Name: overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli at JoVE.com

이 작품은 이스라엘 과학 재단 재단 연구 센터 (I-CORE)의 구조 세포 생물학 (1775/12)과 이스라엘 과학 재단 보조금 (1721/16과 2338/16) (YH)과 825/14 (DK ). DK에 대한 Fields Estate Foundation의 지원은 높이 평가됩니다. 이 연구는 Ilan Edri와 Michal Goldenberg가 Tel Aviv University의 Sackler 의학부의 MD 논문 요구 사항을 부분적으로 이행함으로써 수행되었습니다.

1 . E. coli 에서의 과발현을위한 cis -PT의 클로닝 <ol><li> 109aa thioredoxin (TRX) 단백질 17 과 융합 된 단백질 서열의 클로닝 및 고수준 발현을 위해 설계된 pET-32b 발현 벡터 및 대장균 코돈 최적화 된 전장 cis -PT 18 코딩 서열을 수득한다. </li><li> TEV 프로테아제 짧은가요 성 링커 하였다 (담배 식각 바이러스 단백질 분해 효소) 절단 부위 ( &quot;/&quot;는 절단 점을 나타내는 ENLYFQ / G) 9 갖도록주의 시스의 상류 (SGSGSG을 절단 부위의 접근성을 향상시키기) -PT 서열 ( 도 1A ). 또한, 복제에 적합한 5 &#39;및 3&#39;제한 사이트를 추가하십시오. </li><li> 표준 ligation 기술을 사용하여 합성 DNA 구조를 pET-32b 벡터에 클로닝하십시오 10 . </li></ol> 2. 지나치게 높은E. coli 에서의 인간 DHDDS의 절단 <ol><li> 제조사의 지시에 따라 TRX- 융합 DHDDS 구조체로 대장균 T7을 형질 전환시킨다. </li><li> 암피실린 선택 조건 (200 MG / L)하에 LB - 한천에 대한 제조 업체의 지침에 따라 형질 전환 세포를 플레이트. </li><li> 100 밀리그램 / L의 암피실린과 250 ML 플라스크 스타터 문화의 LB 매체 100 ML에 선택한 식민지를 접종하고 200 rpm으로 일정한 흔들림과 37 ° C에서 하룻밤 incubate. </li><li> 이 배양액 80 mL를 2 x YT 배지 (16 g / L 트립 톤, 10 g / L 효모 추출물, 5 g / L NaCl) 1.5 L가 각각 함유 된 2 개의 5 L 플라스크 (플라스크 당 40 mL) L 암피실린. </li><li> OD 600 nm = 0.5에 도달 할 때까지 180 rpm으로 일정하게 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양합니다. </li><li> 온도를 16 ° C로 낮추고 0.5 mM 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 세포를 유도하십시오. 범죄자단백질 발현을 위해 동일한 조건 하에서 16-20 시간 항온 처리한다. </li><li> 원심 분리 (10,000 x g 10 분)에 의해 세포를 수확. 참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. 세포 펠릿은 정화 때까지 -80 ° C에서 보관해야합니다. </li></ol> 삼 . 인간 DHDDS의 정제 <ol><li> 버퍼 A (25 MM 트리스 - HCL, 산도 7.5, 150 MM NaCl, 0.1 % 트리톤 X - 100, 10 MM β - mercaptoethanol), 1 μg / ML DNase I, 그리고 프로 테아 제 억제제 혼합물에있는 세포를 Resuspend. </li><li> 유리 - 테플론 균질기를 사용하여 세포를 균질화하십시오. </li><li> 15,000 PSI 11 - 12,000 마이크로 플루 또는 상응하여 세포를 방해. </li><li> 4 ° C에서 45 분 동안 40,000 xg에서 세포 용 해물을 원심 분리하십시오. 