저자는 우리에게 항체를 보내주셔서 아이오와 대학에서 발달 연구 하이 브리 도마 은행을 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단으로부터 보조금 (제 29 / 08)에 의해 지원되었다. 로도 DFG (독일 Forschungsgemeinschaft)의 연구 기금에 의해 지원됩니다.

당신이 시작하기 전에 <ol><li> 원하는 플라이 문화를 성장. (50 ML의 유리병 당 약 30 파리) 솟아 튜브를 유지. 파리는 각 유리병에서 단 하루 동안 알을 보자. 이것은 애벌레 충분한 식량 공급을 제공하며 그들이 음식을 밖으로 크롤 링하기 전에 최대한의 크기에 도달할 수 있습니다. 셋째 instar의 유충이 유리병 벽에 방황하기 시작 전까지는 적절한 온도의 튜브를 유지. </li><li> 인산염의 신선한 재고가 식염수 (PBS)와 PBT (PBS에 0.​​1 %의 십대 초반)를 버퍼 준비합니다. 빙판에 PBS의 10 ML 보관하십시오. </li><li> 신선한 정착액의 1-5 ML (PBT 4 %의 포름 알데히드)을 준비하고 얼음에 보관하십시오. 우리는 주식 솔루션으로 병 37~38%의 포름 알데히드를 사용합니다. </li></ol> 1. 셋째 Instar의 애벌레의 절개 및 고정 <ol><li> 유리병 벽에서 방황하는 셋째 instar의 유충을 선택하고 Sylgard의 해부 플레이트 (에 Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트, DOW 코닝 주식 회사로 만들어진 얼음처럼 차가운 PBS의 50 μl 드롭에 배치조직 문화 요리). </li><li> 좋은 포셉을 (뒤몽 # 5 포셉)를 사용하여, 입 후크 근처 유충, 등 부분의 면을 꽉 및 유충의 두뇌를 통해 곤충 핀 (minutien, 0.1 mm, 스테인레스 스틸)에 붙어 있어라. </li><li> 집게와 애벌레의 뒷부분 끝을 잡아, 부드럽게 당겨 부드럽게 길이로 유충을 스트레칭. 두 후부 spiracles 사이에 다른 곤충 핀을 찔러. </li><li> 사용하기 스프링 가위는 앞부분과 후부 핀이 가까운 신체 벽에 두 수평 incisions을 (수직 앞부분 - 후부 축까지), 컷. </li><li> 봄 가위를 사용하면 사후 절개로 앞부분에서 지느러미 중간선에 따라 애벌레의 몸을 벽을 끊었어. </li><li> 미세 집게를 사용하여 내부 장기 (창자, 침샘, malpighian tubules 등) 및 호흡 관을 제거합니다. PBS로 한 두 번 가볍게 씻는다. </li><li> 그들이 밖에서 스트레칭과 각 측면하기위한 두 곤충 핀을 사용하여 접시에 뒤집어 씌워, 포셉과 두 신체 벽면 펄럭을 풉니다. </li><li> P 제거학사 및 정착액 (PBT 4 %의 포름 알데히드) 50 μl를 추가합니다. 실온에서 20 분 알을 품다. </li><li> 정착액을 제거합니다. PBS로 두 번 씻는다. 곤충 핀을 빼낸다. 사용하기 스프링 가위 사각형 등심을 떠나는 애벌레 머리와 꼬리를 잘라. PBS로 냉장 Eppendorf 튜브에 고정 조직을 전송합니다. </li><li> 애벌레의 충분한 수의 고정되면, 하나는 항체 염색법에 직접 계속할 수 있습니다. 즉각적인 염색법이 원하는되지 않을 경우 고정 애벌레는 95 % 에탄올로 3 회 5 분마다을 씻어하고 -20 ° C.에 95 % 에탄올에 보관해야 </li></ol> 2. 해부 및 Pupae의 고정 부 전 <ol><li> 셋째 instar의 애벌레가 pupariate 시작할 때까지, 애벌레 고정 용과 같은 튜브에 참석. 튜브에게 pupariated했습니다 매시간 마크 애벌레를 검사합니다. 표시된 pupae는 29에서 24 ° C, 또는 24-27시간에서 30-40시간을 개발하도록 허용 ° C. </li><li> 미세 집게를 사용하면 차의 20-30 pupae을 선택전자 적절한 연령과 어두운 도자기 다중 잘 해부 접시에 넣어 두었어요. 관심있는 조직을 손상하지 않도록주의하십시오. </li><li> pupal 사건에서 나온 pupae의 압축을 풉니다. operculum를 벗겨내으로 시작하고 번데기는 무료입니다 때까지 계속합니다. 잘 PBT 가득에 번데기를 넣고. 모든 pupae를 추출 계속합니다. 단계 2.4-2.6은 번에 5 pupae 작은 일괄적으로 수행되어야한다. </li><li> 해부 접시의 우물 사이의 평평한 표면에 서류가 다섯 pupae를 놓습니다. 마이크로 해부 나이프를 사용하면 머리 끝부분을 잘라 복부의 후부 팁은 (또는 그것 pupae의 양쪽 끝에 구멍을 뚫는 데 포셉 두 쌍을 사용할 수 있습니다.) </li><li> 미세 집게를 사용 장소에 번데기를 잡고 앞부분은 오프닝을 통해 PBT을 주입하여 번데기의 내부 장기를 씻어 1 ML의 주사기를 사용합니다. </li><li> 잘 PBS로 가득에 찍기로 해부하는 번데기를 간단히 씻고 얼음에 보관 Eppendorf 튜브에 감기 정착액으로 이동합니다. </li><li> 4에서 (ON) 하룻밤 사이에 품어 ° C. </li></ol> 파트 II <ol start="8"><li> 정착액을 취소하고 PBT와 pupae 세 번 5 분마다을 씻는다. 얼음 한물간 pupae 보관하십시오. </li><li> PBT와 해부 접시 두 우물을 채웁니다. 우물 중 하나에 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫 송금 여러 pupae 사용하기. </li><li> 두 번째로 잘 한 번에 하나의 번데기를 이동합니다. 날개의 투명한 pupal 표피 보지, 완전히 일직선 조언과 날카로운 집게의 두 쌍을 사용 포셉의 잘 사용 일쌍 바닥에 번데기를 보호하고 부드럽게 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여 표피를 찢어. 일단 표피가 그걸 벗겨 날개 떨어져, 찢겨있다. 번데기에서 날개를 분리하지 않도록주의하십시오. 