAs 자체 다양 한 형태학6nanostructures로 조립할 수 있다. 그들의 긍정적인 요금 또한 긴 순환 시간 (때문에 endosomal 탈출)와 다른 신진 대사 프로필 (전통적인 PA와 비교) 하는 경우 도움이 됩니다. 그러나, PPAs 및 그들의 아날로그 합성 수 특정 도전 1 차 및 이차 아민의 존재 때문에. 제시 합성 전략 직각 보호 그룹의 합리적인 사용 하 여이 문제를 극복 한다. Dde 분자는 선택적으로 주 아민11만으로 반응을 겪 습. Boc, 다른 한편으로, 1 차 및 이차 아민과 무차별 하 게 반응 하 고, 따라서만 후 추가할 수 있습니다 1 차 아민 보호 됩니다. 우리는 다른 보호 그룹 Boc 대신 사용할 수 있습니다 언급 하 고 싶습니다. 예를 들어, 아세트산 무수 물과 반응 (이 그룹 제거 되지 것입니다 분열 중) 이차 아민 acetylate 영구적으로 됩니다. 마찬가지로, 무수 물 trifluoacetic 사용 하 여는 benzylcarbamate H2/Ni14에 의해 제거 될 수 있는 그룹을 줄 것 이다 하는 동안 기지에 민감한 보호를 제공할 것입니다. Polyamines는 필요에 따라 보호 된다, 일단 PPA의 합성 표준 SPPS를 사용 하 여 진행할 수 있습니다. 커플링 polyamine 펩 티 드 구성의 나머지 소수 성 꼬리 뿐만 아니라 오랜 기간 부부, 하지만 또한 아미노산의 어 금 니 금액 두 번 필요 합니다. 소수 성 꼬리의 일부 일부 전통적인 용 매에 실 온에서 잘 분해 되지 수도 또는 초기 해산 후에 침전 수 있습니다. 이러한 반응은 최고의 실행 된다 온화한 난방 (40 ° C)에서 전송 둥근 바닥 플라스 크에 모두 반응 하 여. 또는, 외피 합성기 선박 반응 물 반응에 걸쳐 온난 한 유지를 사용할 수 있습니다. 가능한 경우, 마이크로파 합성기 커플링15원조 수 있습니다.
다양 한 형태의 질량 분광학 PPAs의 질량을 결정 하기 위해 사용할 수 있지만, 우리는 우리의 식별 목적으로 MALDI 분광학을 사용 합니다. 우리가 발견 분자 이온 봉우리를 생산에 더 효과가 MALDI 조각화를 최소화 하 고 adduct 형성. MALDI는 PPA의 가능성이 가장 높은 이온화 상태에 해당 하는 이온을 생성 하기 위해 프로그램 한다. 특정 요금의 이온 생산 악기 프로그래밍, 외 우리 또한 우리가 사용 하는 모드에 대 한 적합 한 적합 한 매트릭스와 샘플을 결합 해야 합니다.
싶어 서 자주 하는 경향이 양식 소금 adducts MALDI 격판덮개에. 이 문제는 부정적으로 위탁 된 분자와 더 자주 보인다. 가장 일반적인 소금은 나트륨 (Na+ = 23 다) 및 칼륨 (K+ = 39 다). 이들은 5 월 adducts 아세트산의 1-2 µ L을 추가 하 여 억제. 일반적으로 PPAs H+ adduct를 제공 합니다. 만을 피하기 위해 추가 이온 도입 nanopore 물 또는 HPLC는 합성을 통해 물과 정화 과정을 사용 하는 것이 좋습니다. 붕 규 산 유리 용기 및 반응 용기는 최종 제품으로 걸러 것 이다 나트륨 이온의 상당한 금액을 포함할 수 있습니다. 마지막 세척에 대 한 nanopurewater를 사용 하 여 신중 하 게 유리를 헹 굴.
분자 이온 피크 식별 또한 어려워진 다 단단한 매트릭스와 매트릭스 솔루션 완전히 포화 하지 하는 경우. 채도 보장 하기 위해, 항상 solubilized 하지는 단단한 매트릭스의 작은 금액 이어야 한다.
최종 메모로 서, 일부 PPAs 또는 파 더의 추가 따라 어떤 침전을 형성 하지 수도 고려 하시기 바랍니다. 이 주로 더 친수성 PPAs에서 관찰 되었다. 같은 행사에 우리가 먼저 모든 에테르를 증발, NH4오 초과 TFA를 무력화 하 고 물과 이기 (0.1 %TFA 또는 NH4오)와 완전히 그것을 solubilize 평소 정화 진행을 추가.
여기에 설명 된 프로토콜 높은 순수 변형 자체 조립 polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles (PPAs) 또한 파의 합성에 사용할 수 있습니다. 직교 보호/deprotection 단계는 1 차 및 이차 아민 그룹의 선택적 보호를 필요로 하는 다른 상황에서 사용할 수 있습니다.

