우리가 감사 멤버 Ugarova 실험실 및 센터에 수 사관의 대사와 혈관 생물학에 대 한이 작품의 유용한 토론 하고자 합니다. 제임스 파우스트 2015 년에서 유럽 분자 생물학 실험실 슈퍼 해상도 현미경 코스에서 강사에 게 그의 감사를 표현 하고자 합니다. LLSM에 대 한 샘플 준비에 대 한 Janelia에서 Satya 쿠 온 감사 하 길. 검토 하 고이 작품의 촬영 부분 동안 제임스 파우스트 T32 화목 (5T32DK007569-28)에 의해 지원 되었다. 이 작품의 격자 빛 시트 구성 요소는 HHMI 및 베티와 고 든 무어 재단에 의해 지원 되었다. T.U.는 NIH에 의해 투자 된 HL63199를 부여.

동물을 사용 하는 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 메이 요 클리닉, Janelia 연구 캠퍼스와 애리조나 주립 대학에 의해 승인 되었다.
1. 준비 산 청소 커버 유리
참고: 많은 제조 업체에서 구입 하는 커버 유리 예상 대로 깨끗 한 않을 수 있습니다. 현미경은 관여 하는 모든 프로시저 앞 커버 유리의 일괄 처리를 정기적으로 청소 하십시오.
<ol><li>높은 엄중 커버 유리를 구입. 정확한 두께 (0.15 또는 0.17 m m)을 선택 하려면 특별 한 주의 분리 했습니다. 참고: 커버 유리 두께의 선택은 현미경 목표에 따라 달라 집니다 그리고 객관적인 배럴에 나열 됩니다.</li>
	<li>커버 유리 쥡니다 (42 kHz, 70 W)와 1 시간에 대 한 환기가 화학 증기 두건에서 12 M 염 산에서 품 어. 신선한 12 M HCl와 함께 두 개의 추가 시간에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>초순 수로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>순수한 아세톤 쥡니다와 30 분에 대 한 환기가 화학 후드에 덮개 유리를 품 어. 두 개의 추가적인 시간 동안이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>불 임 초순 물으로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>100% 에틸 알코올 쥡니다와 30 분 동안 화학 후드에서에 덮개 유리를 품 어. 두번 추가이 단계를 반복 합니다. 참고: 에틸 알콜의 순수성이 중요 합니다. 녹은 고체의 형태로 오염 물질 유리에 건조 것입니다 고 대 식 세포 융합을 승진 시킬 수 있다.</li>
	<li>장기 저장에 대 한 순수한 에틸 알코올로 가득 컨테이너에 산 성 청소 커버 유리를 놓습니다. 또는 커버 유리 질소 가스와 진공 desiccator에서 건조.</li>
</ol>2. 품질-Fusogenic 광학 표면 준비
<ol><li>DMSO 무료 분해 초순 톨루엔에 포인트 파라핀 왁 스 높은 녹는. 참고: 주식 농도가 10 mg/mL에서 있으며 희석된 1:9 1 mg/mL 작업 솔루션으로 만들기 위해 초순 톨루엔에. 주의: 톨루엔 처리 되어야 합니다 주의 기형 발생 물질으로. 기관 화학 위생 계획에 따라 톨루엔의 처분.</li>
	<li>파라핀 솔루션 건조 산 청소 커버 유리를 균일 하 게 유리 표면을 커버 하는 볼륨에 작업을 적용 합니다. 초과 솔루션을 가만히 따르다 하 고 건조 한 질소 가스 또는 공기 커버 유리. 대량 준비, Coplin jar 커버 유리를 수용 하도록 설계 된 사용 합니다.</li>
	<li>커버 유리 폴란드어 x 축에 3 타 차로 및 다음 보풀 지우기 y 축에 3 타 차로 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>실험을 실시 하기 전에 즉시 살 균 초순, 커버 유리를 세척 하 고 생물 안전 후드에 자외선 빛으로 15-30 분 후 소독. 또는, 에틸렌 산화물 또는 감마 방사선 조사에 의해 커버 유리를 소독.</li>
</ol>3. Micropatterning 탄화수소 포함 된 화합물 융합 제한 미리 지역
<ol><li>건조 한 산 청소 덮개 유리 및 유리는 평평한 표면에 고정.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 신중 하 게 골드 전송 전자 현미경 검사 법 파인더 그리드 탄화수소 compound(s)의 작업 솔루션에 젖어. 실험의 최종 목표를 충족 하는 탄화수소 화합물을 선택 하십시오 ( 표 1참조). 부드럽게 필터 종이에 그리드를 활용 하 여 멀리 초과 솔루션을 심지 하 고 즉시 덮개 유리의 센터에 눈금을 배치. 다음 단계로 진행 하기 전에 2 분 동안 건조 톨루엔을 허용 합니다.</li>
	<li>그리드는 조심 스럽게 거꾸로 유리 유리에 보 세 다는 것을 확인 하십시오. 경우에 그리드 분리 3.2 새로운 커버 유리를 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 참고: 플라즈마 클리너를 사용할 수 없는 경우 3.4 단계를 생략 합니다.</li>