가용성 분획을 포함하는 상청액을 회수한다. </li><li> 상층 액을 5 - 10 mL 코발트 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (Co 2+ -IMAC) 12 컬럼에 넣고 10이후에 완충액 A 및 10 mM 이미 다졸로 철저히 세척하여 비특이적 단백질 결합을 감소시켰다. </li><li> 과잉 발현 된 단백질을 완충액 A로 250 mM 이미 다졸로 보충하십시오. </li><li> 완충액 A로 평형화 된 53 mL 예비 탈염 칼럼을 사용하여 이미 다졸을 제거한다. </li><li> 하룻밤 4 ° C에서 6xHis - 태그 TRX 융합 단백질을 제거하기 위해 용출 단백질에 6xHis 태그 TEV 프로 테아 제 (50mg 단백질 당 1mg TEV 프로 테아 제)를 첨가하십시오. </li><li> cleaved 6x His - 태그 TRX 융합 단백질과 TEV 프로 테아 제를 제거하기 위해 5 MM 이미 다졸로 보충 버퍼 A와 함께 평형 Co 2 + -IMAC 컬럼에 절단 단백질을로드합니다. </li><li> 30 kDa 분자량 차단 원심 분리 필터를 사용하여 3 ~ 4 mL로 유출액과 농축 물을 수집합니다. </li><li> 최종 정제를 위해 버퍼 A로 평형화 된 superdex-200 크기 - 배제 크로마토 그래피 컬럼 상에 농축 된 단백질을 로딩한다. 단백질은 이량 체 (~ 76 kDa)로 용리됩니다. </li&gt; <li> 컬럼 분석 곡선과 용출 프로파일을 비교하여 관련 분율을 선택하십시오. </li><li> SDS-PAGE를 사용하여 준비의 순도를 평가하십시오. </li><li> 다운 스트림 실험에 필요한 단백질 농도를 결정하고 사용하기 전까지 액체 질소에서 정화되고 농축 된 단백질의 플래시 동결 분취 량을 측정하고 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 4. 분석적인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) <ol><li> 동결 융해 사이클을 견딜 수있는 단백질의 능력을 보장하기 위해 동결 단백질의 분량을 해동하고 21,000 x g 에서 10 분간 원심 분리하여 불용성 응집체를 제거합니다. 뜨는을 수집합니다. </li><li> 상 단백질 넣 캅토-200 분석 컬럼 25 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 150 mM의 NaCl로 미리 평형, 0.02 % 트리톤 X-100, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 초 고성능 액체 크로마토 그래피 시스템 (13)을 사용하여, 14 . </li><li> 트립토판 플루 오레 모니터scence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm)를 사용하여 단백질의 용출 프로필을 검출합니다. 분자량 평가를위한 올바른 보정 곡선을 가져야합니다. 이러한 곡선은 SEC 컬럼 제조업체 를 통해 구할 수 있습니다. </li></ol> 5. 효소 반응 속도론 - 시간 의존적 활동 15 , 16 , 17 <ol><li> 정제 단백질의 활동을 보장하기 위해 10 μM FPP와 50 μM 14 C - IPP와 정제 DHDDS 5 μM을 섞어 22 - 30 ° C에서 0.5 MM MgCl 2 와 버퍼 A의 반응을 시작합니다. 참고 : 정확한 반응 조건은 DHDDS와는 다른 cis -PT의 준비에 따라 다를 수 있습니다. 또한, DHDDS의 활성도는 온도와 [Mg 2+ ]에 따라 달라집니다. 주의 : 14 C-IPP는 방사성 물질이므로 해당 지역의 방사선 안전 규정에 따라 사용해야합니다. </li&gt; <li> 0, 2, 4 및 6 시간에 반응에서 15 μL 샘플을 철회 후, 15 밀리 버퍼 A 보충 20 MM EDTA (10 MM EDTA의 최종 농도)의 추가로 반응의 즉각적인 급냉 다음. </li><li> H 2 O가 포화 된 1- 부탄올 1 mL를 넣고 충분히 소용돌이 칠하여 반응 생성물을 추출한다. 참고 : 여기서 프로토콜을 중지하고 샘플을 나중에 읽을 수 있도록 보관할 수 있습니다. </li><li> 샘플에 신틸레이션 칵테일을 넣고 신틸레이션 카운터를 사용하여 총 방사능을 나타내는 15 μL의 방사능과 함께 14 C를 포함하는 부탄올 단계의 반응 생성물을 정량하십시오. </li><li> 각 시점에서 0 시간 샘플을 사용하여 측정 된 배경 판독 값을 뺀 후 14 C-IPP의 백분율을 계산합니다. </li><li> 14 개의 이용 비율을 계산하여 각 시점에서의 네트 (14) C-IPP 혼입 계산 </C-IPP 농도를 측정하고, 시간의 함수로서 결과를 플로팅한다. 시간에 따른 순 14 C-IPP 통합의 증가가 예상된다. </li></ol>

