저자는 DFG (EXC-1003에서 MG까지)의 자금 지원을 인정합니다.

1. 세포 배양 <ol><li> 4.5g / L D- 글루코오스, L- 알라닌 -L- 글루타민 디 펩티드, 피루 베이트, 10 % 소 태아 혈청 및 10 유닛 / ml 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중의 HeLa 또는 COS 세포 배양. 0.5 mM L- 알라닌 -L- 글루타민 디 펩티드, 무 혈청 신경원 보충제 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 10 단위 / ml가 보충 된 L- 글루타민, 글루탐산 또는 아스파르트 산이없는 배지에서의 배양 뉴런. </li><li> 40 %의 confluency가 도달되면 제조 업체의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 선택의 구조로 세포를 transfect하십시오. 37에서 배양기에 transfected 세포를 유지 ° C와 5 % CO 2 15-18 시간. </li><li> 이미지 수집 중 산도와 삼투압의 변화를 줄이려면 37 ℃에서 미리 90 %까지 세포 배양 챔버를 채우십시오 (예 : 20 mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1) -1 (HEPES)를 포함한다. 밀봉뚜껑 안쪽에 얇은 진공 그리스를 묻혀 트랜 스펙 션 된 세포가 들어있는 배양기에서 가볍게 누릅니다. </li></ol> 2. 이미지 수집 참고 : filopodia의 길이는 2-10 μm에서 다릅니다. Filopodia는 0.05-0.1 μm / s의 평균 속도로 자랍니다 13 , 14 . <ol><li> 60X 또는 100X 대물 렌즈 및 픽셀 비닝 (여기서는 회전 디스크 공 촛점 현미경)이있는 현미경을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 골반 동역학을 추적하기 위해 1 헤르츠 (Hz) 이상의 수집 속도를 사용하십시오. 초점이 맞지 않는 아티팩트를 최소화하기 위해 기저막 ( 즉, 기판 표면)에 가까운 영상 필로 디아를 사용합니다. </li><li> 매끄러운 트래킹을 보장하려면 SNR (Signal to Noise Ratio)이 4 이상이되도록 카메라의 노출 시간과 레이저 강도를 조정하십시오. 개별 채널의 채도를 피하십시오 ( 예 :8 비트 이미지의 경우 255, 16 비트 이미지의 경우 65,535), 이후 이미지 분석이 어려워집니다. </li><li> 블리드 스루 (bleed-through)를 피하려면 현미경의 레이저 라인 및 필터와 호환되는 형광 태그 만 사용하십시오 (자세한 내용은 참조 15 참조). </li></ol> 3. 이미지 전처리 참고 : ImageJ 또는 다른 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 이미지 16 , 17 을 사전 처리하십시오. <ol><li> 샘플이 움직이는 경우 분석 전에 사용 가능한 소프트웨어 ( 예 : https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ)를 사용하여 측면 드리프트를 보정하십시오. 축 방향 드리프트가있는 동영상 제외 (예 : z 방향으로의 이동). </li><li> 올바른 배경 ( 즉 , 세포 외부 영역의 회색 값), 표백 (형광 단백질 손상으로 인한 형광 강도의 경우 연속적인 손실) 및 가능한 블리드 물마루 ( 즉 , 한 가지 독감orescence probe) ( 예 : http://imagej.net/Category:Plugins and 16 , 17 ). 참고 : 개별 채널의 형광 강도는 소프트웨어에 의해 변경되지 않습니다. </li><li> 후속 이미지 분석을 위해 특정 단백질 채널에 해당하는 영화를 그레이 스케일로 &#39;.tiff&#39;스택 파일 형식으로 작업 폴더에 저장하십시오. 참고 : 스택의 크기 ( 즉, 크기, 길이)는 모든 채널에서 동일해야합니다. </li></ol> 4. 이미지 분석 - 1 단계 : 이미지로드 참고 : 여기에 설명 된 소프트웨어는 Matlab (프로그래밍 소프트웨어라고 함)으로 작성되었으며이 프로그램에서만 실행됩니다. <ol><li> 다음 사이트에서 이미지 분석에 필요한 모든 파일이 들어있는 압축 폴더를 다운로드하십시오. https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softw아르/. 압축을 풀고 파일을 작업 폴더에 복사하십시오. </li><li> 일단 설치되면 프로그래밍 소프트웨어를 열고 &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;를 실행하십시오. 그림 2A 와 같이 GUI 창 # 1이 열립니다. </li><li> 단백질 A는 &lt;1b&gt;, 단백질 B는 &lt;1c&gt;, 단백질 C는 &lt;1d&gt; GUI 창 # 1에서 관심있는 특정 단백질에 해당하는 저장된 스택 &#39;.tiff&#39;파일을로드하십시오. 그림 2 및 표 참조 자세한 내용은 1 페이지 를 참조하십시오. 참고 : GUI 창 # 1에 표시된 단백질 A는 최종 비율 측정 분석을위한 참조 채널 역할을합니다. </li><li> &lt;1a&gt;를 클릭하여 단백질 채널에서 세포의 이미지를 겹쳐서 만듭니다. </li><li> &lt;2a&gt;를 클릭하여 첫 번째 프레임을 지정하고 &lt;2b&gt;를 분석에 사용 된 마지막 프레임으로 지정합니다. </li><li> 선택적으로, &lt;2h&gt; 버튼을 사용하여 원하는 대상자를 포함하는 관심 영역 (ROI)을 자르고, 이미지를노래 버튼 &lt;2i&gt;을 사용하거나 손으로 그리는 도구 &lt;2j&gt;를 사용하여 불필요한 영역을 삭제하십시오. 참고 : 이미지 분석을 간소화하려면 ImageJ를 사용하여 ROI (자르기, 회전, 삭제)를 다른 전처리 단계 (배경 빼기, 표백 수정 등)와 함께 격리하는 것이 좋습니다. </li><li> 품질 관리를 위해 각 프레임에 대한 슬라이더 &lt;2c&gt;를 이동하고 전체 영화에서 필로 드가 명확하게 보이는지 확인하십시오. </li></ol> 5. 이미지 분석 - 2 단계 : 추적 생성 <ol><li> GUI 창 # 1에서 &lt;3a&gt; 버튼을 클릭하여 GUI 창 # 2를 엽니 다 ( 그림 2B 참조). </li><li> GUI 창 # 2에서 &lt;4&gt; 버튼을 클릭하여 겹쳐진 셀 본문의 마스크를 생성하십시오 (&lt;1a&gt;를 클릭 한 후 GUI 창 # 1에서 생성됨). 또한이 프로그램은 마스크의 경계를 생성하며, 볼록 선체가 구현되어 정점을 얻습니다. </li><li> 클리ck 버튼 &lt;5&gt;; 커서가 나타납니다. 커서를 사용하여베이스를 선택하고 (여기에서 필립 드 팁의 거리를 측정 한 후), 처음 나타나는 프레임에서 필로 디아의 팁을 선택하십시오. 