우리는 또한 중요 한 독서에 대 한 가브리엘 손을 감사합니다.

모든 실험은 오사카 대학 및 일본 신경 과학 학회의 동물 복지 위원회에 의해 설립 하는 지침에 따라 수행 했다.
1. Organotypic cocultures의 시상과 대뇌 피 질
참고: 자세한 절차를 참조 원래 간행물7,8,13. 모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. Sprague-Dawley (SD) 쥐 신경 문화 사용 됩니다.
<ol><li>
시 약의 준비 참고: 다음 시 약의 한 쥐 두뇌에 대 한 있습니다.<ol>
<li>
수정 된 n 2 보충 x 10 준비 13: 인슐린 (50 μ g/mL), 황 체 호르몬 (200 nM), 하이드로 코 티 손 (200 nM), 나트륨 selenite (300 nM), 올려진다 (1 mg/mL), putrescine (1mm), 포도 (60 mg/mL)</li>
		<li>
준비 포함 하는 혈 청 문화 매체 (10 mL): 85 %DMEM / F12, 10% 수정 10 x n 2 보충, 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)</li>
		<li>
준비 혈 청 무료 문화 매체 (20 mL): 90 %DMEM / F12, 10% 수정 10 x n 2 보충</li>
		<li>쥐 꼬리 콜라겐 솔루션 (0.5 mL)을 준비 합니다. 간단히, 무 균 조건 하에서 쥐 꼬리에서 부드러운 섬유를 초 산 솔루션에서 밤새 품 어. 원심, 후 상쾌한 (몇 mg/mL)를 수집 하 고 냉장고13에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 요리 준비
	<ol>
<li>35 mm 페 트리 접시에 막 삽입을 놓습니다.</li>
		<li>막에 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션의 40-50 μ를 추가 하 고 중심 콜라겐 솔루션을 확산.</li>
		<li>공기 깨끗 한 벤치에 완전히 막 건조.</li>
		<li>막이는 매체와 젖, 접시에 포함 하는 혈 청 문화 매체의 1.5-2 mL를 넣어.</li>
		<li>인큐베이터에서 (37 ° C, 습도 95%, 공기와 5% CO2) 도금 하기 전에 문화 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
대뇌 피 질의 조각 준비
	<ol>
<li>모든 수술 기구 70% 에탄올과 10 분 이상 소독.</li>
		<li>출생 후 하루 (P) 2에서 신속 하 게 뇌를 해 부 (몇 분 동안 얼음 조각에 몰두) 하는 차가운 취 쥐.</li>
		<li>장소 100 mm 페 트리 접시 찬 행 크 스의 100 mL를 포함으로 뇌 균형 소금 솔루션.</li>
		<li>좋은 겸으로 두뇌에서 피아 문제를 제거 하 고 microsurgical가 위 시각과 somatosensory 피 질에서 대뇌 피 질의 조각 (300-400 μ m 두께)를 잘라 (세부 사항, 그림 1참조). 참고: 대뇌 피 질의 조각의 두께 쌍 안 현미경 격자의 규모에 의해 대략 추정 된다. 참고: 또는, 대뇌 피 질의 조각 무 균 조건 하에서 vibratome로 할 수 있다.</li>
		<li>일회용 플라스틱 피 펫으로 막 삽입에 몇 대뇌 피 질의 조각 전송 합니다.</li>
		<li>(자세한 내용은 참조8,13) 화재 광택 파스퇴르 피펫으로와 문화 삽입의 중앙 조각의 위치를 조정 하 고 삽입에서 초과 매체를 제거 합니다. 참고: 슬라이스 가스 매체의 충분 한 공급 받을 수 있도록 조각의 표면 보다 약간 중간의 레벨을 조정 합니다. 이것은 세포 생존 능력에 대 한 중요 합니다.</li>
		<li>혼자 하루 전에 thalamic 블록을 촬영 하 고 그것을 옆에 배치 되어 습도 95% 공기와 5% CO2, 그리고 문화의 환경에서 37 ° C에서 포함 하는 혈 청 문화 매체에서 분할 영역을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thalamic 블록의 준비
	<ol>
<li>모든 수술 기구 70% 에탄올과 10 분 이상 소독.</li>
		<li>임신한 쥐 (배아 하루 15) 복 주사 pentobarbital (50 mg/kg) 마 취를 포함 하 여 anesthetize.</li>
		<li>자 궁 뿔에서 각 태아를 해 부 고 배아 100 mm 페 트리 접시 찬 행 크 스 균형된 소금 솔루션의 100 mL를 포함 합니다.</li>
		<li>쌍 안 현미경 각 배아에서 뇌를 제거 하 고 주로 microsurgical가 위 ( 그림 1참조)를 사용 하 여 ventrobasal 복잡 하 고 측면 geniculate 핵 (약 0.5 m m x 3)7 을 포함 하는 thalamic 블록을 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 및 organotypic cocultures를 유지
	<ol>
