이 작품은에 의해 지원되었다 새 탐정 그랜트 [2014R1A1A1005553] JIL에 한국 연구 재단 (NRF)에서; 와 연세대 학교 미래 리더 챌린지 그랜트 [2015-22-0133] JIL에

1. NGT-3D 및 NGB-3D를위한 솔루션을 준비 <ol><li> 다음 멸균 솔루션을 준비 : 0.1454 M NaCl 용액 1 L, 1 M CaCl2를, 1 M 황산 1 L 1 L, 원성 국물 (LB), KH 2의 1 M KPO 4 버퍼 (108.3 g 1 L PO 4 및 K 2 35.6 g HPO 4, H 2 O 기입 L 1). 이러한 솔루션을 사용 NGM의 제조 이전 프로토콜 (10)에서 찾을 수있다. </li><li> 121 ° C, 15 분에서 오토 클레이브 솔루션을 제공합니다. </li><li> 멸균 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 50 ㎖를 준비합니다. 한 50㎖ 원추형 튜브에 콜레스테롤의 0.25 g 및 99.99 % 에탄올 50ml를 혼합하고 잘 혼합한다. 오토 클레이브하지 마십시오. 0.45 μm의 주사기 필터로 50 mL를 주사기를 사용하여 콜레스테롤을 살균 용액. 이것은 또한 어떤 용해되지 않은 콜레스테롤을 제거합니다. </li><li> 2&#39;- 데 옥시 -5- fluorouridine (FUdR) 주식의 150 mM의 10 ㎖를 준비합니다 (선택 사항). 15 ml의 원추형 튜브에, 0.3693 g을 혼합FUdR 증류수 10 ㎖의. 잘 흔들어. </li></ol> 2. NGT-3D 및 NGB-3D에 대한 박테리아 문화를 준비합니다 <ol><li> 박테리아 10 ml의 LB 배지에 접종. 공급 C. elegans의 사용되는 표준 박테리아는 대장균 OP50이다. </li><li> 문화 밤새 진탕 배양기에서 37 ° C에서 세균 접종. </li><li> 일련의 희석에 대비, 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 NaCl 용액의 나누어지는 9 ml의. 예를 들어, 7 개의 튜브에 분취 9 ml의 OP50 균주 E. 콜라이의 10-7 희석을한다. </li><li> NaCl 용액의 9 ml의 멸균 새로운 튜브에 멸균 1,000 μL 피펫, 피펫 세균 배양 1 ml의 희석 세균 배양를 사용하여 잘 10 ml의 혼합물을 소용돌이. 원하는 박테리아 희석에 도달 할 때까지 반복합니다. 주 : 원하는 박테리아 희석 종류 및 조건 세균뿐만 아니라 정확한 실험 조건에 의존한다.예를 들어, 10-6 - 6.5 ml의 NGT-3D 튜브 당 200 세균성 식민지 - OP50 변형 대장균의 10-8 희석는 1 생산하기에 충분했다. 웜 확실 개발 콜로니 수 × 10-6의 희석에서 발생하는 60 때 정상적으로 재생 - 10-7. NGB-3D를 들어, 10-8의 희석을 사용합니다. </li></ol> 3. 만들기 NGT-3D 및 NGB-3D (200 ㎖) <ol><li> 박테리아 배양을 제조 한 후, 0.6 g의 NaCl 1 g의 과립 한천, 및 500 mL의 플라스크에서, 0.5 g 펩톤 섞는다. 플라스크에 자기 교반 막대를 삽입합니다. </li><li> 195 ml의에게 증류수를 추가하고 알루미늄 호일로 플라스크의 입 커버. </li><li> 15 분 동안 오토 클레이브에서 121 ° C. </li><li> 저어 접시에 뜨거운 멸균 플라스크를 놓고, 적어도 2 시간 동안 적당한 속도로 교반한다. 40 ° C까지 플라스크를 냉각. 완성 된 한천의 흐리게 될 수 있습니다 여기에 고온에서 지속적으로 충분히 냉각해야합니다.그러나, 낮은 온도는 한천의 조기 경화의 원인이 될 수 있습니다. <ol><li> (선택 사항), 냉각 프로세스의 속도를 저어 접시에 배치하기 전에 40 ° C의 물 목욕 15 분에 플라스크를 배치합니다. </li></ol></li><li> 한천 매체의 온도가 40 ℃에 도달하면, 용액은 교반 계속되고, 200 ㎕의 1 M CaCl2를 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 200 ㎕를 200 ㎕의 1 M 황산 5 mL의 1 M KPO 4 버퍼를 추가 1 mM의 염화칼슘 2, 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤, 1 mM의 황산, 1 mM의 KPO 4의 최종 농도. <ol><li> NGT-3D 수명 분석을 위해 (선택 사항) 120 μM (12)의 최종 농도 150 mM의 FUdR의 80 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 직접 플라스크에 단계 2.4에서 박테리아 문화를 희석하여 10 ml의 6 ML을 추가합니다. <ol><li> , NGT-3D (선택 사항) 단계 3.6 전에 한천 미디어의 6 mL로 분리하여 따로 따뜻한 유지. 