私たちはこの仕事の役に立つ議論のための代謝と血管生物学 Ugarova 研究所、センターの研究者のメンバーに感謝したいと思います。ジェームズ ・ ファウストは、2015 年に欧州分子生物学研究所超解像顕微鏡法コースでインストラクターに感謝の意を表現する願っています。Janelia で LLSM のサンプル準備のヘルプについてサティヤ Khuon に感謝したいです。レビューとこの作品の撮影の部分の間にジェームズ ・ ファウストは T32 フェローシップ (5T32DK007569-28) によって支えられました。この作品の格子光シート コンポーネントは HHMI およびベティとゴードン ・ ムーア財団によって支えられました。顧問は、NIH によって資金を供給 HL63199 を付与します。

動物を利用する手順は、動物愛護とメイヨー クリニックと Janelia リサーチ キャンパス、アリゾナ州立大学で使用委員会によって承認されました。
1. カバーのガラスを酸洗浄の準備
注: 多くのメーカーから購入したカバーガラスは、どおりきれいできない場合があります。顕微鏡が関与している任意のプロシージャの前にカバー ガラスのバッチを日常的に清掃をご検討ください。
<ol><li>高い金詰りカバーガラスを購入します。正しい厚さ (0.15 または 0.17 mm) を選択する特別な注意を取る。 注: カバー ガラス厚の選択は対物レンズに依存して、客観的バレルに直接表示されます。</li>
	<li>超音波 (42 kHz、70 W) で 1 時間の換気の化学発煙のフード 12 M 塩酸でカバーガラスを孵化させなさい。新鮮な 12 M HCl と追加で 2 回のこの手順を繰り返します。</li>
	<li>純水を別のビーカーを記入し、カバーガラスを追加します。換気化学フードで 5-10 分間カバー ガラスを超音波照射します。この手順を 10 回繰り返します。</li>
	<li>超音波処理で 30 分間換気化学フードで純粋なアセトンでカバーガラスを孵化させなさい。追加で 2 回のこの手順を繰り返します。</li>
	<li>滅菌超純水と別のビーカーを記入し、カバーガラスを追加します。換気化学フードで 5-10 分間カバー ガラスを超音波照射します。この手順を 10 回繰り返します。</li>
	<li>超音波処理と 30 分のための化学フード 100% エチルアルコールでカバーガラスを孵化させなさい。追加で 2 回この手順を繰り返します。 メモ: ethyl アルコールの純度が重要です。溶存固形物の形で汚染物質はガラスの上は乾燥され、マクロファージの融合を促進することができます。</li>
	<li>長期保存のため純粋なアルコールを入れた容器に酸洗浄カバー ガラスを配置します。また、窒素ガスと真空デシケータ内ストア カバーガラスを乾燥させます。</li>
</ol>2. 融合性光学的品質面の準備
<ol><li>無料の DMSO 溶解超純水トルエン高融点点パラフィン ワックス。 注: ストック濃度 10 mg/mL でなされ、希薄化後の 1:9 は超純水トルエン 1 mg/mL に作業ソリューションを作成します。 注意: トルエンは催奇形物質として注意して処理する必要があります。機関の化学衛生学の計画によるとトルエンの処分します。</li>
	<li>ガラス表面を均等にカバーするボリュームで乾燥酸洗浄カバー ガラスへの解決策を働いてパラフィンを適用します。余分なソリューションを捨て、窒素ガスまたは空気でカバーガラスを乾燥します。一括準備 Coplin jar カバーガラスを収容するように設計を使用します。</li>
	<li>X 軸の 3 本のストローク、糸くずのワイプで y 軸の 3 本のストローク次カバー ガラスを磨く (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>直前に実験を行い, 無菌純水とカバーガラスを洗浄し、その後紫外光生物学的安全フードで 15-30 分間殺菌します。また、エチレン酸化物またはガンマ照射によるカバー ガラスを滅菌します。</li>
</ol>3. 微細炭化水素を含む化合物に融合を限定する所定の地域
<ol><li>酸洗浄カバーガラスを乾燥し、平らな面にガラスを固定します。</li>
	<li>炭化水素化合の実用的なソリューションで金伝達電子顕微鏡のファインダー グリッドを浸す鉗子を使用して、慎重に。実験の目的に合った炭化水素化合物を選択 (表 1参照)。ろ紙上のグリッドをやさしくタッピングによって離れて余分なソリューションを芯し、カバー ・ ガラスの中心にグリッドをすぐに置き。次のステップに進む前に 2 分間乾燥するトルエンを許可します。</li>
	<li>グリッドはガラスを軽く反転によってガラスに接着されていることを確認します。グリッドは、3.2 の新しいカバーのガラスを使用して、手順を繰り返しますをデタッチします。 場合、 注: プラズマ クリーナーを使用できない場合は、ステップ 3.4 を省略します。</li>
	<li>プラズマ真空プラズマ処理によるカバー ガラスのクリーニングします。 注: ファインダーのグリッドは、プラズマから長鎖炭化水素を吸着した基になる表面を保護するためのマスクとして機能します。グリッドによって保護されていない領域は、プラズマへの露出によって非融合性がレンダリングされます。カバーガラスは、プラズマに公開時間の量は、経験的に決定する必要があります。</li>
	<li>ファイン ・ チップ鉗子を使用して、慎重に、微細パターンを公開するガラス面からグリッドを取り外します。</li>
</ol>4. 加工ガラス底培養皿
<ol><li>35 mm プラスチック シャーレ ステップ ドリルを使用しての下で 6-10 mm の孔をドリルします。 注: ステップ ドリル ビットを使用して、滑らかなエッジを作成する重要です。エッジは、あまりにもラフ、カバーガラスが平らな皿の底に接合しないでしょう。不完全平らな表面は顕微鏡を困難にさせます。</li>
	<li>慎重に混合し、ドガの (すなわちポリジメチルシロキサンの製造元の指示に従ってシリコーン ・ エラストマーPDMS)。</li>
	<li>エラストマーの端にだけ近接の薄いコーティングを適用 (すなわち、外接) 穴。 注: エラストマーは、ホールの周り連続とはいえ薄いバンドとして表示されます。</li>
	<li>エラストマーに囲まれた穴をカバーするために料理に融合ペプチド カバーガラス (2 のセクションで説明します)、または (セクション 1 で説明した) 乾燥酸洗浄カバー ガラスを適用優しく。カバー ガラス皿の底と同じ高さに表示されます、ガラスのかなりの部分がプラスチックに接触して穴の直径を超えたことを確認します。2-3 h の 50 ° C で焼成してエラストマーを硬化します。</li>
	<li>融合性ガラスを優先する場合、殺菌は標準のプロトコルによると料理と文化の細胞。微細パターンをお勧め、しかし、微細パターン準備のため 3.2 手順に進みます (マイクロパターニング中に使用されるガス プラズマ殺菌皿と強くガラスに PDMS をカップル)。</li>
</ol>5. 収集 Thioglycollate 誘発マクロファージ
<ol><li>前述3,4,64% ビール thioglycollate の滅菌溶液 0.5 mL を 8 週齢の c57bl/6 マウスを注入します。</li>
	<li>七十から二時間後、承認された動物のケアによると動物を安楽死させると、ガイドラインに従うし、冷えたリン酸緩衝生理食塩水を 5 mM エチレンジアミン四酢酸を添加した腹膜灌流によるマクロファージを収集します。</li>
	<li>3 分間 300 x g でマクロファージを遠心し、15 ミリメートル、HEPES を添加した DMEM:F12 の 1 mL で再懸濁します 10 %fbs、および 1% の抗生物質 (培養液)。 注: セルをその後ノイバウアー検定と数えます。マクロファージは適切な濃度に希釈して、サーフェスに適用されます。所定の表面に適用するセルの数は、実験の質問の目的のための調査官によって注意深く検討されるべき。主要な文学で知られている規格を参照してください。</li>
