이 원고의 작성은 Colorado University Denver (JMRE)의 창업 자금을 통해 지원되었습니다. AF는 연구 및 창조 활동 상 (RaCAS, CU Denver)에서 지원을 인정하고자합니다. 콜로라도 주립 대학 덴버 연구 서비스 사무소 (University of Colorado Denver)에서 기부금을 충당하기 위해 자금을 지원합니다. 비디오 부분에 공헌 한 Cassandra Herbert 선생님과 Yannick K. Dzowo 선생님 께 감사드립니다.

1. RNA Oligonucleotides의 고상 합성 <ol><li> 각 포스 포르 아미 다이 트를 함유 한 용액의 제조 (표 1). <ol><li> 뉴클레오타이드의 수를 세고 각 염기에 해당하는 n + 1 방정식 (n = 뉴클레오타이드의 수)에 맞추고 표에 누락 된 값을 기입하십시오. 용적 = 0.1 M 농도의 뉴클레오타이드 당 0.15 mL, 무수 아세토 니트릴에 용해. </li><li> 오븐 건조한 10 mL 앰버 병 (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top)에 각 phosphoramidite를 칭량하고 건조제가 들어있는 데시 케이 터를 사용하여 진공 상태로 즉시 놓습니다. </li><li> 건조한 아르곤으로 데시 케이 터를 채우고, 병을 꺼낸 다음, 해당 아세토 니트릴 (무수)의 양으로 즉시 희석하여 기기에 고정시킵니다. 참고 : 항상 기밀 식 주사기를 사용하고 무수 대기를 유지하십시오. </li><li> 병에서 셉터를 제거하고 m 위에 놓습니다.achine, 병 변경 기능을 통해. 참고 :이 과정은 합성하기 전에 라인을 프라임하기 위해 각 솔루션의 추가 0.15 mL (따라서 위의 n + 1 공식에서 초과 부피)가 필요합니다. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 사용한 시퀀스 및 고체상 합성의 설정 ( 그림 3 ). <ol><li> 소프트웨어 아이콘 ( 예 : OligoNet 1.0.1)을 클릭하고 기기 이름&gt; 확인을 선택하십시오. 파일&gt; 새 합성&gt; 순서 로 새 합성을 만듭니다. </li><li> 입력 : 날짜; RunID; 악기 선택; 시퀀스 이름; 서열 (5 &#39;에서 3&#39;말단). 순환에서 이전에 작성된 메소드를 지정하십시오 ( 그림 3 ). 끝 절차 ( CPG 수지에 결합 된 올리고 뉴클레오타이드 잎)&gt; 수동을 선택하십시오. </li><li> DMT Off&gt;를 선택하십시오 (합성 마지막 단계에서 5&#39;-OH 그룹을 얻는 마지막 단계에서 TCA 처리) . 파일 저장&gt; 다른 이름으로 저장실험의 이름을 제공하십시오. </li><li> 파일을 보내어 합성을 시작하십시오. 순서&gt; 신디사이저에 순서를 보내고 열을 선택하십시오. 1-4 . 신시사이저 창을 열고 trityl 모니터를 선택하십시오 | 기능 | trity | 모든 단계를 선택하십시오 . </li><li> 한 번에 합성 할 올리고 뉴클레오타이드의 수에 따라 필요에 따라 단계를 반복하십시오 (모든 주문은 동일한 방법, 즉 동일한 커플 링 시간 및 일련의 사건을 가져야 함). </li><li> 합성 시작 합성기&gt; 시작 준비 . 측량기에 표시된 위치에 원하는 3 &#39;끝이있는 기둥을 놓습니다. 장비에서 시작&gt; 아니오 (ABI 준비 용)를 클릭 하십시오 . </li><li> 합성이 완료되면, 칼럼을 장비에서 꺼내어 둥근 바닥 플라스크에 넣고 약 0.5 시간 동안 감압 건조시킵니다. 참고 : 짙은 주황색이 랜드에서 관찰되는지 확인하는 것이 좋습니다옴 커플 링 (단계 1.2.4 - 1.2.7)을 사용하여 트리 틸 모니터 기능에서 발생할 수있는 오류를 피하십시오. </li></ol></li><li> RNA oligonucleotides의 탈 보호 및 정제. <ol><li> 검정색 뚜껑을 비틀어 컬럼을 열고 흰색 레진을 1.6 mL 원심 분리 튜브로 모두 옮깁니다 (필요에 따라 또는 목적에 따라 절반). 메틸 아민 (물에서 40 %) / 암모니아 (물에서 40 %) 0.5 mL를 1 : 1로 첨가한다. </li><li> Parafilm으로 원심 분리 튜브 캡을 고정하고 열 블록을 사용하여 1.5 시간 동안 60 ° C로 가열합니다. 참고 : 암모니아 농도가 반응 튜브 내부에서 일정하게 유지되도록 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓을 수 있습니다. </li><li> 가열 블록에서 꺼내 천천히 실온으로 식힌다. 샘플을 간단히 원심 분리하여 내용물을 회전시킨 다음 상징액을 새로운 원심 분리 튜브로 옮긴다. </li><li> 액체 질소 (또는 드라이 아이스 / 에탄올 욕조)에 튜브를 담그고 샘플을 얼려서 방치하면서 건조시킵니다감압하에 원심 분리기에 넣는다. </li><li> 0.4 mL의 triethylamine / N- methylpyrrolidinone / triethylamine-trihydrofluoride (2 : 2 : 3 비율) 용액에 고체를 재현 탁한다. 1.5 시간 동안 60 ℃로 가열 한 후 실온으로 서서히 냉각시킨다. </li><li> 0.04 mL의 NaOAc 용액 (3M, pH 5.5 - HCl로 조정)을 첨가 한 후 피펫 팁으로 부드럽게 섞는다. 에탄올 (1 mL)을 넣고 ca. -70 ℃ (드라이 아이스 / 에탄올 욕) 15 분. </li><li> 15,000 rpm 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오. 