이 매체는 사용할 수없는 것이다 세균최상층. </li></ol></li><li> 무균 절차를 이용하여, 무균 배양 챔버에 미디어 분배. 확인 챔버의 커버가 단단히 종료합니다. <ol><li> (선택 사항), 한천의 표면에 형성되는 세균성 식민지를 방지 3.7 완전히 경화 단계에서 용지 전에 상단에 단계 3.6.1에서 박테리아가없는 한천 미디어의 층을 확인하십시오. 이 NGT-3D의 상단에 박테리아가없는 영역을 생성합니다. </li><li> NGT-3D를 들어, 박테리아 한천 층을 조심스럽게 얇은 세균 -을 만들기 위해 반경 화 3D 미디어의 상단에있는 박테리아가없는 미디어 200 μl를 분배하는 8 ml의 투명한 플라스틱 시험관에 6.5 ml의 미디어를 부어 상단에 자유 층. </li><li> NGB-3D를 들어, 25cm 2 투명한 플라스틱 세포 배양 병에 미디어 65 ml에 붓는다. 이 금액은 25cm 2 세포 배양 병의 본문을 작성해야합니다. </li></ol></li><li> 박테리아 콜로니가 성장하도록 일주일 수직 상온 챔버 남기기적어도 1mm 직경의 상당한 크기. <ol><li> NGT-3D의 수명 분석을 위해 (선택 사항), 알루미늄 호일 커버 챔버 FUdR의 빛 저하를 방지 할 수있다. </li></ol></li></ol> NGT-3D (상대 브루드 크기 분석)에 대한 웜 인구의 4 측정 휘트니스 <ol><li> 선택과 세균이없는 NGM 접시에 전송 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜을 선택합니다. 웜은 자유롭게 몸에 부착 된 세균을 제거하는 몇 분 동안 이동할 수 있습니다. </li><li> 단계 4.1를 반복하고 웜이 박테리아에서 무료로 있는지 확인하십시오. 일반적으로, 4.1이 반복 충분하다. </li><li> 조심 백금선 픽업과 3D 매체의 표면에 깨끗한 웜 놓는다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다. </li><li> 커버 느슨하게 일부 공기가 튜브로 얻을 수 있지만, 한천 매체 건조 방지습니다. </li><li> 20 ° C에서 96 시간 동안 품어. </li><li> 사일 후 단단히 뚜껑을 닫고 두는88 ° C의 물을 욕조에 NGT-3D 문화 챔버는 한천을 녹여합니다. 열은 벌레를 죽이는 그러나 그들의 몸은 그대로 유지됩니다. 참고 : NGT-3D에 8 ㎖의 튜브 사용은 20 - 30 분 배양은 일반적으로 충분합니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 9cm 플라스틱 페트리 접시에 용융 미디어 옮긴다. 벌레가 자주에 충실 수있는 플라스틱 피펫은 권장되지 않습니다. </li><li> 송신 스테레오 해부 현미경을 사용하여, L3, L4에 웜 및 성체 단계의 개수를 카운트. F1을하고 F2 세대가 여기에 혼동 될 수 있으므로, L2 단계 이하이다 벌레를 계산하지 마십시오. 따라서, 이러한 분석은 상대 브루 크기 분석보다는 전체 브루 크기 분석이다. </li></ol> 5. 이미지 및 기록 웜 동작 NGB-3D에 <ol><li> 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜 선택 선택하고 박테리아가없는 NGM 판에 전송하고 자유롭게 몇 분 동안 이동할 수 있도록하여 표면에 붙어있는 박테리아를 제거합니다. </li><li> 단계를 반복 5.1 하시다 확인하십시오RM은 박테리아에서 무료입니다. </li><li> 조심스럽게 백금 와이어 픽와 병의 목 근처 NGB-3D의 한천 표면의 중심에 클린 웜을 배치합니다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다. </li><li> 한천 미디어의 건조를 방지하면서 덮개가 느슨하게, 약간의 공기가 튜브에 들어갈 수 있도록 닫습니다. </li><li> 이미지 또는 전송 스테레오 해부 현미경 벌레를 기록합니다. 웜은 3D 매트릭스를 통해 이동으로 초점을 조절합니다. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