	<li>30 分後に非付着性細胞を除去し、新鮮な培養液を交換する 0.1 %bsa を添加した HBSS で表面を洗います。文化をインキュベーター (37 ° C で空気 5% CO2 ) に戻ります。</li>
	<li>2 h 後、培地を吸引し、IL-4 の 10 ng/mL 添加培養液中に置き換えます。4他の所で説明したように細胞をイメージします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4+induces+foreign+body+giant+cells+from+human+monocytes/macrophages.+Differential+lymphokine+regulation+of+macrophage+fusion+leads+to+morphological+variants+of+multinucleated+giant+cells.">Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells.</a> Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).</li><li>Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mediators+of+macrophage+fusion.">Molecular mediators of macrophage fusion.</a> Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).</li><li>Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Integrins+&#945;+M+&#946;+2+(Mac-1,+CD11b/CD18)+and+&#945;+D+&#946;+2+(CD11d/CD18)+in+Macrophage+Fusion.">The Role of Integrins &#945; M &#946; 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and &#945; D &#946; 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion.</a> Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).</li><li>Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fusogenic+glass+surfaces+that+impart+spatiotemporal+control+over+macrophage+fusion:+Direct+visualization+of+multinucleated+giant+cell+formation.">Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation.</a> Biomaterials. 128, 160-171 (2017).</li><li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkylsilane-modified+surfaces:+Inhibition+of+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation.">Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation.</a> J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).</li><li>Vignery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+fuse+macrophages+in+vitro.">Methods to fuse macrophages in vitro.</a> Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign-body+giant+cells+and+polyurethane+biostability:+In+vivo+correlation+of+cell+adhesion+and+surface+cracking.">Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking.</a> J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).</li><li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+reaction+to+biomaterials.">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li><li>Jenney, C. R., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surface-coupled+polyethylene+oxide+on+human+macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+in+vitro.">Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).</li><li>DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+and+surface+chemistry+control+of+monocyte/macrophage+adhesion+and+foreign+body+giant+cell+formation+by+photochemically+micropatterned+surfaces.">Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces.</a> J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).</li><li>Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte/macrophage+adhesion,+macrophage+motility,+and+IL-4-induced+foreign+body+giant+cell+formation+on+silane-modified+surfaces+in+vitro.">Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro.</a> J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+method+for+molecular+optical+imaging.">Proposed method for molecular optical imaging.</a> Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM,+iPALM,+and+correlative+iPALM-EM.">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Planchon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+three-dimensional+isotropic+imaging+of+living+cells+using+Bessel+beam+plane+illumination.">Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination.</a> Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