날개 날개의 표피를 벗겨내는 후에 날개 경첩 (여기서 날개 ChOs이있는)의 표피를 필링 계속합니다. </li><li> 날개 표피를 벗겨내 후, 하나는 유사한 방식으로 다리의 표피를 벗겨내는 시도할 수 있습니다.많은 다리는 과정에서 손실될 가능성이 있지만, 크게 다리 ChOs의 염색법을 향상 때문에 낮은 수확량에도 불구하고,이 단계는 것이 좋습니다. haltere과 복부의 ChOs 추가로 표피를 벗겨내는 않고 시각이 될 수 있습니다. </li><li> 메탄올로 가득 Eppendorf 튜브에있는 &#39;벗겨&#39;번데기를 놓고 실온에서 보관. 모든 pupae의 표피를 벗겨내는 계속하고, 같은 튜브에 추가합니다. 최소 10 멋지게 벗겨 pupae은 각 염색법으로 수집해야한다. </li><li> 메탄올을 제거하고 95 % 에탄올로 세 번 5 분마다을 씻는다. 고정 pupae는 -20 ° C.에 95 % 에탄올에서 오랜 기간 동안 보관하실 수 있습니다 </li></ol> 3. 애벌레와 Pupae의 Immunostaining <ol><li> 상온에서 PBT 세 번 30 분 각과 고정 조직을 씻으십시오. 애벌레는 회전 접시 부드러운 진동으로 씻어 수 있습니다. Pupae는 떨지 않고 씻어있다. </li><li> 차단 버퍼 (와 PBT 교체 PBT + 5% Normal 염소 혈청)과 4에서있는 품어 ° C. </li><li> 차단 버퍼를 제거하고 4 번 ° C. 켜져 일차 항체 (버퍼를 차단에 희석)로 품어 </li><li> 3.1 단계에서 설명한대로 PBT로 네 번 씻으십시오. </li><li> 4 ° C.에서있는 이차 항체와 PBT 및 품어을 (버퍼를 차단에 희석)를 제거 </li><li> PBT로 두 번 씻어 한 번 PBS와 같은 단계를 3.1에서 설명한. </li><li> 설치 매체 (Dako 형광등 장착 중간 (Dako Cytomation, Glostrup, 덴마크) 및 4에 품어 ° C에서 ON으로 PBS를 교체합니다. </li></ol> 4. 애벌레의 마운트 <ol><li> 애벌레들은 표피가 아래로 향하게 및 신체 벽의 근육이 최대 직면한로 장착 미디어의 한 방울의 현미경 슬라이드에 탑재하고 있습니다. 깨끗한 커버 슬립에 장착 매체의 작은 방울을 넣고 준비를 충당하기 위해 그것을 사용합니다. 마운트 애벌레에 어떤 압력을 적용하지 마십시오. </li></ol> 5. Pupae의 마운트 <ol><li> 이 현미경 슬라이드 준비설치 매체, 해부 용과 설치를위한 두 번째의 낙. </li><li> 슬라이드 하나에 여러 pupae 입어. </li><li> 사용하기 스프링 가위는 머리와 복부의 후부 부분을 제거합니다. </li><li> 날개와 다리 사이로 절단하여 복부 이분의 일로부터 흉부의 지느러미 절반을 분리합니다. </li><li> 장착 솔루션의 방울에서 두 번째로 현미경 슬라이드에 번데기의 해부 시체 조각을 놓으십시오. 날개와 다리가 밖으로 뻗어 있는지 확인하고 조직의 오버레이 가능 한한 최소화하려고합니다. </li><li> 커버 슬립에 장착 매체의 방울을 넣은 샘플을 가져 오십시오. 탑재된 샘플 압력을 적용하지 마십시오. </li></ol> 6. 대표 결과 셋째 instar의 유충의 immuno-스테인드 ChOs의 예제는 그림 1에 표시됩니다. 이 예제는 8 ChOs 일곱 명확하게 표시되는 멋지게 뻗어 복부 세그먼트를 보여줍니다. 뉴런은 실험실입니다MAb22C10 (아이오와 대학에서 발달 연구 하이 브리 도마 은행에서 얻은 1시 20분,)로 eled;. 캡, 인대, 캡 부착 및 인대 부착 세포는 안티 - αTub85E (1시 10분, 클라인 외,으로 표시됩니다 2010). 형광 염색법을위한 차 항체는 Cy3 또는 Cy5-복합 anti-mouse/rabbit (1:200, 잭슨 Immunoresearch 연구소)했다. 샘플은 공촛점 현미경 (LSM 510 자이스 혈구)을 사용하여 조회되었습니다. 35 시간짜리 번데기의 복부 요골 정맥의 날개 ChOs의 클러스터는 그림 2에 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> 그림 1은 단일 채널 기관을 구성하는 여섯 가지 세포 유형의 () 도식 그림 :. 캡 첨부 (CA), 캡 (C) scolopale (S), 신경 세포 (N), 인대 (L)과 인대 부착 (라 ). 다섯 ChOs가 클러스터된되는 LCh5 오르간은, 가로 가로 근육의 그룹 (LT 가로질러 뻗어있다1-4). 가로 세로 근육 (LL1), 복부 세로 근육 (VL1-4)와 측면 경사 근육 (LO1)도 그림하고 있습니다. 힘줄 세포는 갈색 분야 (클라인 외., 2010에서 가져온)로 그림한다. (B) 제 3 instar의 유충 중 하나는 복부 세그먼트 10X 배율로하셨습니다. 각 복부 세그먼트에있는 8 ChOs 중 일곱은 분명 위치 : 함께 pentascolopidial 기관 (LCh5), 하나의 측면 오르간 (LCh1) 두 복부 ChOs (VChB) 중 하나를 형성 다섯 측면 기관. ChOs의 뉴런 (N)는 마커의 연결 MAb 22C10 (적색)으로 표시됩니다. 인대 (L), 캡 (C) 및 부착 세포 (LA, CA)를 함께 분류되는 백신 αTub-85E (파란색). 뚜껑과 인대 세포가 추가로 데이 현장 (Nachman 외., 게시되지 않은 데이터)에서 규제 요소를 품고 조 특정 GFP 기자으로 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> 그림 2. </strong&gt; 복부 요골 정맥의 날개 chordotonal 장기는 40X 배율로 볼 수 있습니다. 뉴런 (N)은의 연결 마커 22C10 (빨강, B)으로 표시됩니다. 인대 (L)과 캡 (C) 세포 백신 αTub85E 항체 (블루, C)과 조 특정 GFP 기자 transgene (Nachman 외., 게시되지 않은 데이터)와 공동으로 분류됩니다.