분액을 추출하고 결과 펠렛을 감압하에 건조 시키려면 피펫을 사용하십시오. </li><li> 수득 된 고체를 로딩 완충액 (0.2 mL, 90 % 수성 포름 아미드, 1 mM EDTA)에 재현 탁시키고, 혼합물이 균질해질 때까지 혼합한다. </li><li> 이전에 준비한 폴리 아크릴 아마이드 젤 (20 % denaturing, 잘 치수 : 30cm x 1mm) 위에 현탁액을 적재하십시오. 22 . </li><li> 브로 모 페놀 블루 마커가 1 / 2-2 / 3 사이에있을 때까지 겔을 통해 전류를가한다.(젤 치수 : ~ 21.5 cm x 30 cm). </li><li> 스탠드에서 젤을 꺼내고 젤 내용물을 유리에서 플라스틱 포장 (양면으로 덮음)으로 옮기고 실리카 (254 nm의 형광 염료를 포함)로 덮인 얇은 층 크로마토 그래피 (TLC) 판 위에 올려 놓아 밴드를 시각화합니다 자외선 램프 (λ max = 254 nm)를 사용하여 측정 하였다. </li><li> 마커를 사용하여 위쪽 밴드가있는 위치를 묘사하고 새 면도날을 사용하여 자릅니다. 50 ML 원추형 튜브에 RNA가 들어있는 젤 (플라스틱 포장 없음)을 놓고 유리 막대를 사용하여 작은 조각으로 밟아. </li><li> 겔 잔류 물을 NaCl aq에 현탁시킨다. 용액 (2 mM 및 1 mM EDTA)에 현탁시키고 37 ℃에서 12 시간 동안 현탁액을 흔든다. 10 분 동안 원추형 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 역상 C18 카트리지를 사용하여 탈염하십시오. <ol><li> 다음과 같이 세척하여 10mL 주사기를 사용하여 카트리지를 준비하십시오 : 아세토 니트릴 (10 mL) H 2 O (2 회, 10 mL) 중 5 mM NH4 Cl aq. 용액 (3 mL) RNA가 포함 된 용액으로 겔 잔류 물을 부어서는 안됩니다. </li><li> H 2 O로 (세 번, 10 ml)로 세척 하였다. </li><li> 60 % aq. 메탄올 용액 (3 mL) </li></ol></li><li> 감압 농축하고 RNase가없는 물 (0.3 mL)에 재용 해한다. </li><li> 묽은 용액 (10 μL)을 준비하고 자외선 vis 스펙트럼 (200-450 nm)을 측정하기 위해 UV-vis 장비 ( 예 : Nanodrop)에 1 μL를 침전시킵니다. </li><li> Beer Lambert의 법칙을 사용하여 얻은 용액의 농도를 결정하십시오 : <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> 여기서 A = 얻어진 흡광도; ε = 계산 된 몰 흡광 계수; c = 농도, 1mm의 경로 길이에 대해 l = 0.1이다. </li><li> 올리고 뉴클레오타이드의 몰 흡광 계수를 계산하십시오. 온라인 계산기로 계산DINAMelt 소프트웨어 (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)를 사용하는 경우 23 </li></ol></li><li> MALDI-TOF를 통한 농도 측정 및 특성 분석. <ol><li> 시료를 C18 팁으로 적재 된 피펫 팁을 사용하여 MALDI 플레이트에 올려 놓고 각 올리고 뉴클레오타이드를 관찰한다. <ol><li> 팁을 50 % 아세토 니트릴 (10 μL x 2)로 씻으십시오. 팁을 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA; 10 μL × 2)로 평형화한다. tip을로드하십시오 (일반적으로 100-150 pmol). </li><li> 팁을 0.1 % TFA (10 μL x 2)로 씻은 다음 물 (10 μL x 2)로 씻으십시오. </li><li> 원하는 매트릭스를 포함하는 용액으로 시료를 용리십시오. 우리는 : 10 μL 25 MM - 2,4,6 - trihydroxyacetophenone 일 수화물 (THAP), 10 MM 암모늄 구연산염, 그리고 50 % 아세토 니트릴에 300 MM 암모늄 불화물의 솔루션을 사용. </li><li> 0.9 μL을 입금하고 (공기 건조 후) 필요에 따라 절차를 반복하여 MALDI 플레이트에 직접 놓습니다. 참고 : 모든 스펙트럼은 리플렉터 포지티브 모드에서 얻습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. CD 를 통한 RNA 구조 분석 <ol><li> CD 용 솔루션 준비. <ol><li> 수정 된 RNA [3 μM], NaCl [10 mM], 인산 나트륨 완충액 [10 mM, pH 7.2] 및 MgCl 2 [5 mM]을 함유하는 0.25 mL를 준비한다. 이 샘플은 그대로 분석을위한 준비가되어 있습니다. 특히 그것이 단 분자 변환을 나타내는 경우. </li><li> 이중 구조 또는이 분자 전이를 분석하는 것이 목표 인 경우,이 시점에서 보체 (해당되는 경우 1 몰 당량)를 추가하거나 아래 단계를 계속 수행하십시오. </li><li> 샘플을 90 ° C로 예열 한 열 블록에 올려 놓고 열을 꺼서 실내 온도 (일반적으로 2 ~ 4 시간)로 서서히 식히십시오. </li></ol></li><li> 스펙트럼 획득 <ol><li> 빈 용액 (NaCl 10mM, 인산 나트륨 10mM, pH 7.3, MgCl 2 5mM)을 옮기고o 마이크로 큐벳 (경로 길이 1cm, 최소 용량 250 μL)을 채우고 샘플 체인저 홀더 위치에 놓습니다. </li><li> RNA가 들어있는 시료를 다른 마이크로 큐벳으로 옮기고 시료 교환기에 넣습니다. 