識別し、その後、マクロファージの融合を促進するため、光学的品質のガラス表面を開発する必要が最近ない出版された調査直接まで生活のコンテキストでマクロファージの融合を可視化という事実から生じた試験片3、 4。これは、一般的に使用される融合性プラスチック表面 LWD 目標を必要し、する大部分の段階の対照の光学に制限されますが原因です。これらの障壁は、マクロファージの融合の特別なレートを推進だけでなく、意外な MGCs の形成空間制御を付与する光学的品質ガラス表面をエンジニア リングによって克服されました。
この技術は、マクロファージの融合を監視する高度なイメージング技術の使用を可能に制限なし付属していません。長鎖炭化水素(例えばオレアミド、パラフィン ワックス等)を吸着した研磨面は、マクロファージの融合融合性プラスチック表面と比較しての特別料金を生成する核融合残る空間確率プロセス (図 2)。この制限は、それは核融合が発生する個所を予測することが可能ではないので生きている標本との融合を視覚化する高倍率の目的の使用を排除します。この制限を克服するために当社所定の地域 (図 4の融合プロセスを制限するマイクロパターニングゲル パラフィン補足動画 1)。空間的拘束、微細パターンにマクロファージの融合融合が発生するだろう、そのためこの高いアニメーション イベントを研究する高倍率目標を利用を予測することができました。
マクロファージの融合の空間制御を与える光学的品質面を使用しての意義とは何ですか。まず、これらのサーフェスは、融合の率が高いを促進するので、適度な時間枠内の生きている標本からの融合を監視することが可能です。セルの光への露出増加が退色、光毒性につながるので、これは蛍光顕微鏡の場合必須です。第二に、これらの表面は、高度なイメージング技術蛍光または採用する分極に基づく (図 4を有効にします。表 1;補足動画 1補足動画 2)。最後に、このプロトコルで記述されているマイクロパターニングゲル表面によって与えられる時空間制御は、マクロファージの融合を支配する細胞および細胞内メカニズムを識別するために研究を促進しなければなりません。