	<li>플라즈마는 진공 가스 플라즈마 처리에 의해 커버 유리를 청소. 참고: finder 그리드는 플라즈마에서 긴 사슬 탄화수소 흡착 내부 표면을 보호 하는 마스크 역할을 합니다. 그리드에 의해 보호 지역 플라즈마에 노출에 의해 비 fusogenic 렌더링 됩니다. 커버 유리는 플라즈마에 노출 시간 실험적으로 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 파인 팁 집게를 사용 하는 micropattern를 노출 유리 표면에서 그리드를 제거.</li>
</ol>4. 조작 유리 하단 요리
<ol><li>35 m m 플라스틱 단계 드릴 비트를 사용 하 여 배양 접시의 바닥에 6 ~ 10 mm 원형 구멍을 드릴 합니다. 참고: 단계 드릴 비트를 사용 하 여 부드러운 가장자리를 만들려고 하는. 가장자리 너무 거친 경우에, 커버 유리 접시의 바닥에 평평 본드 하지 것입니다. 불완전 하 게 평면 어려워질 현미경 검사 법.</li>
	<li>신중 하 게 혼합 하 고 (즉,입니다; 제조업체의 지침에 따라 실리콘 엘라 스토 머를 드 PDMS)입니다.</li>
	<li>탄성 중합체의 가장자리에 그냥 proximate의 얇은 코팅을 적용 (즉, 세포핵) 구멍. 참고:는 탄성 연속 이라도 얇은 밴드 구멍 주변으로 나타납니다.</li>
	<li>부드럽게 적용 fusogenic 커버 유리 (섹션 2 참조), 또는 (섹션 1에서에서 설명한) 건조 산 청소 커버 유리 접시에 탄성에 의해 포위 하는 구멍을 커버 하기 위해. 커버 유리 접시의 바닥에 플러시 나타납니다 확인 하는 유리의 상당한 부분 플라스틱 접촉 구멍의 지름을 확장. 2-3 h 50 ° C에서 굽기 여는 탄성 중합체를 치료.</li>
	<li>Fusogenic 유리 선호 하는 경우, UV 소독 표준 프로토콜에 따라 요리와 문화 셀. 그러나, 선호는 micropattern 이면 micropattern 준비에 대 한 3.2 단계로 진행 (micropatterning 사용 가스 플라즈마 접시 sterilizes을 강하게 PDMS 유리).</li>
</ol>5. Thioglycollate elicited 세포 수집
<ol><li>앞에서 설명한3,,468 주 오래 된 C57BL/6 쥐 4% 맥주의 thioglycollate의 살 균 솔루션의 0.5 mL를 주사.</li>
	<li>72 시간 후, 승인 된 동물 보호에 따라 동물을 안락사 지침, 고 차가운 인산 염 버퍼 염 분 보충 5 m m ethylenediaminetetraacetate와 복 막 게 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>3 분 x 300g에 대 식 세포를 원심 및 resuspend DMEM:F12 15 mM HEPES, 보충의 1 mL에 10 %FBS, 및 1% 항생제 (배양). 참고: 셀 이후에 Neubauer hemocytometer 함께 계산 됩니다. 대 식 세포는 적절 한 농도를 희석 하 고 표면에 적용. 실험적인 질문을 위해 수 사관에 의해 주어진된 표면에 적용 하는 셀의 수를 신중 하 게 고려 되어야 한다. 기본 문학에서 알려진된 표준을 참조 하십시오.</li>
	<li>30 분 후 HBSS 보충 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 문화 매체와 대체 0.1 %BSA 표면 세척. 문화 인큐베이터 (5% CO2 공기 37 ° C에서)를 반환 합니다.</li>
	<li>2 시간 후, 매체를 발음 하 고 배양 10 ng/mL IL-4의 보충으로 바꿉니다. 4설명 되어 있는 대로 셀을 이미지.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+induces+foreign+body+giant+cells+from+human+monocytes/macrophages.+Differential+lymphokine+regulation+of+macrophage+fusion+leads+to+morphological+variants+of+multinucleated+giant+cells.">Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells.</a> Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).</li><li>Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mediators+of+macrophage+fusion.">Molecular mediators of macrophage fusion.</a> Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).</li><li>Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Integrins+&#945;+M+&#946;+2+(Mac-1,+CD11b/CD18)+and+&#945;+D+&#946;+2+(CD11d/CD18)+in+Macrophage+Fusion.">The Role of Integrins &#945; M &#946; 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and &#945; D &#946; 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion.</a> Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).</li><li>Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fusogenic+glass+surfaces+that+impart+spatiotemporal+control+over+macrophage+fusion:+Direct+visualization+of+multinucleated+giant+cell+formation.">Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation.</a> Biomaterials. 128, 160-171 (2017).</li><li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkylsilane-modified+surfaces:+Inhibition+of+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation.">Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation.</a> J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).</li><li>Vignery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+fuse+macrophages+in+vitro.">Methods to fuse macrophages in vitro.</a> Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign-body+giant+cells+and+polyurethane+biostability:+In+vivo+correlation+of+cell+adhesion+and+surface+cracking.">Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking.</a> J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).</li><li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+reaction+to+biomaterials.">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li><li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surface-coupled+polyethylene+oxide+on+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+in+vitro.">Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).</li><li>DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+and+surface+chemistry+control+of+monocyte/macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+by+photochemically+micropatterned+surfaces.">Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces.</a> J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).</li><li>Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte/macrophage+adhesion,+macrophage+motility,+and+IL-4-induced+foreign+body+giant+cell+formation+on+silane-modified+surfaces+in+vitro.">Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+method+for+molecular+optical+imaging.">Proposed method for molecular optical imaging.</a> Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM,+iPALM,+and+correlative+iPALM-EM.">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Planchon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+three-dimensional+isotropic+imaging+of+living+cells+using+Bessel+beam+plane+illumination.">Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination.</a> Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