열 변성 전이를 측정 할 때는 수성 층을 파괴하지 않고 조심스럽게 오일 베드를 넣고 테프론 테이프를 사용하여 큐벳의 캡을 고정시킵니다. </li><li> 질소 탱크를 열어 계기에 위치한 공기 플로터를 ca.로 이동시키는 흐름을 제공하십시오. 40. 냉각기를 켜십시오. </li><li> 기기를 켜고 소프트웨어 Spectra Manager 아이콘을 연 다음 획득 윈도우 Spectra Measurement 를 엽니 다. </li><li> 획득하기 전에 장비를 5 분 동안 질소로 퍼지하십시오. </li><li> Measure&gt; Parameters를 사용하여 스펙트럼을 획득하고 다음과 같이 매개 변수 를 조정하십시오 : <ol><li> 일반 아래에서 다음을 선택하십시오. 스캔 200-350 nm; 채널 CD 및 HT : 데이터피치 0.1nm; 100nm / 분에서 스캐닝 속도; 1nm에서의 밴드 폭; 5의 누적 횟수. </li><li> 세포 단위 아래에서 20 ° C를 선택하십시오. 제어 하에 셔터가 자동으로 열리고 닫힙니다를 선택하십시오. 정보 아래에서 이름, 농도, 운영자를 선택하십시오. </li><li> 데이터 아래에서 원하는 폴더를 찾습니다. 확인을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 측정&gt; 샘플 측정 을 통해 샘플 체인저 1-6 에서 큐벳의 위치를 ​​확인한 후 OK를 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 열 변성 전이를 취하는 경우 : <ol><li> 획득 소프트웨어 닫기 파일&gt; 종료 및 새 프로그램 가변 온도 측정&gt; 측정&gt; 매개 변수를 엽니 다. </li><li> 원하는대로 조정할 수있는 열 전환을 기록하려면 다음 매개 변수를 적용하십시오. <ol><li> 온도 에서 시작 온도 를 선택하십시오 : 4 ° C; 간격 : 0.2; 고마워rget : 90 ℃; 기울기 : 1 ℃ / 분; 0 초 기다린다. Start / End 에서 Start condition &amp; end condition을 원하는대로 선택하십시오. </li><li> General (일반 ) 아래에서 3 Channels, CD / HT / Abs를 선택합니다. 대역폭 : 1 nm; 파장 : 270 nm (또는 원하는대로). 제어 에서 없음을 선택하십시오. 정보 에서 이름, 농도, 운영자를 선택하십시오. </li><li> 데이터 아래에서 원하는 폴더를 찾습니다. 확인을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 샘플을 4 ° C로 냉각시키고 스펙트럼 측정을 얻기 전에이 온도에서 5 분 동안 기다리십시오. </li></ol></li><li> 스펙트럼에 대한 데이터 작업. <ol><li> 소프트웨어의 기능을 사용하여 대상 획득에서 공백 스펙트럼을 뺀 다음 사용중인 버퍼 시스템에서 발생하는 백그라운드 신호를 고려하십시오 : Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> 빈 파일과 스펙트럼 파일이 열리면 뷰 1 (화면의 왼쪽)에서보기 2를 드래그하십시오. </li><li> Pr을 클릭하십시오.ocessing&gt; 빼기&gt; 확인 또는 데이터 교환&gt; 확인 . </li><li> ASCII 파일로 데이터 추출 : 파일&gt; 내보내기 를 선택하고 ASCII를 선택하십시오. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 해당 스펙트럼을 그립니다. 신호 대 잡음비가 예상보다 낮을 경우 데이터 평활화는 선택 사항입니다. 이 변환은 평활화 데이터 옵션을 적용하여 적용 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 열 변성 전이에 대한 데이터 작업. <ol><li> JASCO 파일의 데이터를 ASCII 파일로 추출합니다. </li><li> 타원율 점을 온도의 함수로 플롯합니다. 일반적으로 조사되는 파장에 따라 데이터의 평활화가 필요합니다. 어떤 경우에는 210 nm에서 파장을 사용하면 평탄화가 필요한 플롯간에 큰 차이가 나타났습니다. 그러나 샘플 및 농도에 따라 여러 가지 계산이 원시 데이터를 사용하여 수행되었습니다. </li><li> 열 덴트를 계산하려면aturation transition (T m ) 값은 곡선의 1 차 미분을 얻습니다. 최대 또는 최소값은이 매개 변수를 나타냅니다. 이전 단계 에서처럼 가장 정확한 값을 얻으려면 데이터를 부드럽게 처리해야하는 경우가있었습니다. 참고 : 실험은 일반적으로 3 회 수행되어 측정에 해당하는 평균 및 표준 편차가 발생했습니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 원고의 취지는 DNA 또는 RNA의 올리고 뉴클레오타이드의 합성을 성공적으로 달성하거나 향상시키기위한 분야의 연구자, 초보자 또는 전문가에게 가이드 역할을하는 것입니다. 설명 된 방법론은 표준 phosphoramidite 화학을 통해 자동화 된 DNA / RNA 합성기를 사용하는 고상 합성의 사용에 중점을 둡니다. 보고서는 RNA dodecamer의 합성, 정제 및 특성 분석을 단계별로 설명합니다. 또한, CD의 사용은 2 차 구조 모티프 및 열 변성 전이를 확인하는데 사용된다. 이 작업은 다른 상황, 즉 고상 합성에서 다양한 브랜드의 장비, 개조, 보호 그룹 및 / 또는 시약에 적용 할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 따라서,이 과정에 관여하는 많은 매개 변수 중 하나 이상을 변경하거나 반응 조건을 조정하여 개선 할 수 있습니다. 