<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 멤브레인 필터에 배치 되어 있는 대뇌 피 질의 조각의 심 실 표면 옆 thalamic 블록을 배치 합니다.</li>
		<li>습도 95% 공기와 5% CO2의 환경에서 37 ° C에서 포함 하는 혈 청 문화 매체에서 cocultures을 유지 관리 합니다.</li>
		<li>문화에 있는 2 일 후 혈 청 무료 문화 매체와 매체의 절반을 교환 합니다. 그 후, 매체 2-3 일 마다 교환 합니다. 참고: 매체의 수준으로 세포 생존에 대 한 중요 한 중간 교환 후 확인 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Electroporation
모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
참고: Electroporation 블록의 분리를 방지 하기 위해 thalamic 블록의 준비 후에 1 일을 수행 합니다.
<ol><li>
플라스 미드
	<ol>
<li>플라스 미드의 혼합물을 다음과 같이 확인: pCAGGS-DsRed 2 μ g/μ; pCAG SYP EGFP 3.5 μ g/μ. 참고: 내 무료 Maxiprep 키트를 사용 하 여 두 플라스 미드 정화 하 고 행 크 스 균형된 소금물에 용 해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation 장비 설치 자극과는 아이 솔 레이 터 등 전기 악기는 그림 2와 같이 연결 되어야 합니다.<ol>
<li>복 형 아이 솔 레이 터에는 자극을 연결 합니다.</li>
		<li>전극 (실버 와이어 0.2 m m 직경)는 아이 솔 레이 터의 부정적인 터미널에 연결 합니다.</li>
		<li>전극 (실버 와이어 1 m m 직경) 시리즈는 100 Ω 저항 하는 아이 솔 레이 터의 긍정 맨끝에 연결 합니다.</li>
		<li>전기 전류 저항는 증폭기와 전압을 측정 하 여 전달 여부를 모니터링 하는 오실로스코프에 앰프를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
유리 펫의 준비 참고: 두 가지 유형의 유리 펫 플라스 미드 솔루션의 방출 및 전기 펄스의 응용 프로그램에 대 한 사용 됩니다.<ol>
<li>전극 끌어당기는 사람와 유리 모 세관에서 펫을 확인 합니다.</li>
		<li>휴식 방출 피 펫에 대 한 팁 (팁 직경 20-50 μ m 이어야 한다).</li>
		<li>갈기 고 화재 연마 (내부 직경 50-200 μ m 이어야 한다) 다음 샌드 페이퍼와 전극 피 펫의 끝을 폴란드어. 참고: 전극 팁은 직접 조직 접촉으로 평평 하 고 부드러운, 이어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation 절차
	<ol>
<li>배출 및 전극 펫은 컨트롤러에 연결 합니다.</li>
		<li>전극 피 펫에 실버 와이어 (0.2 m m 직경)를 삽입 합니다.</li>
		<li>플라스틱 튜브 1 mL 주사기를 방출 피 펫을 연결 합니다.</li>
		<li>차지 > 주사기 흡입에 의해 방출 피 펫에 플라스 미드 솔루션의 5 μ.</li>
		<li>Electroporation 단계에 coculture를 넣어 하 고 문화 매체에 1mm 직경 전극 삽입.</li>
		<li>Thalamic explant에 방출 피 펫을 놓습니다.</li>
		<li>팁 thalamic 블록의 표면 접촉 후 주사기를 수동으로 밀어. 참고: 플라스 미드의 0.5 μ에 대 한 솔루션으로 하나의 thalamic 블록 당 사용 됩니다.</li>
		<li>즉시 방출 피 펫의 철회 후 전극 피 펫을 thalamic 블록에 놓습니다.</li>
		<li>전기 펄스 (50-400 µ A, 200 Hz에서 1 ms 기간 200 평방 펄스의 3 ~ 5 열차)를 제공 합니다. 진폭 및 오실로스코프에 열차의 수를 모니터링 합니다. 참고: 전기 전류 진폭 전극 피 펫13의 내부 직경에 따라 다릅니다.</li>
		<li>전극 피 펫을 철회 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경 관찰
	<ol>
<li>문화 요리 EGFP에 대 한 두 개의 필터 집합을 갖춘 올바른 confocal 현미경의 현미경 단계에 넣어 (여기, 488 nm; 방출, 515 nm) 및 DsRed (여기, 514 nm, 방출, 565 nm).</li>
		<li>1-7 µ m 단계 크기는 20 X 긴 작동 거리 대물 렌즈에서 10-25 광 섹션의 이미지를 가져가 라. DsRed와 SYP EGFP 표현 하는 개별적으로 구별할 수 레이블이 축 삭을 선택 합니다. 참고: 관찰된 지역 (1024 x 1024 픽셀, 즉 해당, 0.68 μ m/픽셀) 약 0.7 x 0.7 m m 이다.</li>