이렇게하려면 창 # 2에서 슬라이더를 움직입니다. 참고 : 데이터 출력의 오류를 최소화하려면 축을 따라 원위치를 filopodial 팁 아래에 수직으로 배치하십시오. 기준점을 다른 장소에 배치하면 ( 예 : 옆으로 이동) 세포체 내에서 형광 값에 방향성 편향이 생길 수 있습니다. </li><li> &lt;6c&gt;를 사용하여 문턱 길이를 선택하십시오. 참고 :이 길이는 기준점 (&lt;5&gt;를 사용하여 선택)과 세포체의 경계선 ( 즉 , 사상충증이 성장하기 시작하는 영역) 사이의 거리로 정의됩니다. 측정 거리는 픽셀 단위입니다. </li><li> &lt;6a&gt; 상자에서 유창 모양을 대략적으로 나타내는 데 사용되는 세그먼트 수를 지정하십시오. 참고 : m가장 많은 수의 세그먼트는 필로폰이 도달하는 최대 길이에 달려 있지만, 또한 필로소움이 어떻게 구부러 지느냐에 달려있다. 기본과 팁 사이의 픽셀 수보다 큰 세그먼트 수 ( 예 : 임계 길이)를 선택하지 마십시오. 5.4 단계에서 정의한 임계 길이보다 많은 세그먼트를 선택합니다. ( 즉, 베이스와 팁 사이의 픽셀 수)는 필로 피이드의 길이를 과대 평가하게됩니다. </li><li> &lt;6b&gt;에 노드를 놓을 수평 스캐너 역할을하는 스캔 너비를 지정하십시오. 참고 :이 노드는베이스와 팁을 filopodium의 본문에 연결하는 선에 맞게 프로그램에서 사용됩니다 ( 즉 , 백본을 만드는 데 사용됩니다). 출발점으로 최대 길이에 인수를 곱한 값을 픽셀 단위로 입력하십시오. <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> &lt;6d&gt; 상자에 스캔 반경 (픽셀 단위)을 지정하십시오. ob보다 약 50 % 큰 값을 사용하십시오.프레임 간 팁 이동을 제공했습니다. 참고 : 매우 큰 스캔 반경을 사용하면 실제 filopodial 팁이없는 프레임에서 원하지 않는 convex-hull 점을 얻을 수 있습니다 ( 예 : 평면 이동 또는 낮은 SNR). </li><li> &lt;6e&gt; 상자에 굽힘 각도를 지정하십시오. 참고 : 각도 임계 값은 전체 분석 중에 filopodium이 구부려지는 최대 각도로 결정됩니다. 각도 임계 값을 지정하면, 소프트웨어가 filopodia가 세포체쪽으로 구부러져있을 때, filopodia의 측면에서 성장하는 원치 않는 구조의 추적을 제외시키는 데 도움이됩니다. 이 프로그램은 세로 축에서 45도 미만의 기울기 각도를 가진 filopodia에 대해 안정적으로 작동합니다. </li><li> 추적을 시작하려면 GUI 창 # 2에서 &lt;트랙 및 분석&gt; 버튼을 클릭하십시오. 나중에 참조 할 수 있도록 전체 추적 프로토콜을 저장하려면 GUI 창 # 2에서 &#39;기록 추적&#39;상자를 클릭하십시오. 참고 : 추적 절차가 완료되면 각 프레임에서 필로폰의 길이가나중에 참조 할 수 있도록 &#39;dynamics.xlsx&#39;의 &#39;length_vel&#39;이라는 시트가 있습니다. 마찬가지로 다른 모든 추적 매개 변수는 &#39;dynamics.xlsx&#39;의 &#39;parameters&#39;시트에 저장됩니다. </li><li> 선택적으로, 모든 프레임에서 파일 아이콘이 자동으로 검색되지 않으면 다음 단계를 사용하여 수동으로 수정하십시오. <ol><li> 창 # 2의 슬라이더를 사용하여 각각의 프레임을 방문하여 수동으로 필로소움의 팁을 선택하십시오. 참고 : 볼록 선체 점이 발견되지 않은 프레임은 GUI 창 # 2의 추적 창에서 파란색 영역으로 표시됩니다. 해당 프레임의 노드 좌표에 액세스하기 위해 추적 프로그램이 시작되기 전에 &#39;기록 추적&#39;버튼을 선택해야합니다. </li><li> GUI 창 # 2에서 &lt;6f&gt;를 사용하여 참조 점 (밑면과 뒤끝)을 선택하십시오. &#39;스캔 길이&#39;, &#39;정확한 측정 후&#39;및 &#39;최대 굴곡 각도&#39;와 같은 다른 매개 변수를 지정하십시오.; 그 프레임에 대해서는 5.4-5.8 단계에 설명 된대로. </li><li> &lt;6i&gt; 버튼을 클릭하여 새 매개 변수 (해당 한 프레임에만 해당)를 저장하십시오. 파란색 영역으로 표시된 모든 프레임에 대해 단계가 반복됩니다. </li><li> 완료되면 &lt;7&gt;을 사용하여 추적 절차를 다시 초기화하십시오. 참고 :이 보정은 프로그램 내에서 영화 내에서 돌연변이가 갑자기 바뀌는 경우에도 사용할 수 있습니다. 대안으로, 여러 가지 사체를 포함하는 동영상 자르기를 고려하십시오. </li></ol></li></ol> 6. 이미지 분석 - 3 단계 : 시공간 단백질 분석 <ol><li> 시공간 분석을 위해 &lt;8b&gt;로 표시된 상자를 선택한 다음 관심있는 단백질 채널 (&lt;8c&gt; 및 / 또는 &lt;8d&gt; 및 &lt;8e&gt;)을 선택하십시오. 참고 : Protein A가 참조로 사용되므로 비율 분석 (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; 및 / 또는 &lt;9c&gt;) 전에 단백질 A를 선택해야합니다. </li><li> &lt;8a&gt;를 클릭하십시오.단계 5.9에서 생성 된 추적을 사용하여 유두 길이를 따라 단백질 추적을 시작합니다. </li></ol> 7. 이미지 분석 - 4 단계 : 비율 - 메트릭 단백질 분석 <ol><li> &lt;9b&gt; 또는 &lt;9c&gt; 확인란을 선택하고 &lt;9a&gt; 버튼을 클릭하여 시공간 비례 곡선을 얻습니다. 참고 : 상대 단백질 농도의 허위 진술을 피하기 위해 비율 계산 이미지는 X / Y로 표시되지 않고 log (X / Y)로 표시됩니다. 나중에 사용하기 위해 비율 그림은 &#39;.png&#39;및 &#39;.fig&#39;형식 파일로 내보내지고 원시 플롯 데이터는 &#39;dynamics.xlsx&#39;파일에 저장됩니다. </li></ol> 8. 이미지 분석 - 5 단계 : 유두 팁 분석 <ol><li> &lt;8f&gt; 확인란을 선택하고 &lt;8g&gt; 및 &lt;8h&gt;를 사용하여 밑면에서 팁 길이 및 임계 길이를 지정합니다. 데이터를 &#39;dynamics.xlsx&#39;파일에 저장하려면 &lt;누름 버튼&gt;을 클릭하십시오. &lt;Protein Intensities 분석&gt;을 클릭하여filopodial tip의 단백질 강도를 추적하고 Ratiometric 분석을 위해 저장합니다. 참고 : 팁 길이는 분석에 사용되는 팁의 픽셀 수를 결정합니다. 소프트웨어는 각 프레임의 끝 부분에있는 픽셀의 평균 밝기 값을 반환합니다. 임계 길이는 기지에서 필로움 (filopodial tip)이 자라기 시작하는 팁까지의 최소 거리를 결정합니다 (그리고 프로그램이 팁의 강도 값을 추적하기 시작할 때). 따라서 팁 길이는 임계 길이보다 작아야합니다. </li><li> &lt;9d&gt; 또는 &lt;9e&gt;를 사용하여 분석 할 원하는 비율을 클릭하십시오. </li><li> 비교 단추 &lt;9a&gt;를 클릭하여 비율 데이터를 생성하십시오. </li></ol>