<ol>
	<li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Prenyltransferase:+New+Insights+into+Protein+Glycosylation,+Rubber+Synthesis,+and+Human+Diseases.">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li><li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyprenyl+diphosphate+synthases.">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li><li>Ogura, K., Koyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Aspects+of+Isoprenoid+Chain+Elongation.">Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation.</a> Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li><li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure.">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li><li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis.">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li><li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis.">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li><li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+DHDDS,+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase,+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews.">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li><li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa.">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li><li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages.">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li><li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-scale+disruption+of+microorganisms.">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-metal+affinity+chromatography+(IMAC):+a+review.">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li><li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module:+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin.">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li><li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+for+3:1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels.">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457 (2011).</li><li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli.">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li><li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate,+magnesium,+and+triton.">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li><li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium,+isopentenyl+pyrophosphate,+and+farnesyl+thiopyrophosphate:+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis.">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li><li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+the+future+of+genomics+research.">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).</li><li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+human+glycosylation+disorders:+biochemistry+leads+the+charge.">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li><li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm.">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li><li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems:+current+industrial+applications+and+perspectives.">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21 (2014).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

E. coli 세포에서 기능성 인간 DHDDS를 정제하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 간단하고 효율적이어서 적절한 구조가 사용 가능 해지면 3-4 일 내에 단백질을 과발현하고 정제 할 수 있습니다. 단백질 정제를위한 그러한 프로토콜은 많은 질병 18 의 유전학에 관한 정보의 과다한 정보를 제공하는 게놈 시퀀싱의 돌파구를 고려할 때 특별한 의미가 있습니다. 따라서 단백질 수준 19 에서 병원성 메커니즘을 특성화하기위한 높은 처리량 방법의 개발이 필요합니다. 이종 단백질의 과발현과 정제에서 흔히 나타나는 함정을 극복하기 위해 여기에 몇 가지 조치가 취해졌으며, 이는 수용성 단백질과 기능성 단백질을 성공적으로 얻는 데 중요합니다. 첫째, DHDDS는 TRX 융합체로서 과발현되었다. TRX는 융합 단백질 폴딩을 촉진하고 융합 단백질 용해도를 증가 시켜서 포유 동물 b조형물 20 . 다음으로, 단백질 수율을 증가시키기 위해, DNA 작 제물은 대장균 21 에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 마지막으로, 상기 봉입체 형성의 가능성을 줄이기 위해, 단백질의 발현 가능성 22 단백질 폴딩을 돕는 단백질 합성 속도를 천천히 16 ℃로 유도 하였다. 고려 다른 종 사이 시스 -PT의 상 동성을 가지고 가서, 우리는이 프로토콜은 다른 진핵 시스에 적용 할 수 있음을 -PT뿐만 아니라 1 건의한다. 현재의 프로토콜을 출발점으로 사용하고 DHDDS 발현에 중요한 일반 지침이 주어지면,이 방법은 다른 cis -PT의 최적 발현을 위해 변형 될 수 있습니다. 예를 들어, 다른 융합 파트너 (예 : 말 토스 결합 단백질)를 시도하거나 연구 할 특정 단백질에 대한 배양 조건을 최적화 할 수 있습니다. &lt;생물학적 및 생물 공학적 중요성 1 , 7 , 8을 사용하여 다량의 정제 된 기능성 DHDDS를 다른 cis -PT와 함께 사용하여 구조적 및 기능적 특성 분석을 가능하게하는 설명 된 프로토콜의 향후 사용법 . 예를 들어, DHDDS에 대한 분자 연구를 통해 DHDDS 관련 망막염 의 기전을 해결할 수 있으며 잠재적으로 새로운 치료법을 개발하고 개발할 수 있습니다. 또한, 원핵 생물 cis -PT가 세균 벽 합성에 관여하므로,이 효소 군은 잠재적으로 새로운 항균제의 새로운 표적을 형성한다. 실제로, 진핵 및 원핵 효소 연구의 철저한 특성 분석은 원핵 세포 cis- PT에 대해 선택적 인 항균제의 합리적인 개발을 가능하게 할 수있다. 마지막으로 천연 고무가 합성됨에 따라 by의 cis -PT 제품군에 속하는 경우, 여기에 기술 된 접근 방식은 천연 고무 산업 합성에서 미래의 용도를 발견 할 수 있습니다.