고전 선충류 성장 미디어 판을 사용하여 선충의 실험 재배가 제공 한 C. elegans의에서 연구 중요한 발견의 수백에 매우 중요했다. 여기, 우리는 더 정확하게 자연 입체 서식지를 반영하는 환경에서 C. 엘레을 육성하기 위해 새로운 방법을 제시한다. 다른 방법 3D 13 C. 엘레을 관찰하기 위해 사용되었지만, 이는 고체 차원 매트릭스 웜의 재배를 허용하는 제 1 프로토콜이다. 여기에 표시된 두 가지 방법, NGT-3D 및 NGB-3D는 과학자 이미지도 3D 재배 피트니스, 발전과 성장의 문제 등을 요청하고 3D로 벌레를 기록 할 수 있습니다. NGT-3D 및 NGB-3D 표준 2D NGM 플레이트에 약간의 차이가 있지만, 그들은이 원래의 방법과 유사한 만 z 축에 웜 재배를 추가하도록 조정한다. 따라서, 우리는 개발, 불임 및 수명이 우리의 조건에서 정상적으로 진행 것을 찾을 수 있습니다. 그만큼목표는 실험실 연구를 위해 사용 할 수있는 프로토콜을 만드는 것이 었습니다. 이러한 방법들은 매우 낮은 비용으로 쉽게 재현 매우 간단하고, 사용자의 특정의 실험에 맞게 프로토콜의 조정을 허용한다. 프로토콜의 모든 단계가 중요하지만, NGT-3D 및 NGB-3D를 만드는 중요한 단계는 프로토콜의 3.6 단계 3.4 오토 클레이브 후 한천의 냉각 온도이다. 온도 (40 ℃ 이하 몇도) 너무 낮은 냉각하면, 한천은 강화하기 시작하고 추가 된 솔루션은 한천에 적절하게 혼합되지 않습니다. 냉각이 불충분 (40 ° C 위 몇도) 인 경우에는, 추가 된 박테리아 죽을 수 있고, 콜레스테롤 첨가 액 실험 쓸모 한천 렌더링 한천을 흐리게 할 수있다. 또한,주의의 영역 단계 4.6입니다. 수조에서 NGT-3D 한천을 용융 할 때, 용해에 도움을 단단히 뚜껑을 닫고해야합니다. 그러나, 열이 발생할 수 있습니다모자는 위험 오프 &quot;팝업&quot;과 발사체가 될 수 있습니다. 안전을 위해이 물에 목욕을 커버하는 것이 가장 좋습니다. 프로토콜의 많은 부분은 사용자에게 매우 융통성이다. 예를 들어, 우리는 NGT-3D에 대한 명확한 플라스틱 테스트 튜브와 NGB-3D에 대한 25cm 2 투명 세포 배양 병 (65 ml의 총 보유) 사용하고 있습니다. 사용자가 이용할 명확 튜브 또는 병의 다른 유형도 작동한다. 또한, 박테리아의 성장을 조절할 수 있습니다. 대장균 균주 OP50는 일반적으로 실험 선호했다 적어도 1mm로 성장 주일 정도 걸립니다. 우리의 경험에 의하면, 박테리아 약간 짧고도 더 이상 성장 시간은 웜 성장 또는 생식 능력에 영향을 미칠하지 않는 것. 