<ol>
	<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li><li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+dendritic+spines:+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses.">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons.">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116 (2014).</li><li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis.">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li><li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction.">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization.">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).</li><li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models.">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li><li>Blum, H., Wathen-Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transformation+for+extracting+new+descriptors+of+shape.">A transformation for extracting new descriptors of shape.</a> Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. , 362-380 (1967).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion.">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li><li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking.">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li><li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension.">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li><li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+filopodial+protrusion.">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATtrack:+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells.">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).</li><li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus.">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li><li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li><li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization.">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li><li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility.">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuronGrowth,+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images.">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li><li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics.">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 우리는 철근 - 성장 알고리즘을 통해 이러한 동적 구조에서의 상대 단백질 농도 분석과 생식기 성장 역학을 추적하기위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 최대 3 개의 채널을 한 번에 쌍으로 비교할 수 있으므로 두 채널 ( 즉, 단백질)의 상대적 농도가 확장 / 수축 사이클 전체에서 결정되고 이미지 파일과 데이터 파일로 별도의 폴더에 저장됩니다. 일상적인 작업 외에도 소프트웨어는 각 실험에 대한 분석을 최적화하기 위해 수정할 수있는 많은 매개 변수를 제공합니다. 이러한 수정 및 문제 해결에 대한 자세한 설명은 프로토콜 섹션과 표 1 에서 확인할 수 있습니다. 이미지 분석은 특정 현미경 유형에 국한된 것이 아니라 시계열의 이미지 품질에 의해 제한됩니다. 관련성을 고려하면 이미지 품질은획득하는 동안 채널이 잘못되었습니다. 우리의 실험은 알고리즘이 40X 이상의 배율과 픽셀 비닝 (pixel binning)이없는 대물 렌즈를 사용하여 1Hz에서 획득 한 SNR&gt; 4 인 filopodia에 가장 잘 작동 함을 보여줍니다. 물론 이것은 fluorophores가 필터 설정과 호환되는 경우에만 적용됩니다 ( 즉 , bleed-through 없음, 자세한 내용은 프로토콜 섹션 2 참조). 상대 강도가 ​​서로 비교되는 것을 고려할 때, 분석은 개별 세포 사이의 절대 형광 신호 강도의 작은 차이에 민감하지 않습니다. 따라서 의미있는 데이터를 추론하기 위해 잘 정의 된 참조 채널 ( 예 : 세포질 마커)이 매우 중요합니다. 그러나 화질이 좋더라도 몇 가지 생물학적 한계가 있습니다. 예를 들어, 분기, 세포 표면에 직각 인 축으로부터 45도 이상 기울어 진 구조 또는 다른 대상이 조사중인 구조를 통과하는 구조를 분석하는 것은 적합하지 않습니다. &lt;이러한 실험적인 제한 외에도 프로토콜을 작동 할 때 고려해야 할 중요한 단계가 있습니다. 그렇지 않으면 오류 메시지가 표시 될 수 있습니다. 첫째, 특정 단백질에 해당하는 채널은 동일한 차원이어야하며 정확히 동일한 ROI를 나타내야합니다. 