나는또한 여기에 제공된 상세한 구조 분석 (CD를 통해)은 일반적으로 UV-vis 를 통해 유사한 분석 을 수행하는이 분야의 연구자들에게 대안적인 접근법을 제공 할 것으로 기대됩니다. 고체상 합성을위한 포스 포르 아미 다이 트의 질량을 결정하기위한 계산은하기 나타낸 서열을 기초로하고, 네 개의 올리고 뉴클레오티드를 제조하고 동일한 작업 (밑줄 친 위치는 2&#39;- O- 티오 페닐 메틸 변형의 존재를 나타냄) . 모든 계산 및 값은 표 1에 포함되어 있습니다. 1 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; 2 5 &#39;- [CUA CGG A AU CAU] -3&#39; 3 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; 4 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39; 아마도 RNA 취급에서 가장 중요한 측면은 리보 뉴 클레아 제 분해에 대한 감수성과 그 전자ASE는 수용액에 금속의 존재 하에서 24에서 이온 가수를 받아야한다. 따라서, RNase-free 조건은 다음과 같이 항상 25 에서 시행되어야한다. 1) 모든 물은 디 에틸 피로 카보네이트 (0.1 % w / v, DEPC)의 존재하에 고압 증기 멸균되었다. 2) 모든 유리 제품을 오토 클레이브 한 후 오븐 (150 ° C, 하룻밤)에서 구운 다음 DEPC 처리 수로 헹구십시오. 3) 모든 튜브 및 피펫 팁은 RNase-free 형태로 제조사로부터 구입했습니다. 4) 장갑은 항상 사용되었고 작업은 지정된 후드에서 수행되었습니다. 5) 모든 표면과 장비를 다양한 제조업체의 구매가 가능한 RNase 오염 제거 솔루션으로 지속적으로 닦아 냈습니다. 모든 정제 RNA는 사용 빈도에 따라 -20 ° C 또는 -80 ° C에서 소량으로 나누었으며 비 절단 또는 정제되지 않은 수지는 20 ° C에서 보관했습니다. 우리가 이전에 지적한 것처럼 16 , oligonucleotiDES는 본원에 기재된 방법 및 10-34 사이의 뉴클레오티드 길이 다른 리포트 (26)보다 더 높은 안정성을 표시하는 크기를 얻을. RNA를 27 이상 처리 할 때 따라서, 독자는 다른 저장 과정이라한다. 자동 합성에서 단계별 수율 (탈 트리 틸화 단계를 통해 계산)은 97-100 % 사이였으며, 특히 개선 된 커플 링 효율의 좋은 지표였다. 수지로부터의 절단, 탈 보호 및 정제 (겔 전기 영동을 통한 ) 후 30 내지 75 %의 전체 수율이 수득되었으며, 이는 약 300 내지 750 nmol의 분리 된 올리고 뉴클레오타이드에 상응한다. 물론, 변형의 도입은 RNA 가닥의 전체 수율에는 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이러한 범위는 수용 가능한 양으로 간주 될 수 있지만, ~ 50 뉴클레오타이드보다 큰 올리고 뉴클레오타이드의 합성 (이전의 우리 실험실에서 발표되지 않은 데이터)은 98 % 이하의 단계적 수율에 의해 유의 한 영향을받을 수있다. 따라서, 50 개 이상의 뉴클레오타이드가 요구되는 경우, 예를 들어 아세토 니트릴의 공급원을 고품질로 바꾸고, 포스 포르 아미 다이 트가 대기에 노출되는 시간을 최소화하고, 인산염 염화물을 한 세트로 희석하도록 프로그램 할 수있는 경우 값을 매 번 표준 포스 포르 아미 다이 트의 새로운 병을 사용하는 동안, 전기 영동 분석 대신에 HPLC 정제를 사용하거나,보다 경미한 탈 보호 조건을 사용한다. 모든 올리고 뉴클레오티드에 대한 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF MS)은 ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF 질량 분석기에서 양성 모드로 수행 하였다. 모든 샘플은 본원에 기술 된 절차를 사용하여 준비되었고 ON 1 - 3 에 대한 스펙트럼의 예가 그림 5에 나와 있습니다. 모든 실험은 일반적으로 tripli에서 수행됩니다케이트. 모든 스펙트럼과 실험 설정은 Rectangular 6-Cell Holder가 장착 된 spectropolarimeter에서 수행되었습니다. 모든 유리 제품을 RNase 제거 용액으로 씻고 RNase가없는 물로 완전히 헹구었다. 모든 샘플은 각 측정 후에 폐기되었습니다. 고압 전압 (HT는 계측기로 측정되는 매개 변수)에 세심한주의를 기울여야 함을 지적하는 것이 중요합니다. 이것은 신호의 채도를 나타낼 수 있으므로 데이터의 정확성과 유효성에 위협이됩니다. 이 매개 변수는 샘플에 따라 다르며 주어진 시간에 신호가 500mV를 초과하지 않도록 유지되어야합니다. ON 1 - 3의 혼성화 전후의 CD 스펙트럼의 예가 그림 6 에 나와 있습니다. 또한, 나트륨 염 (및 다른 완충제 시스템)의 농도를 증가 시키거나 다른 완충 시스템을 사용하여, 예 : HEPES 또는 MOPS는 220 nm 이하로 증가 된 소음을 초래합니다. 따라서 210 nm에서의 밴드는 A 형 이중 결합의 형성을 따르는 데 특히 중요하기 때문에 나트륨 이온의 최대 농도는 ~ 10 mM로 유지됩니다. 우리는 또한 CD의 사용이 자외선 분광법에서 얻은 것과 동일한 매개 변수를 제공한다는 것을 보여줍니다. 결론적으로, 우리는 변형 및 비 변형 RNA oligonucleotides를 합성, 정제 및 특성화하는 절차를 기술하고 설명합니다.