		<li>캡처 이미지 매일 이미징에 대 한 모든 24 h. 실 온에서 10 분 이내 완료 하 고 문화 인큐베이터에 반환. 짧은 간격 시간 경과 영상에 대 한의 환경 습도 95% 공기와 5% CO2 37 ° c.에 유지 문화 실에서 문화 유지</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat:+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis.">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li><li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+development:+how+are+we+going+to+get+there.">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li><li>Espinosa, J. S., Stryker, M. 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M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li><li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. 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S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation:+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures.">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li><li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching.">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li><li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices.">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li><li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity.">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li><li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Method+for+Mammalian+CNS+Neurons+in+Organotypic+Slice+Cultures.">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li><li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture.">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li><li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus.">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons.">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons.">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li><li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching.">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li><li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching.">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜은 또한 TC 프로젝션11의 다른 축 삭 성장 발달 측면을 연구 하는 강력한 도구입니다. 예를 들어, 대뇌 피 질의 조각 문화와 electroporation 기술은의 조합을 대뇌 피 질의 신경 세포와 장기 관찰9,18의 개별 axonal 형태를 시각화 수 있습니다.
현재 프로토콜을 사용 하 여 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성에 흥미 있는 유전자의 역할은 또한 형광 단백질 및 관심 유전자의 공동 식으로 분석할 수 있습니다. 일반적으로, 이상의 형광 단백질 표현 세포의 90%는 공동 페 두 번째 플라스 미드와 플라스 미드 솔루션의 어 금 니 비율 1:218,19로 조정. 그러나, 최적의 비율 공동 transfection 효능으로 다를 수 있습니다 및 식 수준 벡터 사이에서 변화 된다.
현재 프로토콜은 시간 경과 실험에 대 한 효율적입니다, 비록 몇 가지 기술적인 문제가 있다. 매일 이미지에 대 한 한 coculture는 매일 현미경 스테이지에 배치 했다. 비록 axonal 개발 매일 이미징10에 의해 심각 하 게 영향을 받을 것 같지 않았다, 각 문화 매체의 ph에서 변화와 문화 솔루션의 증발을 최소화 하기 위해 10 분 이내 완료 되어야 한다. 또는, 그것은 온도, 습도 및 현미경 단계12문화의 pH를 유지 하기 위해 더 좋을 것 이다.