둘째, 누적 된 파일은 회색조 &#39;.tiff&#39;파일 형식이어야합니다. 세 번째로, 누적 된 이미지 파일은 작업 폴더에 있어야합니다. 마지막으로 작업 폴더에있는 데이터 파일의 이름을 코드에서 수정하지 않으면 변경되지 않아야합니다. 스크립트는 기존의 다른 메소드와 어떻게 비교됩니까? 우리의 이미지 분석 소프트웨어를 검증하기 위해, 우리는 최근에 발표 된 여러 가지 소프트웨어 솔루션을 다운로드하여 파일 포트의 특징 인 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 , 선택된 여러 기준을 모두 테스트했습니다. 자세한 비교는 표 2 에 나와 있습니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Tsygankov et al. </td><td> Barry et al. </td><td> Nilufar et al. </td><td> Fanti et al. </td><td> Constantino et al. </td><td> 헨 드리 - cusdottir et al. </td><td> Tarnok et al. </td><td> Saha et al. </td></tr><tr><td> 종이 DOI </td><td> 10.1083 / jcb.201306067 </td><td> 10.1083 / jcb.201501081 </td><td> 10.1186 / 1752-0509-7-66 </td><td> 10.1002 / 20206 년 </td><td> 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 </td><td> 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 </td><td> 10.1002 / cyto.a.22569 </td><td> 10.1091 / mbc. E16-06-0406 </td></tr><tr><td> 소프트웨어 (다운로드 링크) </td><td> http : //www.hahnlab. co.kr / tools / 그만큼 소프트웨어 페이지. HTML </td><td> http : // jcb-dataviewer. rupress.org/jcb/ 찾아보기 / 9059 / </td><td> http : //www.perkinslab .ca / pubs / NMLP20XX. HTML </td><td> http : //www.ifc. unam.mx/ ffm / download.html </td><td> http : // fournierlab. mcgill.ca/ 스타일 7 / fTracker.html </td><td> https : // fdynamics. wordpress.com/ </td><td> http : // cnblab. elte.hu/dfma </td><td> https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&amp;L=1 </td></tr><tr><td> 프로그램 유형 </td><td> Matlab </td><td> ImageJ </td><td> Matlab </td><td> ImageJ </td><td> Matlab </td><td> Matlab </td><td> ImageJ </td><td> Matlab </td></tr><tr><td> 조작 </td><td> 자동화 된 </td><td> 자동화 된 </td><td> 자동화 된 </td><td> 반자동 </td><td> 반자동 </td><td> 반자동 </td><td> 반자동 </td><td> 반자동 </td></tr><tr><td> 단일 대 배치 분석 </td><td> 양자 모두 </td><td> 양자 모두 </td><td> 단일 </td><td> 단일 </td><td> 단일 </td><td> 단일 </td><td> 단일 </td><td> 단일 </td></tr><tr><td> 전체 세포 vs. 부분 분석 </td><td> 완전한 </td><td> 완전한 </td><td> 양자 모두 </td><td> 양자 모두 </td><td> 양자 모두 </td><td> 보결 </td><td> 보결 </td><td> 보결 </td></tr><tr><td> 복수 대 개인적인 사상충 </td><td> 배수 </td><td> 배수 </td><td> 배수 </td><td> 배수 </td><td> 배수 </td><td> 인도 </td><td> 인도 </td><td> 인도 </td></tr><tr><td> 철학 ID 및 육안 검사 가능 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td&gt; 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 이미지 처리 가능 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 유두 길이 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 유두 세포 성장 역학 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 필로피 라이프 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 철학에서의 비율 분석 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 &lt;/ td&gt; </tr><tr><td> 출력 / 저장 형식 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td><td> 이미지 / 데이터 파일 </td></tr></tbody></table> 도표 2 : Filopodia 정량을위한 소프트웨어 이용한 심상 분석 해결책의 개관. 테스트 된 8 개의 분석 소프트웨어 솔루션 중 5 개는 Matlab을 통해 운영되었으며, 나머지 3 개는 ImageJ를 사용했습니다. 두 개의 소프트웨어 솔루션 ( 표 2 , 왼쪽)은 전체 세포에서의 섬유 길이, 생애 및 역학의 배치 분석을 위해 완전히 자동화되고 최적화되었습니다. 나머지 6 개의 소프트웨어 솔루션 중 5 개는 추가 수동 입력 ( 예 : 반자동)이 필요하고 하나는 완전히 자동화되었습니다. 그러나, 오직 th전자 반자동 솔루션은 섬유 생물 성장 역학, 수명 및 신원에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 나머지 5 명 중 3 명은 개별적인 섬유 유구 세포의 준 세포 분석에 최적화되어 있으며, 2 명은 여러 가지 유 사충을 동시에 처리 할 수 ​​있습니다. 중요한 것은 8 가지 테스트를 거친 모든 소프트웨어 솔루션에서 단 하나의 접근 방식만으로도 유두 생장 역학에 관한 정보를 이러한 손가락 모양의 구조 내에서 비율 측정 단백질 위치 파악과 결합 할 수있었습니다 ( 표 2 , 오른쪽). 