DNA / RNA의 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 고상 합성은 포스 포르 아미 다이 빌딩 블록 4를 사용하는 1970 년대 1 , 2 , 3 이후 여러 분야에서 여러 분야에서 응용되고있다. 그 광범위한 영향의 예는 다음과 같습니다 : 클릭 화학 반응을 통한 라벨링에 미치는 영향 5 , 구조적 탐침 6 및 안티센스 기술 7 , 생물학적 메커니즘 8 , 9 , 유전 물질 10의 출처 및 다양한 천연 및 / 또는 화학적 변형 11 , 12를 포함 한다. 우리가 여기에서 사용하는 변형은 포함하는 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 우리의 노력의 첫 번째 단계를 나타낸다.이 중요한 생체 고분자의 구조와 기능을 일시적으로 제어 할 수있는 광활성 프로브. 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39;/ 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39;(밑줄 친 위치는 C2&#39;- O- 티오 페닐 메틸 변형의 도입을 나타낸다. )이 연구의 초점을 구성합니다. 이 서열은 RNA 가닥의 단일 가닥 또는 이들의 상응하는 이중 구조 (다른 2 차 구조는 열역학적으로 안정한 것으로 예측되지 않음)의 정량 및 측정을 가능하게하기 위해 선택되었다. CD는 구조 파라미터, 즉 이중 형성 및 열 변성 전이를 확립하는 데 사용되었습니다. 합성 이러한 올리고 뉴클레오타이드를 얻는 전반적인 절차는 그림 1 에 나와 있으며 단계별 프로세스를 따르고 있습니다 : 자동화 된 고체상 합성 → Depr→ 정제 → 정량 → 특성화. 그림 2 는이 절차에서 필요한 단량체 단위를 표시합니다. RNA의 고체상 합성 (도 2 좌측) 및 예 G, A 및 C에 친 핵성 엑소 사이 클릭 아민을위한 염기 - 불안정성 보호기의 사용이 포스 화학에 기초한다는 점에서 DNA의 것과 유사 아세틸, 벤조일, 페녹시 아세틸, t- 부틸 또는 N , N- 디메틸 포름 아미드 ( 도 2 , 오른쪽). C2&#39;-OH 그룹 (데 옥시 올리고 뉴클레오타이드 바이오 폴리머에서 결핍 됨)의 존재로 인해 RNA에서 고려해야 할 또 하나의 측면은이 친 핵성 위치의 보호 및 후속 탈 보호에 통합되어야하는 추가 단계이다. 이와 관련하여, 실리콘 기반의 보호 그룹은 biorthogonal moieties (특정tert- 부틸 디메틸 실릴 (TBDMS) 및 트리 이소 프로필 실릴 옥시 메틸 (TOM)기를 대중적인 선택 ( 도 2 , 좌측 하단)으로 사용하여 불소 존재 하에서 탈 보호시켰다. 이 작업에서 표준화 된 phosphoramidite 화학을 사용하는 DNA / RNA 합성기에서 자동 합성을 수행했습니다. 인스트루먼트의 제조업체 설정에는 DNA 용 인산염 버전을 사용하는 경우 자동 희석 단계가 포함되며 사용자가 설정 한 양으로 희석하는 옵션이 포함됩니다. 그러나, 우리는 RNA phosphoramidite의 중량을 측정하고 수동으로 희석하기로 결정했다. 1) 표준 RNA의 가격은 더 높다 (어떤 경우에는 50 배 이상 비싸다). 2) 개질 된 포스 포르 아미 다이 트는 종종 소량으로 얻어진다; 3) 자동화 된 희석 단계 (제조자에 의해 설정 됨)를 사용할 때 낭비되는 물질의 양이 많다. 또한, 1) 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체3 &#39;말단으로 기능하는 보호 된 핵 염기를 포함하는 핵산 ( 예 , CPG); 및 2) C2&#39;- O- 위치에서 TBDMS 그룹으로 보호 된 상업적 포스 포르 아미 다이 트 (표준 핵 염기). RNA 합성을 위해 조정 된 단계에 대한 자세한 설명과 설명과 함께 합성 단계의 자세한 목록이 그림 3 과 표 1 에 나와 있습니다. 또한, 그림 4 는 각각의 트리 트리 틸화 단계에서 방출 된 트리 튬 양이온을 정량화하는 &#39;Trityl Monitor&#39;옵션을 선택한 후 모든 단계에서 관찰되는 단계별 수율을 보여줍니다. 전형적으로, 우리의 경험에서, 제한 요인은 원하는 변형을 함유하는 포스 포르 아미 다이 트를 얻는 것이었다는 점은 주목할 가치가있다. 즉, 선택 사이트에서 수정 사항을 통합 할 수있는 합성 방법론을 개발하는 것입니다. 이 보고서에서 우리는우리가 상응하는 합성 방법론 인 C2&#39;- O- 티오 페닐 메틸기를 확립 한 변형 된 뉴클레오타이드의 혼입. 이 그룹은 크기가 작으며 어떤 방식 으로든 고상 합성에 영향을 미치지 않습니다. 이 그룹을 RNA의 올리고 뉴클레오타이드에 혼입시키는 것이 구조적 및 열역학적 파라미터 4 와 함께보고 되었기 때문에, 변형 된 포스 포르 아미 다이 트를 유도하는 유기 합성의 어떠한 측면도 본원에서 기술되지 않을 것이다. 탈 보호, 정제 및 특성화 외래 아민 및 β- 시아 노 에틸 기의 탈 보호는 CPG- 수지로부터의 절단과 동일한 단계에서 일어난다. 우리는 AMA의 수용액의 존재 하에서 얻어진 수지를 가열하고, 플루오 라이드 이온의 존재하에 C2&#39;- O- 실릴기를 절단하고,이어서 겔을 통해 정제하는 통상적으로 사용되는 조건을 적용 하였다전기 영동. 이들이 많은 경우에 표준 조건이되었지만, 염기성 조건이나 불소 이온에 불안정한 변형은 메탄올 / 탄산 칼륨 (MeOH / K 2 CO 3 ) 또는 부틸 아민과 같은 보다 온화한 조건 13 , 14 가 필요할 수 있습니다. 따라서, 대응하는 포스 포르 아미 다이 트상의 상이한 세트의 보호기가 필요하다. 또한, 우리는이 방법으로 이전의 경험과 다른 계기의 부족을 감안할 때 탈 보호 된 올리고머를 정제하는 데 바람직한 대안으로 전기 영동을 선택했습니다. 그러나 HPLC를 효과적인 방법으로 사용할 수도 있습니다 15 . 정제 된 올리고 뉴클레오티드의 특성 우리 그룹 (16)에 의해보고 된 절차를 사용하여, 질량 분석법, 비행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF)을 통하여 수행 하였다. 구조적 특성 분석 및<html> 얻어진 이중 가닥의 안정성은 CD 를 통해 수행되었다. 구체적으로, 우리는 CD를 이용하여, RNA의 변형 된 및 변형되지 않은 올리고 뉴클레오티드의 열 변성 전이를 결정하는데, 이는 ca에서 밴드의 타원율의 감소를 따른다. 270 nm, 그리고 210 nm에서 λ max 의 밴드 (음의 타원율)의 소멸. 하이브리드 화 전후의 스펙트럼 비교는 그들의 차이점을 설명하고 사용 된 방법론의 타당성을 입증하기 위해 제공됩니다. CD의 사용은 널리 핵산 구조적 모티프의 결정으로 인정하고 17 아미노산, 따라서 다양한 구조 및 열역학적 파라미터 (18)를 결정하는 도구로 이용 될 수있다; 그러나이 기술이 열 변성 전이를 평가하는 데 사용되는 예는 많지 않습니다. 일부 경우에는 G-quadruplexes를 포함하는 DNA에 대한 열 안정성 결정이 포함됩니다19 , 20 또는 RNA의 이중 가닥과 머리핀 21 . 이 보고서는 전문가가 아닌 독자 또는 시청자에게 이러한 유형의 조사를 원활하게 시작할 수있는 도구 세트를 제공 할 계획입니다. 이 흥미로운 과학 분야와 관련된 다른 연구소의 방법론 및 기술을 향상시키고 비교하는 데 도움이 될 것입니다. 이 보고서의 내용은 다양한 소스에서이 기술의 기존 프로토콜을 추가하고 각 단계에 대한 시각적 지원을 강화하고 경험을 촉진합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="778">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:445px;">AbsolveTM</td>
			<td style="width:152px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:117px;">6NE9711</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide, 99+%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>164850025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Fluoride&#160; 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argon-ultra high purity</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td>7440-37-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bis-acrylamide Ultra pure</td>
			<td>VWR-Amresco</td>
			<td>172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, anhydrous, histological grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-12-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol, 99.9%,&#160; HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methylamine 40% in water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>872-50-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&#160;</td>
			<td>MDS SCIEX</td>
			<td>1020157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#8217;,4&#8217; Triethylamine, 99+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>121-44-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>73602-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents for the RNA synthesis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;40-4140-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4110-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4120-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;30-3140-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4330-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-RNA-CPG</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3330-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-RNA-CPG&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3324-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3025-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3030-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-C-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3015-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bz-A-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3003-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