포유류 두뇌에 있는 thalamocortical (TC) 투영 축 삭 지도 메커니즘을 대상으로 조사에 적합 한 시스템입니다. 개발 하는 동안 감각 TC axons 외피 격판덮개 및 양식 지점과 시 냅 스에 우선적으로 레이어 IV의 대뇌 피 질1,2차 감각 영역에서 성장 한다. 근본적인 연결의 설립 후에 axonal 아 버와 시 냅 스 터미널은 환경 변화3,4에 따라 리 모델링. 그러나, 어떻게 TC 축 삭 형태학 동적으로 변경 되는 제대로 이해. 주된 이유 중 하나는 단일 세포 수준에서 구조적인 변화를 관찰 하는 적절 한 기법의 부족 이다. 전반적인 TC 궤적5, 을 캡처에 대 한 여전히 기술적인 제한이 있다 현미경 검사 법, 2 광자 현미경 등 최근 개발 허용 생활 대뇌 피 질의 뉴런에 vivo에서의 직접 관찰, 비록 6. 따라서, TC 축 삭의 라이브 이미징 방법 체 외에서 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 구조 분석을 위한 강력한 도구를 제공 것.
처음으로 우리 그룹 설립 투과성 막7정적 슬라이스 문화 방법. 이 방법을 사용 하 여, 쥐 대뇌 피 질의 조각 했다 감각 thalamic 블록, cocultured 그리고 lamina 특정 TC 연결 했다이 organotypic cocultures7,8지. 형광 단백질으로 스파스 라벨 추가 수 있었습니다 TC 축 삭 성장 및 지점 형성9,,1011관찰. 최근에, 분기의 동시 이미징에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다 그리고는 organotypic에서 개별 TC 축 삭 시 냅 스 형성 cocultures12. TC 축 삭과 연 접 사이트를 동시에 시각화할 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 했다 organotypic coculture의 electroporation에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 현재 메서드는 TC axons의 형태소 분석을 용이 하 게 하 고 장기 관찰, 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 표시 하는 데 사용할 수 있습니다 허용 합니다.