한천의 농도 조정은, 그러나, 웜의 움직임에 영향을 미칠 것이다. 한천의 낮은 농도는 수영 같은 움직임을 나타내는 웜 결과, 높은 농도는 전체 이동을 방지 할 수있다. NGB-3D에 관심의 한 영역 결로의 문제였다물 축적. 따뜻한 액체 한천 견고로서 불가피 축합 특히 병 및 한천의 계면에서 시간이 지남에 발생한다. 이 수영 액체 (14) 동작과 액체가 병에 걸쳐 확산 될 수 박테리아의 성장을 도시 웜, 문제를 제기 할 수있다. 결로 방지가 곤란하다. 두 가지 구제 수단이 존재한다. 먼저 웜이 쉽게 병의 목에서 한천 표면의 중심에 배치하여 한천을 입력 할 수 있음을 확인. 둘째, 우리는 의도적으로하여 식민지가 액체와 한천의 계면에서 성장하는 기회를 감소, NGB-3D 낮은 세균의 농도를 유지한다. 또 다른 관심사는 NGB-3D 웜의 영상입니다. 3D 웜의 이미지의 선명도와 품질을 높이기 위해 식민지는 표면에 가까워 야하지만 완전히 한천에 포함 된 상태로 유지됩니다. 우리는 표면 처 근처 만 포함 된 식민지를 성장하는 시도표면에서 박테리아 - 함유 배지의 얇은 층을 배치하고, 나머지 매체에 의한 CE 세균 부담이었다. 그러나, 문제는 완전히이 방법으로 해결되지 않았다. 대신, 우리는 한 번에 많은 NGB-3D 병을 생산하여 웜이 표면 근처의 식민지로 이동 될 가능성을 증가, 표면에 가까운 식민지를 내장 포함 만 사람을 사용하기로 결정했다. 우리가 탐구하지 않은 하나의 옵션은 우리가 여기에 사용 과립 한천 이외의 행렬에 고체 미디어를 변화하고 있습니다. Z 축 방향으로 웜을 묘화하는 것도 어려울 수있다. 우리는 수동으로 제기하고 거친 초점을 절감하여이 작업을 수행하지만, 자동화 된 추적 프로그램이 존재하는 경우, 그것은 아주 도움이 될 수 있습니다. 희망은 3D로 선충의 배양을 위해 여기에 제시된 기술이 널리 선충의 생물 학자에 의해 사용될 것입니다. 많은 질문을 3D로 노화와 행동을 포함하여 웜 생물학, 대한 남아, 과학자들은 것에 준수 여부2D는 3D로 웜 관련이 있습니다. 실제로 NGT-3D를 이용한 이전 연구는 3 차원 배양은 2 차원 환경 9 정상적으로 재생 관능 돌연변이에 있다고 생식 체력에 미치는 영향을 보여 주었다. 또한, 한 연구에서는 15 2D에 비해 3D에서 변경 운동 행태를 보였다. 마지막으로,이 시스템은 특정 조건 변이체 또는 조작이 네이티브 차원 환경에서 동물에게 체력 이점을 부여하는지 여부의 질문에 응답하기 위해 사용될 수있다.