Prenyltransferases 다중 축합 반응 1을 통해 아이소 펜 테닐 다이 포스페이트 (IPP)를 사용하여 알릴 포스페이트, 2 쇄 신장을 촉매하는 효소 군이다. E 형 효소 트랜스 이중 결합의 형성을 촉진하는 반면 3 Z 형 효소, 축합 반응, 시스 이중 결합의 형성을 촉매. -Prenyltransferases 시스 (시스 -PT, Z 형 효소) 고전 단 체인 (C 15), 중쇄 (C 50-55)에 자신의 제품의 사슬 길이에 따라 분류되며, 장쇄 (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 이소 펜 테닐 디 포스페이트 (IPP) 1을 이용한 다중 응축을 통해 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 신장을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT입니다, 5 , 6 . 이것은 dehydrodolichyl 포스페이트의 형성을 초래하는 dolichylpyrophosphate 전구체 N - 결합 글리코 실화 단백질 1에 관련된 글리코 캐리어 분자로서의 C 55-100 polyprenyl 인산. Ashkenazi 유태인 중, DHDDS에있는 missense 비 보존 적 돌연변이 (K42E)는 염색체 열성 색소 성 망막염을 초래합니다 7 , 8 . 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. Escherichia coli 는 재조합 단백질 발현을위한 가장 편리하고 비용 효율적인 숙주로 여겨지며, 따라서 가장 빈번하게 사용되는 숙주이기도합니다. 그러나 대장균 에서 이종성으로 단백질을 과발현 시키려 할 때, 단백질 특유의 고려가 이루어져야한다. 적절하게 접힌 상태에서 얻음대장균 으로부터의 재조합 단백질은 상이한 단백질의 독특한 특성으로 인해 단순한 문제가 아니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 수많은 접근법이 개발되었습니다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 - 최적화의 사용은 대장균 에서 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. 참고로, 단백질 융합하지 않고 효모 시스의 -PT를 과발현하는 이전 시도조차 세제 (12)의 존재에 불용성을 완료 할 예정 실패했습니다. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효과적이며 시간을 절약 할 수 있으며 기계 론적 연구에 적합한 DHDDS 준비를 얻을 수 있습니다. 서로 다른 종에서 cis -PT의 상 동성을 고려할 때,이 프로토콜은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있다고 제안한다.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express&amp;nbsp;lysY&amp;nbsp;Competent&amp;nbsp;&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;&amp;nbsp;(High Efficiency)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON-superflow resin</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 desalting column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 increase 5/150 GL&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C-Isopentenyl pyrophosphate</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>trans,trans-Farnesyl pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli

Prenyltransferases (PT)는 다중 응축 반응을 통한 isopentenyl diphosphate (IPP) 를 사용하여 알릴이 인산의 사슬 연신을 촉매하는 효소 군입니다. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 ispenetenyl diphosphate (IPP)와의 다중 축합을 통한 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 연신을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT (축합 반응으로부터 cis 이중 결합을 형성 함)이다. DHDDS는 효소의 비 보존 적 돌연변이 (K42E)가 망막염 색소 침착 으로 이어 지므로 궁극적으로 실명으로 이끄는 생물 의학적으로 중요합니다. 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 대량의 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 최적화의 사용은 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. <em&gt; E이다. 콜리. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효율적이며 시간을 절약합니다. 상이한 종 사이의 cis -PT의 상 동성은이 프로토콜이 천연 고무 합성에 관여하는 것과 같은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있음을 시사한다.

여기에 사용 된 구조 및 정제 과정에 대한 일반적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 각 정제 단계에서 얻은 샘플을 그림 2 에 나타냈다 . 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여줌으로써 매우 정제 된 제품을 생성합니다. 도 3 은 정제 된 효소의 SEC 분석 결과로서, 단백질이 동종이 량체로만 ​​관찰된다는 것을 나타낸다. 그림 4 는 대표적인 시간 의존 활성 분석을 보여줍니다. 14 C-IPP 혼입은 6 시간 이상 명확하게 상승하여 정제 된 효소가 기능적임을 입증한다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56430/56430fig1.jpg" /> 그림 1 : 인간 DHDDS 클로닝 및 정제 . ( <strong&gt; A)이 연구에서 사용 된 구조. ( B ) 여기에 설명 된 인간 DHDDS 정화 프로토콜의 개요. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56430/56430fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56430/56430fig2.jpg" /> 그림 2 : 인간 DHDDS의 정제 . 인간 DHDDS 친 화성 정제 단계의 SDS-PAGE 분석. 레인 1, 분자량 마커 (kDa); 레인 2, 조 추출물; 레인 3, Co2 + -IMAC 플로우 스루. 화살표는 TRX-DHDDS 융합 단백질을 나타내고; 레인 4, Co2 + -IMAC 용출액; 레인 5, 밤새 배양 후 단백질 -TEV 프로테아제 혼합물; 레인 6, TEV 절단 후 Co2 + -IMAC 플로우 스루; 레인 7, TEV 절단 후 Co2 + -IMAC 용출액; 레인 8, 정제 된 인간 DHDDS (indic화살표로 표시) 크기 배제 크로마토 그래피. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56430/56430fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56430/56430fig3.jpg" /> 그림 3 : 정제 된 인간 DHDDS의 분석 SEC. 트립토판 형광을 프로토콜에 기술 된대로 모니터링 하였다. 이 칼럼의 보정 곡선에 따르면, DHDDS는 호모 다이머 (homodimer) (77.4 kDa)를 형성합니다. 화살표는 보이드 볼륨을 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56430/56430fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56430/56430fig4.jpg" /> 그림 4 : Ti나에게 의존적 인 인간 DHDDS의 활동. 10 μM FPP 및 50 μM 14 C-IPP를 기질로하는 반응에서 정화 된 인간 DHDDS의 시험 관내 활성은 단백질 당 IPP 혼입 (mol / mol)으로 표현된다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56430/56430fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli at JoVE.com

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

6.5K 조회수.  Tel Aviv University.  에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 ?...

비디오: Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

연구

유전학

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

생화학

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

생체공학

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

면역학 및 감염병학

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

생물학

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

구현을위한 프로토콜<em&gt; 대장균</em합성 생물학&gt;을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

인간의 과발현과 정제

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터