<table style="border-collapse:collapse;width:344pt" width="459">
	<colgroup>
		<col style="width:113pt" width="151" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:58pt" width="77" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">DMEM/F12</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">GIBCO</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">11320-033</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Hanks&#8217; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nissui</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">5905</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SH30396-03</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">Hyclone</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Insulin</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">I6634</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Progesterone</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">P8783</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Hydrocortisone</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">H0888</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Sodium selenite</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Wako Pure 
			Chemical Industries</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">192-10843</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Transferrin&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">T1147</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Putrescine&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Sigma</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">P5780</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Glucose</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Wako 
			Pure Chemical Industries</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">16806-25</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">35 mm petri dishes</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Falcon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">351008</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Millicell-CM insert</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Millipore</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">PICMORG50</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">100 mm petri dishes</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">BIO-BIK</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">I-90-20</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">petri dish sterrile</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Invitrogen</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">K210006</td>
			<td class="xl23" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="59" style="height:44.25pt">
			<td class="xl20" height="59" style="width:113pt;height:44.25pt" width="151">Disposable sterile plastic pipettes</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">202-IS</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">transfer pipets sterile</td>
		</tr>
		<tr height="54" style="height:40.5pt">
			<td class="xl20" height="54" style="width:113pt;height:40.5pt" width="151">Glass capillary: OD 1.2 mm</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">&#160;G-1.2</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77">inner diameter, 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr height="53" style="height:39.75pt">
			<td class="xl20" height="53" style="width:113pt;height:39.75pt" width="151">Silver wire: 0.2 and 1 mm&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nilaco</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">1 mL syringe</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Terumo</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SS-01T</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Stimulator&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">A.M.P.I</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">Master 8</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Biphasic isolator&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">BAK ELECTRONICS</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">BSI-2</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Amplifier&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">A-M Systems</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">Model 1800</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Oscilloscope</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Hitachi</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">VC-6723</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Manipulator</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SM-15</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Micromanipulator</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">MO-10</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Olympus</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SZ40</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Universal stand&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Olympus</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">SZ-STU2</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Light illumination system&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Olympus</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">LG-PS2, LG-DI, HLL301</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Electrode puller&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Narishige</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">PC-10</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Confocal microscope</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nikon</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">Digital eclipse C1 laser</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">x20 objective</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Nikon</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">ELWD 20x/0.45</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Culture chamber</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Tokai Hit</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">UK A16-U</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Sprague-Dawley (SD) rat</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Japan SLC and Nihon-Dobutsu</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl20" height="40" style="width:113pt;height:30.0pt" width="151">Microsurgery scissors</td>
			<td class="xl20" style="width:89pt" width="119">Natsume&#160;</td>
			<td class="xl20" style="width:84pt" width="112">MB-54-1</td>
			<td class="xl20" style="width:58pt" width="77"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures

축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 하는 정확한 신경 회로 설정 하기 위한 중요 한 프로세스입니다. 개발 하는 동안 감각 thalamocortical (TC) 축 삭 대뇌 피 질의 특정 레이어에 지점과 시 냅 스 형성합니다. 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이 명백한 공간 상관 관계에도 불구 하 고 그들 사이의 인과 관계가 제대로 이해 된다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 최근 organotypic cocultures에서 개별 TC 축 삭의 분기 및 시 냅 스 대형의 동시 이미징 방법을 개발.
이 프로토콜 organotypic coculture 및 electroporation의 조합으로 구성 되는 방법을 설명 합니다. 시상과 대뇌 피 질의 Organotypic cocultures 유전자 조작 및 axonal 프로세스, 박판 모양 구성 등 독특한 구조를 보존의 관측을 촉진 한다. 두 가지 플라스 미드 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 인코딩 했다 electroporation 기술에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 이 메서드를 사용 하 여 TC 뉴런의 개별 axonal 형태학 및 연 접 사이트를 동시에 시각화 수 있었습니다. 메서드는 또한 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 밝혀 장기 관찰을 사용할 수 있습니다.

실험 여기 TC 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 관계를 공개 하는 것을 목표로 설명 합니다. 동시에 시각화 axonal 궤도 및 연 접 사이트, 단일의 위치 또는 몇 thalamic 셀 organotypic cocultures 인코딩 SYP EGFP 및 DsRed electroporation를 사용 하 여 두 개의 플라스 미드와 페 했다. 문화에서 두 번째 주 동안 개별적으로 구별할 수 TC axons 했다 DsRed (그림 3)에 의해 명확 하 게 표시 됩니다. DsRed 및 SYP EGFP 전시 axons만 관찰에 대 한 선정 됐다. 레이블이 지정 된 TC axons 대뇌 피 질의 조각 침공과 organotypic에서 thalamic axons vivo에서7, 있는 층 류 특이성 닮은와 양식 지점 cocultures를 나타내는 상위 계층에서 주로 분 지를 형성 8,10,,1415,,1617. 같은 시간에 punctate 집계 SYP EGFP (SYP EGFP puncta)의 DsRed 표시 된 TC 축 삭 (그림 3D-3 층)에 따라 관찰 수 있었다. 이후 이러한 SYP EGFP puncta colocalized immunopositive 신호 thalamic 셀의 연 접 마커 인 VGLUT2와 PSD95, 일반 postsynaptic 마커는 주로 그것은 가능성이 SYP EGFP puncta 주로 연 접 대표 TC axons12사이트입니다.
TC axons 더 보여 그 축 삭 분기의 시간 경과 영상 thalamic 뉴런의 시 냅 스 형성 했다 연속적이 고 동적으로 추가 및 제거 (그림 4)12. 또한, 대부분 분기 연 접 사이트 (자세한 내용은 참조12) 분기 대형을 방 아 쇠를 나타내는 SYP EGFP puncta에서 등장을 발견 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56553/56553fig1.jpg"> 그림 1 . 시상과 대뇌 피 질의 organotypic cocultures의 준비를 위한 절차. (A) 신생아 쥐 두뇌의 상위 뷰. 첫 번째 컷 (1) 중간에 평행 하 게 이루어집니다. 다음, 300-500 μ m 두께 코로나 섹션 기본 시각과 somatosensory 피 질 (2)에서 절단 됩니다. 마지막으로, 대뇌 피 질의 조각 (3)를 잘라 parasagittal을 확인 합니다. (B) A의 시상과 대뇌 피 질 organotypic coculture의 도식 표현입니다. 출생 후 하루 2 쥐에서 대뇌 피 질의 조각 및 배아 하루 15에서에서 thalamic 블록 멤브레인 필터에 cocultured 있습니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56553/56553fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56553/56553fig2.jpg"> 그림 2 . 위한 electroporation 전기 계기의 회로도. 자극, 아이 솔 레이 터, 그리고 전극 피 펫 시리즈에서 연결 된다. 부정 청구 DNA를 전달 하기 위해 전극 피 펫은 아이 솔 레이 터의 부정적인 터미널에 연결 된다. 오실로스코프 electroporation에 대 한 전기 전류를 모니터링할 수 있습니다. TH: 시상. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56553/56553fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56553/56553fig3.jpg"> 그림 3 . 2 주 후에 문화 coculture 축 삭 Thalamocortical. (A-F) Thalamocortical (TC) 축 삭에 SYP EGFP DsRed와 coexpression. DsRed 플러스 SYP EGFP 플라스 미드 1 일에 생체 외에서 (DIV) electroporation를 사용 하 여에서 교양된 thalamic 세포로 소개 되었다. (A) 12 팀 (B) A DsRed 표시 된 thalamic 셀 후 thalamic 및 대뇌 피 질의 조각 organotypic coculture 대뇌 피 질의 조각으로 축 삭을 확장 하 고 상층에 분 지를 형성. (C) (a) 박스형 영역의 확대 이미지. (D-F) (C)의 박스형된 지역에는 게 TC DsRed 표시 된 축 삭 (D) 와 SYP EGFP puncta (E)를 표시 합니다. SYP EGFP의 개별 축적 단일 TC 축 삭을 따라 관찰 되었다. Th: 시상. 스케일 바: (B) 1 m m, (C) 100 µ m, 및 (F) 20 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56553/56553fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56553/56553fig4v2.jpg"> 그림 4 . 표현 SYP EGFP 및 DsRed organotypic coculture thalamocortical 축 삭의 시간 경과 영상. DsRed 플러스 SYP EGFP 플라스 미드로 소개 되었다 1 DIV에서 교양된 thalamic 셀 electroporation를 사용 하 여. 이 축 삭은 매일 몇 군데 이상 4 일 (11 DIV 14 DIV). 눈금 막대: 50 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56553/56553fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.4K 조회수.  Kanazawa University. 이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

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Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

동물 커뮤니케이션 연구를위한 자동화된 대화형 비디오 재생

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

연구

신경과학

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현<sub&gt;</sub&gt; 수용체

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced tools currently used to study neurons, have only partly been taken on by oligodendrocyte researchers. Cell type-specific staining by viral transduction is a useful approach to study live organelle dynamics. This paper describes a protocol for visualizing oligodendrocyte mitochondria in organotypic brain slices by transduction with adeno-associated virus (AAV) carrying genes for mitochondrial targeted fluorescent proteins under the transcriptional control of the myelin basic protein promoter. It includes the protocol for making organotypic coronal mouse brain slices. A procedure for time-lapse imaging of mitochondria then follows. These methods can be transferred to other organelles and may be particularly useful for studying organelles in the myelin sheath. Finally, we describe a readily available technique for visualization of unstained myelin in living slices by Confocal Reflectance microscopy (CoRe). CoRe requires no extra equipment and can be useful to identify the myelin sheath during live imaging.

Myelinating oligodendrocytes promote rapid action potential propagation and neuronal survival. Described here is a protocol for oligodendrocyte-specific expression of fluorescent proteins in organotypic brain slices with subsequent time-lapse imaging. Further, a simple procedure for visualizing unstained myelin is presented.

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...