확인 하 고 이후에 대 식 세포 융합을 촉진 하는 품질 광학 유리 표면 개발 필요 사실 더 최근에 출판 된 연구 직접까지 생활의 맥락에서 대 식 세포 융합을 시각에서 비롯 된 표본3, 4. 일반적으로 사용 되는 fusogenic 플라스틱 표면 LWD 목표 요구 되며 단계 대조 광학으로 제한는 사실 때문입니다. 이 방 벽 뿐만 아니라 대 식 세포 융합의 특별 한 요금을 추진 하지만 MGCs의 형성 공간 제어의 놀라운 학위를이 수 한 품질 광학 유리 표면 공학에 의해 극복 되었다.
이 기술은 대 식 세포 융합을 모니터링 고급 이미징 기술 사용할 수 있습니다, 있지만 제한 없이 오지 않는다. 긴 사슬 탄화수소 (예를들면, oleamide, 파라핀 왁 스, 등)와 흡착 광택된 표면 fusogenic 플라스틱 표면에 비해 대 식 세포 융합의 특별 한 요금을 생산, 퓨전 남아 있다 공간 확률 프로세스 (그림 2)입니다. 이 제한에는 퓨전 발생 합니다 예측할 수 없습니다 이후 생활 견본으로 퓨전을 시각화 하 고 배율 목표를 사용 하 여를 걸로 하겠습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 우리 micropatterned 파라핀을 정해진된 영역 (그림 4; 융합 과정을 제한 하려면 추가 비디오 1)입니다. 공간적으로 micropattern 대 식 세포 융합을 confining 우리 예측 퓨전 것 발생 하 고 따라서 활용이 높은 애니메이션 이벤트를 공부를 더 높은 확대 목표를 활성화.
대 식 세포 융합의 공간 제어를 부여 하는 광학 품질 표면을 사용 하 여의 의미는 무엇입니까? 첫째, 이러한 표면 융해의 높은 속도, 홍보 때문 살아있는 표본 합리적인 시간 내에서 퓨전 모니터링 하 가능 하다. 이것은 빛에 세포의 노출 증가 photobleaching과 phototoxicity에 이르게 때문에 형광 현미경 검사 법의 경우 필수입니다. 둘째, 이러한 표면 활성화 고급 이미징 기술을 형광 또는 고용 되 양극 화에 따라 (그림 4. 표 1. 추가 비디오 1; 추가 비디오 2)입니다. 마지막으로,이 프로토콜에서 설명 하는 micropatterned 표면에 의해 여유 spatiotemporal 제어 연구 대 식 세포 융합을 제어 하는 세포 및 subcellular 메커니즘을 식별 하도록 설계 되었습니다 신속 하 게 한다.