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	<li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila.">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li><li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants.">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li><li>Eberl, D. 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E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes.">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li><li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ.">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li><li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors.">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 동영상에서 설명하는 프로토콜은 애벌레와 pupal 단계 동안 고유 ChOs을 시각화하는 방법을 제공한다. 고유 ChOs의 구조 및 개발에 관한 연구는 지금까지 주로 배아 단계와 애벌레 imaginal 디스크로 제한되었습니다. 따라서 애벌레와 어른 모두 ChOs 개발 후기 단계의 여러 측면은 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. Drosophila에서 흔히 유전 도구와 결합하여 설명한 프로토콜은, 새로운 유전자 및 ChOs 개발의 후기 단계에서 역할을 경로를 파악하고 공부할 이용하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 쵸의 시각화에 최적화되었지만, 그것은 그러한 pupal 날개 6 등 다른 조직의 염색법에 맞게 조정 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 도구의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 (또는 # 55) 포셉, biologie 팁 </td><td> FST </td><td> 11252-20 또는 11252-10 (또는 이와 유사한 포셉) </td><td></td></tr><tr><td> 아우 스터 리츠 스테인레스 스틸 곤충 핀, minutiens 0.1mm </td><td> Roboz 외과 악기 공동 </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> DOW 코닝 주식 회사 </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas 마이크로 가위 (스트레이트, 7.5 cm, 블레이드 3mm) </td><td> Mdeizintechnik 게엠베하 AS </td><td> 11-590-00 </td><td> 동일한 사양 Vannas 봄 가위는 Roboz 외과 악기 (주)에서 구입하실 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 - Rotamax-120 </td><tD&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako 형광등은 매체를 마운트 </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, 덴마크 </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS 제제 </td><td colspan="2"> 이 GR / 조명 KCl, 2 GR / 조명 KH 2 PO 4, 80 GR / 문학 NaCl, 21.7 GR는 / 나 두 HPO4.7H 2 O을 비추 </td><td> PBS의 품질은이 프로토콜의 성공을 위해 중요 </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0.1 % 십대 초반 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of proprioceptors in drosophila larvae and pupae