자가 조립 펩 티 드 amphiphiles (Pa)는 일반적으로 다음 세그먼트의 구성 하는 생체 재료의 클래스: (a) 친수성 머리, (b) 링커 지역, 및 (c) 소수 성 꼬리. 대부분 파 문학에 설명 된 충전 또는 극 지 아미노산 잔류물1,2,,34로 구성 된 친수성 머리를 소유한 다. 파 의학 등5, 재생 의학, 질병 진단, 약물 전달 등에서 다양 한 응용 프로그램을 발견 했습니다. 그들의 아미노산 서 열을 바탕으로, 파 nanostructures 구형 micelles 나노 필 라 멘 트 등의 다양 한을 형성할 수 있다. 우리 최근 하이브리드 polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles, PPAs6나의 클래스를 보고 있다. 형태학, 자가 조립 속도 론, 그리고이 생체의 대사 저하 solubilizing 머리 그룹 그들의 관련을 발견 했다. 또한, PPA nanostructures 테스트 농도에 포유류 세포 (MiaPaCa2 그리고 HeLa 세포 라인)으로 독성을 보여주지 않았다. PPA 기반 nanocarriers는 매력적인 마약 배달 차량 때문에: (1) polyamine 통풍 및 대사 암 세포 증가 표시 되었습니다, (2) 양이온 nanostructures endosomal 탈출7,8을 달성할 수 있다 높은 순환 및 셀, 및 (3) 그들은 PA;와 비교할 때 다른 신진 대사 프로필 있어야 내 거주에 이르게 예를 들어 그들은 인간의 신체에서 발견 하는 프로 테아 제 쪽으로 더 안정 될 것입니다 (비록 그들은 어쩌면 아민 oxidases 같은 다른 효소에 민감한)9,10. 또한, PPAs 다양 한 형태학, 물리 화학적 특성, 나노 강성 및 길이 개별 PPA 분자6의 요금에 따라 조립 활동 발견 되었습니다. 여기, 우리는 합성, 식별 및 파 또는 유사한 하이브리드 펩 티 드 분자의 준비에도 적용 될 수 있는 PPAs의 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
Polyamines는 일반적으로 그들의 보호 된 형태로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 고 이므로 polyamines의 1 차 및 이차 아민 보호 우리 설명 아미노산 및 다른 분자 들을 변화에 대 한 매우 중요 합니다 그들의 보호를 달성 하기 위해 합성 단계입니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 polyamines 아미노산을 변화에 대 한 간단한 방법을 제공 하는 것입니다. Polyamines 부족 carboxylic 그룹; 따라서, 그들은 링크 아 미드 또는 왕 수 지에 결합 될 수 없습니다. 대신, 2 chlorotrityl 염화 비닐 등 수 지 합성 프로토콜에 대 한 권장 됩니다. PPA 합성에 대 한 주요 도전 1 차 및 이차 아민 기능적인 그룹의 존재 이다. 우리의 목적을 위해 우리는 커플링 반응 수 있도록 무료 polyamine에 기본 아미노 그룹을 유지 하면서는 polyamine에 모든 이차 아민 보호. 반응 고체 지원 각 커플링 및 deprotection 단계 후 작업 업 촉진 하기 위하여 단단한 단계 펩 티 드 종합 (SPPS)의 원칙에 따라 이루어졌다. 다음 프로토콜은 PPAs의 수동 및 자동 합성에 대 한 (비록 몇 가지 단계의 검증 자동화 시스템에 도전 것입니다). 이러한 분자의 합성도 실행 될 수 있다 밖으로 자동된 합성기에 또는 전자 레인지 반응 기의 도움으로 (자동 또는 반자동). 반응 체계는 그림 1에 요약 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg"> 그림 1: (A) A PPAs의 합성에 대 한 일반적인 반응 체계. 하는 데 사용 될 수 있는 (B) 대표 polyamines PPAs 여기에 설명 된 합성. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Chlorotrityl chloride resin&#160;</td>
			<td>AappTec</td>
			<td>RTZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynthwareTM synthesis vessel&#160;</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>SYNP120050M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC406920250</td>
			<td>Fisher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>401000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser test kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS004772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Methanol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC610981000</td>
			<td>Fisher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloranil test kit</td>
			<td>TCI</td>
			<td>TCC1771-KIT</td>
			<td>VWR Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert butyl di-carbonate&#160;</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC194670250</td>
			<td>Fisher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrazine</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC296815000</td>
			<td>FIsher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)</td>
			<td>p3biosystems</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-methyl piperidine&#160;</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC127515000</td>
			<td>FIsher Sci. Catalogue #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>AappTec</td>
			<td>CXZ035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropyl Silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E138-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-Aminoacridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Syringe Filters: PTFE Membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-730-21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facile protocol for the synthesis of self-assembling polyamine-based peptide amphiphiles (ppas) and related biomaterials