우리의 이미지 분석 소프트웨어는 자동화 된 배치 또는 전체 세포 분석에는 적합하지 않지만 분리 된 filopodia의 정량화에는 단 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 따라서 우리는 40-50 건에서의 단백질 동력학의 정량화가 현재의 소프트웨어로 하루 안에 가능할 것이라고 생각합니다. 대조적으로, 높은 처리량의 스크린은 수천 개의 개별 filopodia의 입력과 저장을 능률화하기 위해 코드를 추가로 수정해야 할 수도 있습니다.방법. 필요한 매개 변수에 따라 다른 기존 소프트웨어 솔루션이 이러한 접근 방식에 더 적합 할 수 있습니다. 이러한 한계를 염두에두고이 소프트웨어는 세포 내 돌출 구조와 같은 시공간 단백질 농도를 조사 할 수있는 안정적인 플랫폼을 제공합니다. 철자가 유일한 손가락 모양의 세포 구조는 아니라는 것을 고려하면 제시된 이미지 분석 소프트웨어가 다른 생물학적 과정 ( 예 : 신경 돌기, 일차 섬모)에서 단백질 역학을 연구하는데도 적합하다는 것을 알면 그럴듯합니다.

actin 조절 단백질의 시공간 조절은 filopodium dynamics 1 , 2 와 관련이있다. 시간에 따른 전체의 유두 길이에 따른 공간적으로 분석 된 단백질 농도를 추적하는 것은 이러한 동적 구조의 개시, 신장, 안정화 또는 붕괴의 기초가되는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 증진 시키는데 중요하다 3 , 4 . 세포 모양의 변화가 더 큰 규모에서 일어나는 세포질에서의 단백질 분석과는 달리, filopodia는 끊임없이 5 번 굴곡하여 선형 주사와 같은 간단한 접근법을 사용하여 분석을 방해하는 동적 인 미세 구조이다. 유두 모양 추적을위한 다양한 소프트웨어 솔루션을 사용할 수 있습니다 6 , 7 , 8 , 9 . 유사성ise, 세포 동체 내에서 단백질 동역학의 비율 측정 용 소프트웨어가 개발되었습니다 10 , 11 . 우리는 철근 형상의 자동 추적과 시공간 단백질 분석을 결합하기 위해 최근에 convex-hull 알고리즘을 기반으로 한 이미지 분석 소프트웨어를 개발했습니다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 를 통해 작동하는이 새로운 분석 방법은 처음으로 유두 길이와 성장 속도에 따른 상대적 단백질 농도를 결합하여 이들의 움직임에 관계없이 시공간 단백질 분포의 정확한 측정을 가능하게합니다 동적 구조 12 . 소프트웨어의 아이디어 (소스 코드는 자유롭게 사용할 수 있습니다. 아래 참조)는 볼록 선체의 꼭지점 중 하나가 필리 포듐의 팁과 일치한다는 것입니다 ( 그림 1A ). 후속 프레임을 보면r은 convex-hull의 가장 가까운 꼭지점이며 움직이는 팁은 전체 영화에서 추적 할 수 있습니다. 일단 각 프레임에서 팁이 검출되면, 그 위치는 필로소움의 기저에있는 기준점과 팁을 결합함으로써 축을 그리는 데 사용됩니다 ( 그림 1B ). 마지막으로, 축에 직각 인 선을 따라 최대 강도를 갖는 중앙 픽셀에 의해 위치가 결정되는 등거리 노드 점을 사용하여 파일 포트 모양을 따르는 백본을 결정합니다. 이 adaptive backbone을 이용하여 kymograph가 생성되어 filopodial 길이 ( 그림 1C )를 따라 최대 3 개의 채널에 대한 filopodial 성장과 단백질 농도를 추적합니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> 그림 1 : 이미지 분석 소프트웨어의 작동 원리. ( A ) 뒤에있는 알고리즘소프트웨어 1 단계에서 사용자는 필로폰의 참조 (기본)와 꼭지점 (끝)을 지정합니다. 단계 2-1에서, 최대 강도 값을 갖는 중간 값 픽셀을 사용하여 필로폰의 백본을 얻는다. 3 단계에서 백본은 공간 단백질 강도 프로파일에 사용됩니다. 단계 2-2에서 소프트웨어는 자동으로 후속 프레임의 팁을 추적합니다. 전체 절차가 반복됩니다. ( B ) 추적에 사용되는 볼록 선체와 같은 중요한 요소를 소개하는 실제 사상 최고로 알고리즘의 스냅 샷. ( C ) 알고리즘으로 측정 할 수있는 매개 변수 개요. 이 숫자는 참고 문헌 12 에서 수정되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이미지 분석 소프트웨어는 그래픽 사용을 통해 Matlab (프로그래밍 소프트웨어라고 함)에서 작동합니다.r 인터페이스. 특정 실험 설정에 대한 유연성과 견고성을 극대화하기 위해 사용자는 일련의 추적 매개 변수 ( 예 : 허용 된 굽힘 각도 및 프레임 간 이동)를 조정할 수 있으며 영화 ( 예 : 자르기, 회전, 원하지 않는 객체 제거) ( 도 2a 및 표 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> 아니. </td><td> 필수 </td><td colspan="5"> 기술 </td><td> 이름 (GUI에서) </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1a </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 셀 본문을 나타내는 스택 된 .tiff 파일로드 (상자를 체크 인) 또는 채널에서 중첩 된 셀 본문 만들기 </td><td> CellBody </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1b </td><td> 와이 </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; 단백질 1에 해당하는 적층 이미지 파일로드 </td><td> 단백질 1 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1c </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 단백질 2에 상응하는 스택 이미지 파일로드 </td><td> 단백질 2 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1d </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 단백질 3에 해당하는 적층 이미지 파일로드 </td><td> 단백질 3 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1e </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 미리로드 된 이미지 파일에 대한 모든 것을 재설정합니다. </td><td> 다시 놓기 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2a </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> GUI 창 # 2에서 분석을위한 초기 프레임을 결정하기 위해 스크롤 막대 