고상 합성은 핵산, 특히 DNA 또는 RNA의 정식 및 변형 중합체를 수득하는데 사용되어 다양한 분야의 응용 및 상이한 연구 목적을 위해 널리 사용되는 방법론이되었다. 본원에 기술 된 절차는 C2&#39;- O- 위치에 위치한 0 개, 1 개 또는 2 개의 변형을 함유하는 RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39;의 도데 카머의 합성, 정제 및 특성 규명에 초점을 둔다. 프로브는 2- 티오 페닐 메틸기를 기본으로하며, 표준 유기 합성법을 통해 RNA 뉴클레오타이드에 통합되고 각각의 포스 포르 아미 다이 트를 통해 상응하는 올리고 뉴클레오타이드로 도입된다. 이 보고서는 2&#39;- O- 아미노 말단에서 변형 된 2- 티오 페닐 메틸 작용 화 된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 4 개의 정준 핵산 염기 (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A))를 통한 포스 포르 아미 다이 트 화학 반응을 이용한다. 위치; 그러나이 방법론은 큰 var수년에 걸쳐 개발 된 수정 사항들. 올리고 뉴클레오타이드는 표준 조건, 즉 암모니아와 메틸 아민 (AMA)과 불화 수소 / 트리 에틸 아민 / N- 메틸 피 롤리 디논의 혼합물 하에서 수지로부터 분리하고 탈 보호 한 제어 된 구멍 유리 (CPG) 지지체상에서 합성 하였다. 상응하는 올리고 뉴클레오티드는 역상 크로마토 그래피 (9 월 박, C (18) 칼 럼)을 통해 용출 탈염하고, 분리 한 다음 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 (20 % 변성)를 통해 정제 하였다. 정량 및 구조 파라미터는 자외선 - 가시 광선 (UV-vis) 및 원 편광 이색 성 (CD) 광도 분석을 통해 각각 평가되었습니다. 이 보고서는이 분야에 착수하는 데 관심이있는 초보자 및 전문가를위한 자료 및 가이드 역할을하는 것을 목표로합니다. 새로운 기술과 방법론이 개발되면서 진행중인 작업으로 기대됩니다. 방법론과 기술에 대한 설명(phosphoramidite) 화학을 사용하는 DNA / RNA 신디사이저 (2013 년에 리퍼브되고 구매 됨)에 해당합니다.