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades1. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 19982, and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level3-5. 
C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria6. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory. 
To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short9. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates10. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ. 
In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>224620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>DAEJUNG</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td>58.44 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, dihydrate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CD0050</td>
			<td>2*H2O; 147.02 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CD0122</td>
			<td>386.67 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>B&#38;J</td>
			<td>RP090-1</td>
			<td>99.99%; 46.07 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MN1988</td>
			<td>120.37 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td>136.09 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#39;-Deoxy-5-fluorouridine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D2235</td>
			<td>246.19 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0447</td>
			<td>174.18 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Purpose Test Tubes</td>
			<td>Stockwell Scientific</td>
			<td>ST.8570</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube Closures</td>
			<td>Stockwell Scientific</td>
			<td>ST.8575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>SPL Lifescience</td>
			<td>70125</td>
			<td>25 cm^2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Definition Color Camera Head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Fi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-Based Control Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS32000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of caenorhabditis elegans in three dimensions in the laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

NGT도 3d의 구조는 한천 (도 1a)에 걸쳐 이격 된 작은 박테리아 콜로니 한천 채워진 시험관 결과 단순하고 간단한 프로토콜이다. 웜 자유롭게 세균성 식민지를 발견하고 소비, 한천 매트릭스를 통해 이동할 수 있습니다. C. elegans의 재현과 NGT-3D 정상적으로 성장할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 다산과 표준 2D NGM 플레이트와 3D의 애벌레 개발을 비교 하였다. 상대 무리 크기 분석에서, 성인 C. 세균 식민지가 적어도 60 식민지 (그림 1B)와 풍부한 경우 NGT-3D로 자웅 동체 표준 2D NGM 판에있는 자웅 동체로 단지뿐만 아니라 재생 엘레 간스. 또한, NGT-3D의 애벌레 개발도 96시간 (그림 1C) 후 성인 상태에서 웜의 대부분과 세균성 식민지의 많음이있을 때 일반적으로 진행된다. 그러나, 세균성 식민지는 부족한 경우3 차원 매트릭스에 상대 무리 크기 (그림 1B, 왼쪽 막대)와 애벌레 개발 (그림 1C, 왼쪽 줄) 모두에 부정적인 영향을받습니다. 3D에 거주 웜의 장기 생리에 어떤 영향이 있는지 여부를 테스트하기 위해, 우리는 NGT-3D 및 NGM 판을 비교하는 수명 분석을 실시했다. NGT-3D에 웜의 평균 수명은 표준 NGM 플레이트 14.8 ± 3.1 일에 비해 15.6 ± 3.6 일이었다. NGT-3D 및 NGM에 사는 벌레의 수명 곡선은 거의 동일했다. 따라서, 웜 3D 및 2D 조건에서 동일하게 생존 보인다. NGB-3D를 제조하는 것은 어렵지 않다 및 그림 2A에서 본 것과 같은 명확한, 한천 가득한 문화 병 발생한다. 쉽게 OP50에서 우리가 deoxyviolacein, 어두운 보라색 세균의 대사 산물 (11)를 표명 한 세균 식민지를 보려면변형 대장균 (도 2A, 2B, 요청에 사용할 주). 라이브 웜 송신 입체 해부 현미경 (도 2B, 기업 영화 1) 아래에 묘화 될 수있다. 실온에서 NGT-3D 및 NGB-3D의 저장을 최대 1 개월이 배양 챔버의 양을 유지하기에 충분하다. 튜브 나 병에 맞는 플러그 형 또는 사형 캡이 적용되는 경우 한천의 탈수는 NGT-3D 또는 NGB-3D 중 하나에 대한 문제가되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55048/55048fig1.jpg" /> 그림 1 : NGT-3D에서 재배 C. elegans의 개발, 생식과 수명은 표준 2D NGM의 그것과 유사합니다. (A) 박테리아의 여러 희석에 NGT-3D의 이미지. 왼쪽과바로 5 × 10-7 희석을 포함하고, 중간은 1 × 10 -7 희석입니다. 미만 60 OP50 식민지 (N = 24)에 NGT-3D 야생 형 웜 (B) 상대 종족의 크기, 크거나 (60) 식민지 (N = 14), 또는 2D NGM 플레이트 (N = 29)에 동일. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 보다 크거나 60 식민지 같거나 2D NGM의 접시에 적은 60 OP50 식민지와 NGT-3D의 L3, L4 또는 성인 발달 단계에 F1 세대 웜 (C) 비율. NGT-3D 또는 NGM 판에 야생형 C. elegans의의 (D) 생존 곡선. NS 크게 다른 로그 순위 테스트에 의해 계산 나타냅니다. 이 수치는 리 9에서 수정되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/55048fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" srC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 55048 / 55048fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 : NGB-3D를 사용하여 3 차원 이미징 C. 엘레 간스. (A, B) NGB-3D의 이미지; 어두운 보라색 안료 deoxyviolacein을 표현 OP50 변형 대장균의 식민지 근처 성인 선충의 (C) 이미지. 스케일 바는 500 μm의입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/55048fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55048/55048supmov.jpg" /> 보충 영화 1 : 성인 선충은 NGB-3D의 식민지에서 대장균 OP50-violace 접근. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/Jove_Mov_1.mp4">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