MGCs の形成に伴う慢性炎症1識別人体病理学的状態の数。Mononucleated マクロファージ ヒューズ フォーム MGCs2に合意、にもかかわらず意外にも少数の研究は、生活の文脈の中融合を示している標本3,4。ほとんどイメージングに必要なきれいなガラス表面はマクロファージの融合による炎症性サイトカイン5時を促進しないためにです。確かに、きれいなガラスとして使用する場合、基板、マクロファージの融合中間倍率の目的 (すなわち10-20 X) 及び連続 15 時間以上低画像多くの場合単一の融合イベントを観察するに必要があります。
その他の手、融合性プラスチック表面 (例えばpermanox) または細菌学的グレードのプラスチックにフュージョン2を促進します。しかし、プラスチックを通してイメージングは、基板が厚いと光が飛び散るので問題です。これはイメージング長い作動距離 (LWD) 対物レンズが必要なので複雑になります。ただし、LWD 目標通常収集能力と比べて、coverslip 修正、低光があります。さらに、以来、プラスチックの複屈折、微分干渉コントラストなど試料を通過する光の極性の変化を利用する技術が可能。プラスチックの使用に伴う障壁をそれはマクロファージの融合/MGC 形成が表面に発生する個所を予測することが可能ではないという事実によってさらに強調しました。一緒に、これらの制限は、段階の対照の光学、合計イメージング期間を拡張するマクロファージの融合の可視化を制限する (> 15 連続時間)、および低解像度。
最近マクロファージ/MGCs4分子超解像顕微鏡観察を行いながら高い融合性のガラス表面がわかりました。この観測された意外なのできれいにガラス表面の非常に低いレートで融合を促進する 〜 インターロイキン 4 (IL-4) 融合によって決定される存在下で 24 時間後 5% インデックス4。融合を促進するために容量がオレアミドの汚染が原因だったことがわかった。オレアミドまたは同様に長鎖炭化水素に含まれているその他の化合物の吸着したガラス膜融合。ほとんど融合ペプチド化合物 (パラフィン ワックス) マイクロパターニングゲル、それはマクロファージの融合と permanox と比較して同じ時間内で観測された融合イベントの数の 2 倍増加を時空間制御の高度を与えられます。これらの光学的品質の表面は形態学的特徴と生きている標本の MGCs 形成カイネティクスに最初の一見を提供しました。
このプロトコルの様々 な MGCs の生きている標本からの形成を監視するために使用できるガラス表面の作製について述べる。さらに、これらのサーフェスが遠方の超解像技術に従う義務があることを示します。表面加工は、実験の目的に依存して、各サーフェスは、進むテキストの関連の例で説明。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:240px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:129px;">PCD-32G</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Finder grid</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>G400F1-Au</td>
			<td>any gold TEM grid will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass (22x22 mm)</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>CG15CH</td>
			<td>use only high stringency cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraffin wax</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petrolatum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16415</td>
			<td>must be &#945;-tocopherol-free if substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oleamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O2136</td>
			<td>prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15050</td>
			<td>use low dissolved solids ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144C-212</td>
			<td>use to acid wash cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slyguard 184</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>102092-312</td>
			<td>mix in a 1:10 ratio and cure at 50 &#176;C for 4 h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm petri dish</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-351864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont no. 5 forceps</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>72705</td>
			<td>ideal for removing TEM grid in section 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM:F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-092</td>
			<td>contains 15 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strept</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9576</td>
			<td>use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Z02996</td>
			<td>aliquot at 10 &#956;g/mL and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eGFP-LifeAct mice</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>use for live fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Kimberly Clark&#160;</td>
			<td>34155</td>
			<td>use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating optical-quality glass surfaces to study macrophage fusion

生きている標本から巨細胞 (MGCs) の形成の可視化という最もライブ イメージング技術は、ガラスを光の伝搬を必要とするが、ガラスにマクロファージの融合は、まれなイベントのためにチャレンジしております。このプロトコルは、長鎖炭化水素を含む化合物の吸着が融合性表面にガラスを変換いくつかの光学的品質のガラス表面の作製を提示します。まず、きれいなガラス表面処理表面改質の出発原料として、説明します。第二に、融合性基板非融合性ガラスに変換する長鎖炭化水素を含む化合物の吸着のメソッドが提供されます。第三に、このプロトコルでは、MGC 形成の時空間制御の高度を促進するため表面のマイクロ パターンの作製について説明します。最後に、ガラス底培養皿を製造すると説明します。マクロファージの融合や MGC 形成を研究するモデルとしてこの体外電池システムの使用の例を示します。