C2&#39;- O- 위치에서 0, 1 또는 2 개의 2- 티오 페닐 메틸 변형을 함유하는 RNA 도데 카머의 합성은 상응하는 정제 및 특성화와 함께 기술된다. 또한 CD를 통해 수행 된 구조 분석에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. RNA의 4 가닥 (상보적인 서열을 갖는 가닥 포함)은 고상 합성을 통해 얻어졌으며,이어서 각 올리고 뉴클레오타이드의 정제율이 300 - 700 nmol이었다. 질량 분광법은 ~ 150 pmol의 각 시료를 탈염시킨 다음 MALDI-TOF 분석을 위해 플레이트에 침착시킴으로써 수행되었다 ( 그림 5 ). CD는 이중 구조의 형성을 확인하고 그에 상응하는 T의 m을 기록하는 동안 정량화 각 용액의 분석을 통해 자외선 photometrical 행했다. 단일 가닥 샘플 또는 이중 구조의 비교 여부에 관계없이 UV-vis 분광법을 통해 표준 및 변형 올리고 뉴클레오티드 사이에 명확한 차이는 관찰되지 않는다. 그러나 CD 스펙트럼을 측정 할 때 사소한 변화가 관찰됩니다 ( 그림 6 ). 또한, 세 개의 이중 구조 T m의 측정 가닥 중 하나의 2&#39;-O-티오 변형의 결합에 의해 유도되는 불안정화 나타내는 선수 고유 값을 표시. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig1.jpg" /> 그림 1 : RNA 가닥을 얻는 절차. CPG를 고체 지지체로 사용하고 5- 에틸 티오 테트라 졸을 활성화 제로 사용하는 고체상 순환 : ( i ) 디 트리 틸 레이션; ( ii ) 커플 링; ( iii ) 산화; ( iv ) 새 싸이클 (capping) 및 새로운 사이클에; 상응하는CPG 수지 상에지지되고 모든 보호기를 함유하는 딩 올리고 뉴클레오타이드 ( v ); 및 추가 분석을 위해 최종 RNA 올리고 뉴클레오티드를 얻기 위해 염기 및 불소 ( vi )의 존재하에 후속 탈 보호. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig2.jpg" /> 그림 2 : Phosphoramidites 및 보호 그룹의 구조. A, G 및 C의 외 환형 아민 상에 실릴기를 갖는 C2&#39;- O- 기 및 염기 불안정기를 함유하는 포스 포르 아미 다이 트의 화학 구조. 본 연구에서는 O- TBDMS 그룹을 사용 하였다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>이 그림의 n. <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig3.jpg" /> 그림 3 : 해당 Oligonucleotides의 단계별 합성. 사이클은 표시된대로 편집되었으며 사용 된 코드 및 유량의 키가 오른쪽에 표시됩니다. 단계별 합성은 제공된 소프트웨어에서 붙여 넣습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig4.jpg" /> 그림 4 : 개별 커플 링의 얻어진 수율 및 트래킹의 표현. 도시 된 예는 전형적인 올리고 뉴클레오타이드 합성을 표시하기 위해 보체의 합성으로부터 변형되었다입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig5.jpg" /> 그림 5 : Oligonucleotides의 MS (ON) 1-3. ON 1 - 3 의 MALDI-TOF (위에서 아래로). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig6.jpg" /> 그림 6 : 단일 및 이중 가닥 RNA의 CD 스펙트럼, 표준 및 수정. 제로 ( 1 , A), 하나 ( 2 , B), 또는 두 개의 샘플을 포함하는 CD 스펙트럼 <strong&gt; 3, C) 수정 전 (파란색) 및 후 (빨간색) 교잡. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/56189/56189table1.jpg" /> 표 1 : Phosphoramidite 솔루션 계산.