펩 티 드 Amphiphiles polyamine 기반 (PPAs) 자가 조립 amphiphilic 펩 티 드 amphiphiles (Pa)에 바이오 관련의 새로운 클래스는. 전통적인 파 소유 그룹 (리 신, 아르기닌), 지질 세그먼트에 직접 연결 하거나 중립 아미노산의 링커 지구를 포함할 수 있습니다 solubilizing로 충전된 아미노산. 파의 펩 티 드 순서를 조정 하는 것은 다양 한 형태학 얻을 수 있습니다. 마찬가지로, PPAs 소수 성 세그먼트 및 중립 아미노산, 하지만 또한 물 (친수성) 그룹 solubilizing polyamine 분자를 포함. 파로 PPAs 때 물속에에서 녹아 있는 작은 봉, 트위스트 나노-리본, 및 융합된 나노 시트, 포함 한 다양 한 형태학에 자체 조립 또한 수 있습니다. 그러나, 단일 polyamine 분자에 1 차 및 이차 아민의 존재 PPAs 합성 때 상당한 도전 포즈. 이 문서에서 우리는 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)을 사용 하 여 PPAs의 손쉬운 합성을 달성 하기 위해 문학 판례에 따라 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 우선권 및 다른 유사한 시스템의 합성에 확장할 수 있습니다. 우리는 또한 수 지, 식별 및 정화에서 분열에 필요한 단계를 보여 줍니다.

합성 및 정화 후 및 물리 화학적 또는 생물학적 평가 전에 PPAs의 대 중은 다시 확인 및 순도 분석 HPLC를 사용 하 여 확인 하는 것이 좋습니다. 소재 특성 또는 생물 학적 평가, PPAs 필요가의 순도 > 95%. 그림 2 는 HPLC 추적 (맨 위) 및 제품의 존재를 확인 MALDI 스펙트럼 (아래). HPLC 분석 시스템 (AUC) 곡선 아래의 영역을 통합 하 고는 AUC > 제품 순도 95%를 관련이 있을 수 있습니다. UV 기반 HPLC 시스템, 단일, 날카로운 피크를 보고 기대 합니다. MALDI 스펙트럼 (MALDI 분석 모드)에 따라 ± 1 다 내에서 PPA의 계산 된 분자량의 일치 해야 합니다.
자기 조립은 PPAs의 구상 될 수 있다 및 전송 전자 현미경 (TEM) (그림 3A, B), 원자 힘 현미경 (AFM) (그림 3C, D), 작은 각 엑스레이 포함 하 여 무수 한 기법을 사용 하 여 분석 산란 (SAXS), 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 및 동적 빛 (DL)을 비 산. 자기 조립 성공 AFM에 가장 잘 정의 된 nanostructures 발생 합니다. 자기 조립 실패 몇 백 나노미터 크기는 불규칙 한 집계의 형성에서 어느 결과 것입니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig2.jpg"> 그림 2: 대표 분석 HPLC 크로마 (위)와 PPA C16V22Spermine MALDI 스펙트럼 (아래). 이 그림 Samad 외. 20176;에서 수정 되었습니다. 2018 존와 일리 & 아들의 허가 다시. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig3.jpg"> 그림 3: 대표 전송 전자 현미경 (TEM) 현미경 사진. (A) 편 이미지 nanofiber 및 융합된 nanosheets의 대형 번들된 나노 시트, (C) 원자의 형성을 보여주는 (B) 확대 삽입 힘 현미경 (AFM) 현미경 사진, (D)와 높이 지도에서 파생 된 C16V2는2KDiethyelenetriamine에 대 한 현미경 사진. (D)의 X 및 Y 축 나노 시트 폭 및 나노 시트 높이 각각 나타냅니다. 이 그림 Samad 외. 20176;에서 수정 되었습니다. 2018 존와 일리 & 아들의 허가 다시. <a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles PPAs and Related Biomaterials

Polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles (PPAs)의 합성은 이러한 반응 기능 마스크 그룹 보호의 사리 분별이 사용 여러 아민 nitrogens의 존재로 인해 중요 한 도전 이다. 이 문서에서 우리는 자기 조립 분자의 이러한 새로운 클래스의 준비에 대 한 손쉬운 방법을 설명합니다.