材料の物理化学的パラメーターは、マクロファージの融合7,8,9,10の程度に劇的な効果を持っています。また、表面汚染物質は、マクロファージの融合11を促進するために知られています。したがって、マクロファージの融合のネガティブ コントロールとして重要なを始めるきれいなカバー ガラスです。きれいプロトコル 1 で説明したように、表面研磨による長鎖炭化水素の吸着度ナノトポグラフィ (図 1) を作成します。 一方ないの明白な表面の特徴をフラットにカバー ガラスが非常にです。
きれいなカバー ガラス表面に、マクロファージは非常に低率 (図 2) でヒューズします。対照的に、IL 4 の存在下で 24 h 後長鎖炭化水素を含む化合物を吸着した表面に適用されるマクロファージは堅牢な融合 (図 2) を受けます。さらに、(例えばトルエン、イソプロパノール) 単独で溶媒を吸着していないガラス膜融合表面 (図 2)。
炭化水素吸着の 10 nm の層が大幅に解像度に影響を与えること可能性が高いですが、それはそれにもかかわらず様々 な面の間で解像度の潜在的な違いを定量的に評価することが重要です。解像度は、通常レイリーの基準によって定義されます。近似解像力にしばしば使用される代替指標は全角半値幅 (半値幅) 光の回折限界より小さい構造。重要なは、蛍光イメージングに必要なガラスの特徴を十分に保存されていたことを示唆している (図 3 a)、様々 な面の間で 100 nm の蛍光ビーズの半値幅で明らかな違いはありません。さらに、エバネッ セント場を生成し、長鎖炭化水素 (図 3 b) を含む表面に適用される大食細胞の直接確率光三次元顕微鏡を実行することができました。ライブ イメージング技術の各種が実現可能な大食細胞、表面 (図 4、補足のビデオ 1、ビデオ 2 の補足) に適用されます。
表 1各表面の利点を説明します。高 NA オイル浸漬の目的を必要とする高度なイメージング技術の大半に厚く、蛍光の学位を持っているので、ほとんど融合性プラスチック表面と互換性がないがあるに注意してください。長鎖炭化水素吸着表面が12パーム/dSTORM/GSDIM13,14,15,16,を含むイメージング技術の多数を有効にすることに注意してください17、DIC、他18,19,20,21 (表 1)。さらに、イメージング可能 (表 1) の非常に多いだけでなく、(図 4 b; MGC 形成の時空間制御の高度を微細パターンの使用補足動画 1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig1.jpg"> 図 1: パラフィン吸着表面ナノスケール表面地形の学位を持っている。パラフィン吸着表面の表面を飾る材料の配列を含むに対し、ガラス表面の AFM スキャン (5 x 5 μ m) は明白な地形を示さない。Z 軸に沿って各顕微鏡写真の右側にある震度を表示します。スケール バーは、500 nm。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig2.jpg"> 図 2: と長鎖炭化水素吸着表面カバー ガラスにマクロファージの融合を促進します。(A) IL 4 がない場合は、ライトの汚れによりきれいなガラス表面に非常に少数の多核巨細胞細胞であるが。(B) 後 24 h IL-4、長鎖の可溶化に使用される溶剤を吸着した表面の存在下で炭化水素 (例えばトルエン、イソプロパノール) いくつかの多核巨細胞の細胞があります。(C-E)対照的と長鎖炭化水素吸着表面は融合と MGC 形成を促進します。IL 4 の最高度のパラフィン吸着結果は融合を誘導されます。黒で MGCs のとおりです。(F) permanox プラスチックの MGC 形成の度合いが比較のため表示されます。各画像で水色表示核と細胞質が紫色で表示。スケール バーは、100 μ m<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig3.jpg"> 図 3: と長鎖炭化水素吸着表面では、解像度が劇的には影響しません。(A) 全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡で照らされた 100 nm の蛍光ビーズの比較。上部の左側のパネルのはめ込みは拡大表示単一蛍光ビーズです。赤い線の値幅を計算するために使用の例ラインのプロファイルを表示する重ね合わせ。100 nm ビーズの半値幅で明らかな差は認められなかった。スケール バーは、5 μ m。 (B) 全反射と直接確率光三次元顕微鏡により評価した Mac 1 インテグリンの分布の比較。マクロファージはオレアミド含む表面に適用され、IL - 4 24 時間インキュベートします。B 白のはめ込みは、後続の顕微鏡写真のイメージ領域を強調表示します。スケール バーは、全反射画像の 5 μ m と 3 D の嵐の 2 μ m です。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56866/56866fig4.jpg"> 図 4: と長鎖炭化水素吸着表面がマクロファージの融合および広がりの時間分解ビューを有効にします。(A) 図は、微細パターンを生成するために使用プロシージャを示しています。(B) マイクロパターニングゲル表面がマクロファージの融合の時空間的制御を与えます。IL-4 の適用後数時間位相コントラストとマクロファージをイメージしました。微細パターンにグリッドの内部から細胞の移動に注意してください。フュージョンは、微細パターンでのみ観測されました。白い破線のアウトライン、MGC の拡大。時間は、hh:mm:ss として各顕微鏡写真の左上隅に表示されます。スケール バーは、50 μ m。 (C) 格子光シート顕微鏡20明らかに高い時空間ダイナミクス パラフィン吸着面に広がっているマクロファージです。色エンコード強度分布 (黄色は最も強い) eGFP LifeAct の。時間は各 mm:ss. として顕微鏡の写真の右上隅で表示されます<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/56866fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>表面:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>テクニック</td>
			<td>パラフィン</td>
			<td>オレアミド</td>
			<td>ワセリン</td>
			<td>MP パラフィン</td>
			<td>Permanox</td>
			<td>きれいなガラス</td>
		</tr>
<tr>
<td>位相コントラスト</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>明視野観察</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>DIC</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