Proprioception은 몸 안에서 발생하는 자극에 반응하여 신체 부위의 움직임이나 위치를 감지할 수있는 능력입니다. fruitflies와 다른 곤충에 proprioception는 chordotonal 기관 (ChOs) 2 되나 특별한 감각 기관에 의해 제공됩니다. Drosophila의 많은 다른 기관들과 마찬가지로 ChOs는 플라이의 수명주기 동안 두번 개발할 수 있습니다. 첫째, 애벌레 ChOs이 embryogenesis 동안 개발할 수 있습니다. 그런 다음, 성인 ChOs는 애벌레 imaginal 디스크에서 개발하고 변형하는 동안 차별화하는 데 계속해서 시작합니다. embryogenesis 동안 애벌레 ChOs의 개발은 광범위하게 10,11,13,15,16 연구되었습니다. 각 조의 중심은 신경 세포와 scolopale 세포들로 구성된 감각 단위입니다. 감각 단위 1,9,14 전문 표피 부착 세포를 통해 표피에 연결 액세서리 세포의 두 종류 사이에 뻗어있다. 언제 파리 유충 이동, 전자의 상대 변위pidermal 첨부 전지는 감각 유닛과 dendrite 8,12의 바깥 부분에서 구체적인 일시적인 수용체 잠재적인 vanilloid (TRPV) 채널의 논리상 필연의 개통으로 스트레칭이 생깁니다. elicited 신호는 다음 중추 신경계에서 전위의 중앙 패턴 발생기 회로로 전송됩니다. 여러 ChOs은 성인 플라이 7에 설명되어있다. 이들은 성인 플라이 appendages (다리, 날개 halters)의 관절 부근과 흉부와 복부에 위치하고 있습니다. 또한, ChOs 여러 수백 총칭 기계 에너지 3,5,17,4에 해당 transduce의 음향 성인 안테나에 존스턴의 장기를 형성하고 있습니다. 배아 단계의 ChOs의 개발에 관한 광범위한 지식와는 달리, 거의가 애벌레 단계 동안 이들 장기의 형태에 대해 알려져 있습니다. 또한, 대퇴 ChOs의 예외 18 존스턴의 오르간과, 우리 knowled성인 파리의 ChOs의 개발과 구조에 대한 GE는 매우 단편적인 것입니다. 여기는 세번째 instar의 애벌레와 pupae의 ChOs를 더럽히는 것하고 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 더 나은 형태와 특징 및 플라이의 다양한 ChOs의 발전을 이해하는 유전자 도구를 함께 적용할 수 있습니다.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

의 유충과 pupae에 chordotonal 장기 immunostain하고 시각화하는 방법<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;이 설명되어 있습니다.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

12.0K 조회수.  Technion-Israel Institute of Technology. 의 유충과 pupae에 chordotonal 장기 immunostain하고 시각화하는 방법 Drosophila melanogaster이 설명되어 있습니다.

비디오: Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

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Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

연구

신경과학

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

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The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

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Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

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In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

에 Appetitive 연관 강한 학습<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

대한 꼴 경로 길이 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 애벌레

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

콜드 통각에 대한 소설 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

의 Proprioceptors의 시각화

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Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

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에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법

에 Appetitive 연관 강한 학습

에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동

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