우리는 NGT-3D 및 NGB-3D라는 3D 선충 재배 시스템을 구축하는 간단한 방법을 제시한다. 이러한 표준 2D 실험실 C. elegans의 배양 플레이트보다 자연 예쁜 꼬마 선충 서식지에 더 유사 서식지에서 선충의 체력과 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 재배<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 실험실에서 세 가지 차원에서

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

17.7K 조회수.  Yonsei University.  우리는 NGT-3D 및 NGB-3D라는 3D 선충 재배 시스템을 구축하는 간단한 방법을 제시한다. 이러한 표준 2D 실험실 C. elegans의 배양 플레이트보다 자연 예쁜 꼬마 선충 서식지에 더 유사 서식지에서 선충의 체력과 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 

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Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

연구

생물학

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual documentation of vocal fold vibration is challenging, particularly in non-human mammals. As an alternative, excised larynx experiments provide the opportunity to investigate vocal fold vibration under controlled physiological and physical conditions. However, the use of a full larynx merely provides a top view of the vocal folds, excluding crucial portions of the oscillating structures from observation during their interaction with aerodynamic forces. This limitation can be overcome by utilizing a hemi-larynx setup where one half of the larynx is mid-sagittally removed, providing both a superior and a lateral view of the remaining vocal fold during self-sustained oscillation.
Here, a step-by-step guide for the anatomical preparation of hemi-laryngeal structures and their mounting on the laboratory bench is given. Exemplary phonation of the hemi-larynx preparation is documented with high-speed video data captured by two synchronized cameras (superior and lateral views), showing three-dimensional vocal fold motion and corresponding time-varying contact area. The documentation of the hemi-larynx setup in this publication will facilitate application and reliable repeatability in experimental research, providing voice scientists with the potential to better understand the biomechanics of voice production.

This paper introduces a protocol for the preparation of hemi-larynx specimens facilitating a multi-dimensional view of vocal fold vibration, in order to investigate various biophysical aspects of voice production in humans and non-human mammals.

3 차원에 보컬 배 진동 연구 반의 laryngeal 설치

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

실험실 주택의 청록색 송사리 (Nothobranchius furzeri)에 대 한 프로토콜

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...