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2b </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> GUI 창 # 2에서 분석 할 최종 프레임을 결정하기 위해 스크롤 막대 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2c </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> curre를 나타내는 스크롤 막대NT 프레임 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2d </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 모든 픽셀이 0으로 설정되는 픽셀의 회색 값 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2e </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 모든 픽셀이 최대 값으로 설정되는 위의 픽셀의 회색 값 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2f </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> &lt;2e&gt; 및 &lt;2f&gt;에 지정된 픽셀의 강도 값을 설정합니다. </td><td> 세트 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2g </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 강도 조절 동영상 재생 </td><td> 놀이 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2 시간 </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 자르기 이미지 </td><td> 수확고 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2i </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 이미지 회전 </td><td> 회전 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2j </td><td> 엔 </td><td colspan="5">전체 스택에서 영역 삭제 </td><td> 영역 삭제 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 3a </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> &#39;분석 창&#39;(GUI 창 # 2)을 열려면 클릭하십시오. </td><td> 추적 창 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 3b </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 픽셀 크기를 미크론 단위로 입력하십시오. </td><td> 픽셀 크기 입력 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 중첩 된 셀 본문의 경계 / 가장자리 이미지를 생성하려면 클릭하십시오. </td><td> 경계 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 유두의 기저부를 클릭하여 선택하십시오. </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 세그먼트 또는 노드 수를 입력하십시오. </td><td> 세그먼트 수 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 스캔 길이 (축에 수직)를 입력하십시오. </td><td> 스캔 너비 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 철학이 굴곡을 시작하는 길이를 입력하십시오. </td><td> 정확한 측정 후 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 팁 감지 원의 반지름을 입력하십시오 (즉, 다음 프레임에서 정점이 지역화 될 수있는 영역) </td><td> 팁 감지 반경 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> filypodium이 수직 축에서 구부릴 수있는 최대 각도를 입력하십시오. </td><td> 각도 임계 값 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 해당 특정 프레임에 대한 기준점 및 기준점을 추가합니다. </td><td> 참조 선택 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6g </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 해당 특정 프레임에 대해 절곡이 시작되는 길이를 입력하십시오. </td><td> 정확한 측정 후 </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 특정 프레임에 대한 감지 원의 반지름을 입력하십시오. </td><td> 팁 감지 반경 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 특정 프레임에 대한 모든 매개 변수를 입력 한 후 추가 참조를 위해 값을 메모리 및 파일에 저장하려면 클릭하십시오. </td><td> 더하다 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 해당 프레임의 수동 매개 변수를 삭제하려면 클릭하십시오. </td><td> 지우다 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 모든 프레임에 대해 &#39;선택적 기능 패널&#39;을 사용하여 수동으로 저장된 모든 매개 변수를 삭제하려면 클릭하십시오. </td><td> 다시 놓기 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 추적 전에 모든 추적 결과를 메모리에 저장하여 나중에 참조 할 수 있도록하십시오. </td><td> 기록 추적 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> 와이 </td><td colspan="5"> 추적을 시작하려면 클릭하십시오. </td><td> 추적 및 분석 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 단백질 채널 강도 추적 시작하려면 클릭하십시오. </td><td> 단백질 농도 분석 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 유두 길이에 따른 단백질 채널 강도를 추적하려면 체크인하십시오. </td><td> 전체 filopodia </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 참조 단백질 또는 단백질 A를 추적하기 위해 체크인하십시오. </td><td> ProteinA </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 단백질 B를 추적하기 위해 체크인하십시오. </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 단백질 C를 추적하기 위해 체크인하십시오. </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 체크인시 평균 단백질 강도를 확인하십시오.