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Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

이 기사는 C2&#39;- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다.

2&#39;- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜<em&gt; O</em&gt; 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.8K 조회수.  University of Colorado Denver.  이 기사는 C2'- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다. 

비디오: Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

연구

화학

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

기능화의 합성 및 특성 금속 - 유기 프레임 워크

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

고상 수지 기반의 방법론을 통해 비대칭 페로센 유래 바이오 복합체 시스템 용 합성 방법론

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

루테늄의 시리즈의 합성, 특성 및 반응성<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; 박사</sup&gt; 단지

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

A Direct, Early Stage Guanidinylation Protocol for the Synthesis of Complex Aminoguanidine-containing Natural Products

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important structural element found in many complex natural products and pharmaceuticals. Owing to the continual discovery of new guanidine-containing natural products and designed small molecules, rapid and efficient guanidinylation methods are of keen interest to synthetic and medicinal organic chemists. Because the nucleophilicity and basicity of guanidines can affect subsequent chemical transformations, traditional, indirect guanidinylation is typically pursued. Indirect methods commonly employ multiple protection steps involving a latent amine precursor, such as an azide, phthalimide, or carbamate. By circumventing these circuitous methods and employing a direct guanidinylation reaction early in the synthetic sequence, it was possible to forge the linear terminal guanidine containing backbone of clavatadine A to realize a short and streamlined synthesis of this potent factor XIa inhibitor. In practice, guanidine hydrochloride is elaborated with a carefully constructed protecting array that is optimized to survive the synthetic steps to come. In the preparation of clavatadine A, direct guanidinylation of a commercially available diamine eliminated two unnecessary steps from its synthesis. Coupled with the wide variety of known guanidine protecting groups, direct guanidinylation evinces a succinct and efficient practicality inherent to methods that find a home in a synthetic chemist&#39;s toolbox.

Here, we present a protocol for direct, early stage guanidinylation that enables rapid total synthesis of aminoguanidine-containing small organic molecules. An advanced synthetic intermediate used in the synthesis of a blood coagulation factor XIa inhibitor was prepared using this protocol.

복잡한 아미노 구아니딘 함유 천연 제품의 합성에 대한 직접, 초기 단계 Guanidinylation 프로토콜

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

의 합성을위한 프로토콜<em&gt; 직교</em&gt; -trifluoromethoxylated 아닐린 파생 상품

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.