MGCs의 대형 다양을 한 만성 염증1고유 인체에 병 적인 상태를 동반 한다. 계약 형태 MGCs2mononucleated 세포 융합에 불구 하 고 의외로 몇 연구 퓨전 생활 맥락에서 표본3,4. 이 때문에 대부분의 이미징 기법에 필요한 깨끗 한 유리 표면 염증 성 cytokines5에 의해 유도 된 때 대 식 세포 융합을 촉진 하지 않습니다. 실제로, 깨끗 한 유리 사용 하는 경우는 기질으로 대 식 세포 융합, 다음에 대 한 중간 확대 목표 (즉, 10-20 X) 하의 연속 이상 15 h 낮은 이미징 종종 필요 단일 퓨전 이벤트를 관찰 합니다.
다른 손, fusogenic 플라스틱 표면 (예를 들어, permanox) 또는 세균 학년 플라스틱에 퓨전2홍보. 그러나, 플라스틱을 통해 영상 이므로 문제가 기판 두께 이며 빛을 없앤다. 이 긴 작업 거리 (LWD) 목표는 필요한 이후 이미징 복잡. 그러나, LWD 목표는 일반적으로 낮은 조명 coverslip 수정 그들의 대응에 비해 용량 수집 있다. 또한, 미분 간섭 명암 등 견본을 통과 하는 빛의 극성에 변화를 악용 하는 기법 없습니다 가능한 플라스틱 birefringent 이므로. 플라스틱의 사용과 관련 된 장벽은 대 식 세포 융합/MGC 형성 표면에 발생 합니다 예측할 수는 없습니다는 사실에 의해 더 강조 된다. 함께, 이러한 제한 제한 단계 대조 광학, 총 이미징 기간 연장에 대 식 세포 융합의 시각화 (> 15 연속 시간), 그리고 낮은 해상도.
우리는 최근 고정 세포/MGCs4단일 분자 슈퍼 해상도 현미경을 수행 하는 동안 매우 fusogenic 유리 표면을 식별. 이 관찰 했다 유리 청소 때문에 외 표면 촉진의 매우 낮은 속도로 퓨전 ~ 5% 후 인터 루 킨-4 (IL-4) 융해에 의해 결정 된 대로 존재 24 h 색인4. 우리는 발견 퓨전 홍보 용량 oleamide 오염 때문. Oleamide 또는 유사 하 게 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 다른 화합물의 흡착 유리 fusogenic를 했다. 대부분 fusogenic 화합물 (파라핀 왁 스) micropatterned, 고 대 식 세포 융합 및 융합 이벤트는 같은 시간 내에 permanox에 비해 관찰 수에 2-fold 증가 spatiotemporal 제어의 높은 학위를이 수 있습니다. 이러한 광학 품질 서피스 형태 기능 및 생활 표본에서 MGCs의 형성을 제어 하는 활동으로 첫 번째 엿볼 제공.
이 프로토콜에 우리 살아있는 표본에서 MGCs의 형성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 유리 표면의 다양 한의 제작을 설명 합니다. 또한, 우리는 이러한 서피스는 의무가 멀리 필드 슈퍼 해상도 기법을 보여줍니다. 표면 제작, 실험의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 각 표면 진행 텍스트에 관련 된 예제와 함께 설명.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:240px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:129px;">PCD-32G</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Finder grid</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>G400F1-Au</td>
			<td>any gold TEM grid will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass (22x22 mm)</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>use only high stringency cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin wax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petrolatum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16415</td>
			<td>must be &#945;-tocopherol-free if substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oleamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O2136</td>
			<td>prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15050</td>
			<td>use low dissolved solids ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>use to acid wash cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slyguard 184</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>102092-312</td>
			<td>mix in a 1:10 ratio and cure at 50 &#176;C for 4 h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm petri dish</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-351864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont no. 5 forceps</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>72705</td>
			<td>ideal for removing TEM grid in section 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM:F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092</td>
			<td>contains 15 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strept</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576</td>
			<td>use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Z02996</td>
			<td>aliquot at 10 &#956;g/mL and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eGFP-LifeAct mice</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>use for live fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Kimberly Clark&#160;</td>
			<td>34155</td>
			<td>use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating optical-quality glass surfaces to study macrophage fusion