전자 팁 </td><td> 이끄는 팁 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 팁의 길이를 입력하십시오. </td><td> 팁 길이 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 시간 </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 팁이 형성되기 시작하는 바닥에서 최소 거리를 입력하십시오 </td><td> 문지방 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 선도 팁 분석 결과를 파일로 저장하려면 클릭하십시오. </td><td> 누름 단추 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> Ratiometric 단백질 분석을 시작하려면 클릭하십시오 </td><td> 비교 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 단백질 B를 A와 비교하기 위해 체크인하십시오. </td><td> log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> A와 관련하여 단백질 C를 비교하기 위해 체크인하십시오. </td><td> log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 팁에서 A와 관련하여 단백질 B를 비교하기 위해 체크인하십시오. </td><td> log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 팁에서 A와 관련하여 단백질 C를 비교하려면 체크인하십시오. </td><td> log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10a </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 다른 색상 맵을 선택하십시오 (기본값 : Jetplot). </td><td> 컬러 맵 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> 엔 </td><td colspan="5"> 색상 맵 편집 </td><td> 색상 맵 편집 </td></tr></tbody></table> 표 1 : GUI에있는 모든 기능 개요 Windows # 1 및 # 2. 이 작업이 완료되면 프로그램은 볼록 선체를 만들고 영화 전체에 걸쳐 팁을 자동으로 추적합니다. Ratiometric kymograph, 성장 속도 및 유두 길이와 같은 영화에서 추출한 매개 변수다시 표시되며 이미지 및 데이터 파일로 작업 폴더에 저장됩니다. filopodial lifetime, growth rate 및 retraction rate와 같은 다른 매개 변수를 추출하고 저장된 데이터 파일 ( 그림 2B )에서 추가로 분석 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> 그림 2 : 이미지 분석 소프트웨어를 사용하기위한 그래픽 사용자 인터페이스. ( A ) GUI 창 # 1은 이미지로드 및 처리에 사용됩니다. 이 프로그램은 최대 3 개의 단백질 채널을로드 할 수 있으므로 2 개 채널을 쌍으로 비교합니다. 이 창에는 추적 전에 이미지를 사전 처리하기위한 필수 (파란색) 및 선택적 기능 (녹색)이 있습니다. ( B ) GUI 창 # 2는 시신경 및 비율 메트릭 단백질 분석뿐만 아니라 필로도를 추적하는 데 사용됩니다. 다시 옵션 기능은 녹색으로 표시됩니다. 이 숫자는 수정되었습니다.참고 문헌 12 에서 편집. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 여기에서는 샘플 준비 및 소프트웨어 처리를위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 세포 배양과 이미지 분석에 최적화 된 영화 획득에 대한 자세한 지침부터 시작합니다. 데이터 수집에 대한이 절 다음에는 이미지 분석 소프트웨어 작동에 대한 자세한 설명이 나와 있습니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 데이터를 수집하고 처리 할 때 고려해야 할 중요한 단계와 옵션 기능을 소개합니다. 마지막으로 우리는 이미지 분석 소프트웨어로 다른 모델 시스템의 파일 포리아를 분석 한 후 설명 된 이미지 분석 소프트웨어와 유치원 계량화에 사용할 수있는 다른 프로그램을 비교하고 제한 사항 및 향후 방향에 대한 논의를 마무리합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Filopodia는 이동 및 세포 - 세포 통신과 관련된 동적 인 손가락 모양의 세포 돌출부입니다. 섬유 유두의 개시, 연신율 및 후속 안정화 또는 수축의 근본적인 복잡한 신호 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 이러한 동적 구조에서 시공간 단백질 활성을 결정하는 것이 중요합니다. Filopodia에서 단백질 기능을 분석하기 위해 우리는 최근에 filopodial 모양 변화에 적응하는 반자동 추적 알고리즘을 개발하여 전체 filopodial 길이에 따른 돌출부 역학 및 상대 단백질 농도의 병렬 분석을 허용했습니다. 여기서는 최적화 된 셀 처리, 이미지 수집 및 소프트웨어 분석을위한 자세한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 또한 이미지 분석 및 데이터 표현 과정에서 옵션 기능을 사용하는 방법에 대한 지침과 함께 중요한 모든 단계에 대한 문제 해결 지침을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 또한 dfilopodia 부량을 위해 유효한 다른 프로그램을 가진 escribed 영상 분석 소프트웨어. 함께 제시된 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 유두 돌출에서 단백질 역학의 정확한 분석을위한 프레임 워크를 제공합니다.