			<td>x</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>落射蛍光</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>共焦点</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>√ *</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>全反射</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>パーム/dSTORM/GSDIM</td>
			<td>√</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>x</td>
			<td>x</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>SIM</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
		</tr>
<tr>
<td>STED</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>LLSM</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
			<td>N/T</td>
			<td>√</td>
		</tr>
<tr>
<td>融合インデックス</td>
			<td>中間</td>
			<td>中間</td>
			<td>中間</td>
			<td>高</td>
			<td>中間</td>
			<td>低</td>
		</tr>
<tr>
<td>融合場所</td>
			<td>ランダム</td>
			<td>ランダム</td>
			<td>ランダム</td>
			<td>定義されています。</td>
			<td>ランダム</td>
			<td>ランダム</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">MP 微細パターン</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">DIC - 微分干渉コントラスト</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">全反射・全反射蛍光</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">パーム - センサー ローカリゼーション顕微鏡</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">dSTORM - 直接確率光再建顕微鏡</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">GSDIM - 個々 の分子に続いて地上州枯渇を返す</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">シム - 構造化照明</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">STED - 誘導放出の枯渇</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">LLSM - 格子光シート顕微鏡</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">√-互換性</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">x - 互換性のないです。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">√ * - LWD、低倍率、または浸漬の目的でのみ可能</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">N/T - テストしていません</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 各表面の潜在的な用途。プラスチックの表面がほとんどイメージング技術の使用を排除することに注意してください。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56866/56866mov1.jpg"> 補足ビデオ 1: MGC 形成の時分割位相コントラスト表示。MGC 形成の明白なシンクロニシティに注意してください。時間は、hh:mm:ss の左上隅に表示されます。スケール バーは 50 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/Supplemental_Video1.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56866/56866mov2.jpg"> 補足ビデオ 2: 格子光シート顕微鏡20パラフィン吸着表面の拡散 thioglycollate 誘発 eGFP LifeAct マクロファージ。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56866/Supplemental_Video2.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。

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Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

このプロトコルを記述する生きている標本のマクロファージの融合の監視に使用することができ、固定標本の超解像顕微鏡の長鎖炭化水素を含む化合物を吸着した光学的品質のガラス表面の作製.

マクロファージの融合を研究するための光学的品質ガラス表面を加工

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

fabricating-optical-quality-glass-surfaces-to-study-macrophage-fusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.2K ビュー.  Mayo Clinic. このプロトコルを記述する生きている標本のマクロファージの融合の監視に使用することができ、固定標本の超解像顕微鏡の長鎖炭化水素を含む化合物を吸着した光学的品質のガラス表面の作製.

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Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

濃縮水性ウイルスと農業人獣共通病原体のガラスウールフィルター

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

免疫・感染学

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

ヒトの過剰発現と精製<em&gt;シス</em&gt; - プレニルトランスフェラーゼ<em&gt;大腸菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...