Multinucleated 거 대 한 세포 (MGCs)의 형성을 시각화 하는 살아있는 표본에서 가장 라이브 이미징 기술이 필요로 유리를 통해, 빛의 전파 이지만 유리에 대 식 세포 융합 드문 이벤트는 사실 때문 도전 하고있다. 이 프로토콜 제공 여러 품질 광학 유리 표면의 제조 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착 fusogenic 표면으로 유리를 변환 합니다. 첫째, 표면 개 질에 대 한 자료를 시작으로 깨끗 한 유리 표면 준비 설명 되어 있습니다. 둘째, fusogenic 기판에 변환 비 fusogenic 유리 하 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 셋째,이 프로토콜 spatiotemporal 제어할 MGC 형성의 높은 학위를 홍보 하는 표면 micropatterns의 제작을 설명 합니다. 마지막으로, 유리 하단 요리 조작 설명 되어 있습니다. 시스템의 사용이 체 외에서 세포 대 식 세포 융합, MGC 형성 연구 모델의 예로 표시 됩니다.

재료의 물리 화학 매개 변수 macrophage 퓨전7,8,,910의 범위에 극적인 영향을 미칠. 또한, 표면 오염 물질 macrophage 퓨전11홍보 알려져 있습니다. 그러므로, 대 식 세포 융합에 대 한 부정적인 제어로 중요 한 시작으로 깨끗 한 커버 유리 하다. 청소 프로토콜 1에에서 설명 된 대로 때는 커버 유리는 매우 명백한 표면 기능, 평면으로 반면 표면 연마 뒤 긴 사슬 탄화수소의 흡착 nanotopography (그림 1)의 정도 만듭니다.
깨끗 한 커버 유리 표면에 세포는 매우 낮은 비율 (그림 2) 퓨즈. 반면, IL-4의 24 시간, 후 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물과 흡착 표면에 적용 하는 세포는 강력한 융합을 (그림 2)을 받 다. 또한, (예를 들어, 톨루엔, 소 프로 파 놀) 용 매 혼자의 흡착 확인 하지 않는 유리 fusogenic 표면 (그림 2).
10 nm 층 흡착된 탄화수소의 해상도 극적으로 영향을 가능성이 크다, 양적 해상도 다양 한 표면 사이 잠재적인 차이 평가 하는 것이 중요 했다 그럼에도 불구 하 고. 해상도 일반적으로 레일리 기준에 의해 정의 됩니다. 해결을 자주 사용 되는 다른 통계는 전체 폭 빛의 회절 한계 보다 작은 구조의 절반 최대 (FWHM). 중요 한 것은, 거기는 형광 이미징에 필요한 유리의 특성 충분히 보존 되었다 제안 (그림 3A), 다양 한 표면 사이에서 100 nm 형광 구슬의 FWHM에 명백한 차이가 없습니다. 또한, 우리는 사라져 필드를 생성 하 여 긴 사슬 탄화수소 (그림 3B)를 포함 하는 표면에 적용 하는 세포의 3D 직접 확률적 광학 재건 현미경을 수행 수 있었다. 라이브 영상 기법의 다양 한은 대 식 세포 표면 (그림 4, 보조 비디오 1, 비디오 2 보충)에 적용 될 때 가능.
각 표면의 장점은 표 1에 설명 되어 있습니다. Note 이후 그들은 두꺼운, autofluorescence 정도의 높은 나 기름 침수 목표를 필요로 하는 고급 이미징 기술의 대부분 대부분 fusogenic 플라스틱 표면 호환 되지 않습니다. 긴 사슬 탄화수소 흡착 표면 활성화 이미징 기술12 팜/dSTORM/GSDIM13,,1415,16, 등의 많은 수는 주목 해야 한다 17, DIC, 그리고 다른18,19,,2021 (표 1). 또한, 이미징 기술 가능 (표 1)의 많은 수 뿐만 아니라는 micropattern의 사용 수 있습니다 높은 정도의 spatiotemporal 제어할 MGC 형성 (그림 4B; 추가 비디오 1)입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig1.jpg"> 그림 1 : 파라핀 흡착 표면 나노 표면 지형 정도 있다. AFM 스캔 (5 x 5 µ m)의 유리 표면 파라핀 흡착 표면 소재 표면 장식의 배열을 포함 하는 반면 아무 명백한 지형 기능을 표시 합니다. 각 현미경 사진 오른쪽에 강도 규모는 z 축 따라 높이 보여줍니다. 눈금 막대는 500 nm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig2.jpg"> 그림 2 : 긴 사슬 탄화수소 흡착 표면 커버 유리에 대 식 세포 융합 촉진. (A) IL-4의 부재, 거의 multinucleated 셀 라이트의 얼룩에 의해 결정 되는 깨끗 한 유리 표면에 있는 것 같다. (B) 후 24 h IL-4, 긴 체인을 solubilize 하는 데 사용 하는 용 매와 흡착 표면 존재 탄화수소 (예를들면, 톨루엔 또는 소 프로 파 놀) 몇 multinucleated 세포가. (C-E) 반면, 긴 사슬 탄화수소 흡착 표면 융해 및 MGC 형성 촉진. IL-4의 가장 높은 학위에 파라핀 흡착 결과 융합을 유도 한다. MGCs 블랙에 설명 되어 있습니다. (F) permanox 플라스틱에 MGC 형성의 정도 비교를 위해 표시 됩니다. 각 이미지에 밝은 파란색 핵을 표시 하 고 세포질 보라색 나타납니다. 스케일 바는 100 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig3.jpg"> 그림 3 : 긴 사슬 탄화수소 흡착 표면 극적으로 영향을 주지 않습니다 해결. (A) 100 nm 형광 구슬 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 조명과의 비교. 상단 왼쪽된 패널에서 삽입 된 확대 보기 단일 형광 구슬입니다. 레드 라인 FWHM 계산 하는 데 사용 되는 예제 라인 프로 파일 표시 하기 첨가 했다. 100 nm 구슬의 FWHM에 명백한 차이가 관찰 되었다. 눈금 막대는 5 µ m. (B) 맥 1 integrin TIRF와 3D 직접 확률적 광학 재건 현미경 평가의 분포의 비교. 대 식 세포를 포함 하는 oleamide 표면에 적용 되었고 24 h에 대 한 IL-4 알을 품. B에서 화이트 인세트 후속 현미경에 몇 군데 지역을 강조 한다. 스케일 바는 TIRF 이미지 5 µ m와 3d 폭풍 2 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig4.jpg"> 그림 4 : 긴 사슬 탄화수소 흡착 표면 활성화 대 식 세포 융합 및 확산의 조회 시간 해결. (A)는 다이어그램 표시 절차는 micropattern를 생성 하는 데 사용 합니다. (B) Micropatterned 표면 얻으며 대 식 세포 융합의 spatiotemporal 제어. IL-4의 신청 후 몇 시간 대 식 세포 단계 대조와 몇 군데 있었다. micropattern에 격자의 내부에서 세포의 마이그레이션 note 융해는 micropattern에만 관찰 되었다. 흰색 대시는 MGC의 확장을 설명합니다. 시간이는 h:mm: ss로 각 현미경 사진의 상단 왼쪽된 모서리에 표시 됩니다. 눈금 막대는 50 µ m. (C) 격자 빛 시트 현미경20 밝혀 높은 spatiotemporal 역학 파라핀 흡착 표면에 확산 하는 대 식 세포의. 색상 강도 분포를 인코딩합니다 (노란색 가장 강렬)의 eGFP-LifeAct. 시간 mm:ss.로 각 현미경 사진의 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>표면:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>기술</td>