섬유질 악틴 (f-tractin 18 , 빨간색)과 세포질 참조 (녹색)에 대한 마커로 형질 감염된 COS 세포를 사용하여 우리는 액틴 풍부 유두 돌출을 발견했습니다 ( 그림 3A , 상단 패널). 시계열은 filopodia가 빠르게 늘어나고 철회하는 것을 보여 주었다 ( 그림 3A , 가운데 패널). 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 우리는 개별적인 사상충을 추적했습니다. 손으로 측정 한 유두 길이와 이미지 분석 소프트웨어를 비교 한 결과 피어슨 상호 상관 값은 0.947이었고 소프트웨어가 섬유 유성 확장을 신뢰할 수있게 추적했다고 주장했다. 개별 filopodia의 성장과 retraction 속도 이외에, 그림 3A 의 하단에 kymographs 도 actin의 형광 강도 (상단), cytosolic 기준 (중간), 그리고 cytoso에 정상화 굴지의 상대 농도를 묘사lic 참조 (하단). 함께,이 실험은 COS 세포에서 개별 filopodium의 전체 수명주기 동안 공간적으로 상대 단백질 농도뿐만 아니라 성장 동력학을 신뢰성있게 측정한다는 증거를 제공합니다. 다음으로 우리는 배양 된 마우스 hippocampal neurons에서 filopodia dynamics를 조사했다 ( 그림 3B , 상단 패널). 이를 위해, 뉴런은 f-tractin (적색) 및 세포질 참조 (녹색) ( 그림 3B , 중간 패널)와 시험관 (DIV) 8 일 transfected되었습니다. 이전 실험에서와 마찬가지로, 액틴 및 세포질 참조의 형광 강도를 묘사 kymographs는 액틴의 상대적 농축 탐험 돌기 filopodia ( 그림 3B , 하단 패널)의 형성 선행을 보여 주었다. 이 연구 결과는 출판 된 연구와 일치하며, 섬유 유래 이전의 액틴이 풍부한 패치의 형성을 기술하고있다신장 3 , 19 , 20 . <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig3.jpg" /> 그림 3 : 소프트웨어로 분석 한 파일 포아의 예. ( A ) f - tractin (적색) 및 cytosolic 마커 (녹색)로 transfected COS 세포의 개요 이미지 (상단 패널) 및 시계열 (중간 패널). 아래, filopodial 성장 동력학의 분석 및 filopodium (하단 패널)에 따른 f-tractin의 상대적 농도를 묘사하는 그림이 표시됩니다. 돌연변이 생체 내 성장 역학의 분석을 묘사 한 플롯뿐만 아니라, 세포질 마커 (상단) 및 f- 트 렉틴 (적색) 및 세포질 마커 (녹색) (중간 패널)로 형질 도입 된 뉴런의 시간 시리즈로 트랜 스펙 션 된 해마 뉴런의 개요 이미지 및 돌출부를 따라 f- 트 렉틴의 상대적 농도 (하단 패널).( C ) SEM 사진 (왼쪽 패널) 및 f - tractin (오른쪽 패널)로 transfected HeLa 세포의 시계열. filopodial 좌굴로 인한 형광 강도의 변동에 유의하십시오. 스케일 바 = 20 μm (A, 상단), 50 μm (B, 상단), 10 μm (C, 상단). 이 숫자는 참고 문헌 12 에서 수정되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 마지막으로, 우리는 HeLa 세포에서 필로 포디아 (filopodia)를 모니터링함으로써 소프트웨어에 도전하는 것을 목표로 삼았습니다. HeLa 세포의 Filopodia는 길고 ( 그림 3C , 왼쪽 패널) 매우 동적이어서 종종 획득면을 떠난다. 흥미롭게도, 기저막에 초점을 맞출 때 우리는 헬리컬 트위 스팅을 수행하는 필로 디아 (filopodia)의 하위 분획을 관찰하였으며 ( 그림 3C , 오른쪽 위 패널)초점 평면을 거의 떠났다. 따라서, f-tractin의 절대 형광 강도를 묘사하는 kymographs는 시간이 지남에 따라 형광 강도의 물결 모양의 변화를 보였다 ( 그림 3C , 오른쪽 아래 패널). 이 행동은 filopodial buckling을 연상시킨다. 최근에 filopodia에 의해 잡아 당기는 힘을 발휘하기 위해 사용되는 메커니즘이다. 요약하면,이 실험은 소프트웨어가 다양한 기원으로부터 단백질 농도 및 단백질 동태의 생장 역학을 신뢰성있게 추적한다는 증거를 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K 조회수.  University of Muenster.  우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다. 

비디오: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

만성 실험에 장착 전극 또는 Microdialysis 프로브를위한 라이트 - 치료 치과 접착제 수지의 응용

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

연구

생물학

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila의 비행 중 시각 인한 악취 추적

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...