Polyamine 기반 펩타이드 Amphiphiles (PPAs) 및 관련된 생체 자기 조립의 합성에 대 한 손쉬운 프로토콜

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

facile-protocol-for-synthesis-self-assembling-polyamine-based-peptide

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

8.0K 조회수.  University of Nebraska Medical Center. Polyamine 기반 펩타이드 amphiphiles (PPAs)의 합성은 이러한 반응 기능 마스크 그룹 보호의 사리 분별이 사용 여러 아민 nitrogens의 존재로 인해 중요 한 도전 이다. 이 문서에서 우리는 자기 조립 분자의 이러한 새로운 클래스의 준비에 대 한 손쉬운 방법을 설명합니다.

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

연구

화학

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

A Direct, Early Stage Guanidinylation Protocol for the Synthesis of Complex Aminoguanidine-containing Natural Products

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important structural element found in many complex natural products and pharmaceuticals. Owing to the continual discovery of new guanidine-containing natural products and designed small molecules, rapid and efficient guanidinylation methods are of keen interest to synthetic and medicinal organic chemists. Because the nucleophilicity and basicity of guanidines can affect subsequent chemical transformations, traditional, indirect guanidinylation is typically pursued. Indirect methods commonly employ multiple protection steps involving a latent amine precursor, such as an azide, phthalimide, or carbamate. By circumventing these circuitous methods and employing a direct guanidinylation reaction early in the synthetic sequence, it was possible to forge the linear terminal guanidine containing backbone of clavatadine A to realize a short and streamlined synthesis of this potent factor XIa inhibitor. In practice, guanidine hydrochloride is elaborated with a carefully constructed protecting array that is optimized to survive the synthetic steps to come. In the preparation of clavatadine A, direct guanidinylation of a commercially available diamine eliminated two unnecessary steps from its synthesis. Coupled with the wide variety of known guanidine protecting groups, direct guanidinylation evinces a succinct and efficient practicality inherent to methods that find a home in a synthetic chemist&#39;s toolbox.

Here, we present a protocol for direct, early stage guanidinylation that enables rapid total synthesis of aminoguanidine-containing small organic molecules. An advanced synthetic intermediate used in the synthesis of a blood coagulation factor XIa inhibitor was prepared using this protocol.

복잡한 아미노 구아니딘 함유 천연 제품의 합성에 대한 직접, 초기 단계 Guanidinylation 프로토콜

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

의 합성을위한 프로토콜<em&gt; 직교</em&gt; -trifluoromethoxylated 아닐린 파생 상품

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Photoredox 촉매를 사용하여 가시 광선 중재 분산 중합에 의해 웜 형상 미셀 손쉬운 합성

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous networks, ribbons, worm-like aggregates, toroidal structures, and spherical particles) is described. These aggregates are morphologically influenced by extensive hydrophobic side chain-side chain interactions of the singular polycarbodiimide strands, as inferred by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Polycarbodiimide-g-polystyrene copolymers (PS-PCDs) were prepared by a combination of synthetic methods, including coordination-insertion polymerization, copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) &#34;click&#34; chemistry, and atom transfer radical polymerization (ATRP). PS-PCDs were found to form specific toroidal architectures at low concentrations in CHCl3. To determine the influence of a more polar solvent medium (i.e., THF and THF/EtOH) on polymer aggregation behavior, a number of representative PS-PCD composites have been tested to show discrete concentration-dependent spherical particles. These fundamental studies are of practical interest to the development of experimental procedures for desirable architectures by directed self-assembly in thin film. These architectures may be exploited as drug carriers, whereas other morphological findings represent certain interest in the area of novel functional materials.

Here, we present a protocol to prepare and visualize secondary structures (e.g., fibers, toroidal architectures, and nano-spheres) derived from helical polycarbodiimides. The morphology characterized by both atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) was shown to depend on molecular structure, concentration, and the solvent of choice.

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A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

2&#39;- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜<em&gt; O</em&gt; 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...