			<td>파라핀</td>
			<td>Oleamide</td>
			<td>바 셀 린</td>
			<td>MP 파라핀</td>
			<td>Permanox</td>
			<td>깨끗 한 유리</td>
		</tr>
<tr>
<td>단계 대조</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>명시</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>DIC</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
			<td>x</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>epifluorescence</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>공초점</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>TIRF</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>팜/dSTORM/GSDIM</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>SIM</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
		</tr>
<tr>
<td>호텔 위치</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>LLSM</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>퓨전 인덱스</td>
			<td>중간</td>
			<td>중간</td>
			<td>중간</td>
			<td>높은</td>
			<td>중간</td>
			<td>낮은</td>
		</tr>
<tr>
<td>퓨전 위치</td>
			<td>무작위</td>
			<td>무작위</td>
			<td>무작위</td>
			<td>정의</td>
			<td>무작위</td>
			<td>무작위</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">MP-micropattern</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">DIC-미분 간섭 명암</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">TIRF-총 내부 반사 형광</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">팜-photoactivated 지역화 현미경 검사 법</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">dSTORM-직접 확률적 광학 재건 현미경 검사 법</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">GSDIM-바닥 상태 고갈 개별 분자 다음 반환</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">SIM-구조적된 조명</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">호텔 위치-자극된 방출 소모</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">LLSM-격자 빛 시트 현미경 검사 법</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">√-호환</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">x-호환 되지 않는</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">√ *-LWD, 낮은 확대, 또는 침수 목표 에서만 가능</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">N/T-테스트 하지</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 각 표면의 용도. 플라스틱 표면 대부분 이미징 기술의 사용을 배제 note.
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56866/56866mov1.jpg"> 보충 비디오 1: MGC 형성의 시간 해결 단계 대조 보기. MGC 형성의 명백한 동시성 note 시간이는 h:mm: ss로 왼쪽된 상단에 표시 됩니다. 눈금 막대는 50 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/Supplemental_Video1.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56866/56866mov2.jpg"> 보충 비디오 2: 격자 빛 시트 현미경 20 thioglycollate elicited eGFP-LifeAct 대 식 세포는 파라핀 흡착된 표면에 확산의. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/Supplemental_Video2.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion at JoVE.com

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

이 프로토콜에 설명 합니다 품질 광학 유리 표면 흡착 고정 표본 슈퍼 해상도 현미경을 가능 하 게 살아있는 표본의 대 식 세포 융합을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물으로 제조를 .

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

fabricating-optical-quality-glass-surfaces-to-study-macrophage-fusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.2K 조회수.  Mayo Clinic. 이 프로토콜에 설명 합니다 품질 광학 유리 표면 흡착 고정 표본 슈퍼 해상도 현미경을 가능 하 게 살아있는 표본의 대 식 세포 융합을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물으로 제조를 .

비디오: Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

집중 Waterborne 바이러스와 농업 Zoonotic 병원균에 대한 유리 양모 필터

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

연구

면역학 및 감염병학

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

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