우리는 도움이 토론과 지원을위한 브라이언 G. 쿤과 클라우디아 B. 한나 감사합니다. 이 프로젝트는 데프에서 자금 업을 시작하여 지원했다. 생물 과학, R. 클라우디오 아길라르와 퍼듀 암 센터를 통해 R. 클라우디오 아길라르에 미국 암 학회 기관 연구 부여 퍼듀 대학.

A.의 세포 배양 및 단백질 유도 이 섹션은 효모 세포에서 regulatable 발기인의 단백질 표현의 유도로 다음 세포 배양 조건, Nocodazole와 세포주기 동기화를 설명합니다. <ol><li> 야생 유형 효모 스트레인 W303 (leu2 - 3, 112 trp1 - 1 can1 - 100 ura3 - 1 ade2 - 1 his3 - 11, 15)은 통제하에 관심을 우리의 유전자 (ENTH2)이 포함되어 높은 사본 (2μ) 플라스미드 DNA로 변환됩니다 메티오닌 - repressible 발기인 (MET25)의. 메티오닌 부족한 미디어 최대한의 표현을 허용하면서 메티오닌 2mM는 모터의 활동을 억제하기 위해 충분하다. 따라서, 메티오닌 농도의 범위가 원하는 수준에서 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. W303 세포에 플라스미드 DNA의 1 변환은 표준 절차에 따라 LiAc - TE 방법을 사용하여 이루어집니다 2. 참고 :이 실험에만 배경 수준의 단백질 발현을 위해 메티오닌 2mM 앞에서 밤새 세포를 성장에 의해 수행되어야합니다. 다음 날 아침은 단백질 표현식은 메티오닌 즉시 다음과 같은 세포주기 동기화 (약 4h) 부족 미디어 세포를 resuspending에 의해 유도해야합니다. 그러나, 우리는 모든 발현의 분석을위한 시간 코스를 만드는 ENTH2 의존 세포 분열의 표현형가 (일반적으로 단백질 유도 3 4 - 6h 후) ENTH2 상당한 농도가 세포에 지어진 후에야 유도 것으로 나타났습니다 매우 긴 표현형 (적어도 16h). 우리는 메티오닌 0.2mM 앞에서 밤새 세포를 성장하면 형태학의 표현형을 represses하지만 부족한 메티오닌 미디어로 전송하면 빠르게 표현형 - 유도 수준을 증가시킬 수있는 임계 단백질 농도를 허용 것으로 나타났습니다. 이것은 시간의 비교적 짧은 기간 동안 세포 분열의 심각한 결함의 발현의 상세한 분석을 수 있습니다. 우리는 그러므로 실험자가 건별로 표현형 유도를위한 하위 임계값있는 메티오닌 농도를 결정하는 것이 좋습니다. </li><li> 표준 무균 기술을 사용하여 소독 원뿔형 플라스크에 메티오닌 0.2mM과 선택적 미디어 50 ML 최근 변형 세포와 예방을 포함하는 접시 6 식민지를 선택하십시오. 30 밤새 품어 ° 200 rpm으로 흔들어로 C. (표준 효모 문화 조건에 대한 자세한 내용은 심판을 참조하십시오. 4) </li><li> 600nm에서 문화의 광학 밀도를 측정하여 다음 날 아침, 견적 세포 밀도. 상온에서 5 분을 위해 2200 RPM의 회전에 의해 멸균 원심 분리기 튜브 및 수확에 세포의 20 OD 600nm에 동등한를 전송합니다. </li><li> 에 Resuspend 세포는 0.4 OD 600nm / ML의 농도에 YPD과 DMSO의 1mg/ml의 혈통의 15μg/ml의 최종 농도 Nocodazole를 추가합니다. 200rpm에서 잡고 30 ° C에서 4h을위한 부화. 참고 : 알파 팩터를 사용하여 G0 단계 또는 hydroxyurea를 사용하여 G1 - S 단계에서 체포를 포함한 대체 체포 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 Nocodazole를 사용하여 유사 분열에 체포 단순하고 우리의 목적을 위해 충분한 효과적인 것으로 나타났습니다. </li><li> 4h 후, 현미경으로 확인하여 동일한 크기의 꽃봉오리와 함께 세포의 수를 계산하여 유사 분열에 체포 세포의 비율을 확인합니다. 체포 이상 90 %면, 다음 단계로 진행합니다. mitotic 연금의 원하는 비율이 달성될 때까지 그렇지 않으면, Nocodazole의 세포를 유지합니다. </li><li> 2,200 RPM에 대한 5 분 얼음 냉수로 세 번 씻어에서 원심 분리하여 세포를 수확. 최종 세척 후 ~ 0.5 OD 600nm / ML의 세포 밀도에서 메티오닌을 선택 부족한 매체의 펠렛을 resuspend. 새로운 멸균 튜브에 세포의 절반 볼륨을 전송하고 최종 0.2mM 농도 메티오닌 추가할 수 있습니다. 이것은 단백질 표현의 기초 단계에 따라 효과를 제어하는​​ 역할을합니다. 이것은 (시간 = 오) 실험 시간 포인트를 먼저 표시합니다. 6h에 대한 세포 매 시간마다를 분석합니다. </li></ol> 표현형 개발 B. 분석 참고 : 아래에서 설명하는 모든 분석 방법이 동시에 수행될 필요가 없습니다. 서쪽은 모래 바닥으로 단백질 표현 수준의 결정 <ol><li> 모든 시간 시점에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 문화와 수확 세포 2 OD 600nm 등가물의 OD 600nm를 측정합니다. </li><li> 1ml 멸균 물의 펠렛을 Resuspend하고 1.5ml eppendorf 튜브에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 펠렛을 얻기 위해 원심 분리를 반복합니다. 뜨는을 대기음. </li><li> 50μl SDS - PAGE laemmli 샘플 버퍼 (50mM 트리스 산도 6.8, 2퍼센트 SDS, 10 % 글리세롤, 2퍼센트 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.006 % bromophenol 파란색)의 펠렛을 Resuspend. 산성 - 세탁 유리 비즈 (0.2-0.4 미크론의 직경) 1 분 소용돌이 50μl를 추가합니다. </li><li> 95 ° C 열 blo에 보일 튜브2 분에 대한 CK 30 초에 다시 소용돌이로 5 분 위해 끓는 이력서. -20 ° C.에서 단백질 샘플을 프리즈 </li><li> nitrocellulose 막에 12% SDS - PAGE 젤, 전송에 대한 단백질 샘플을 실행하고 서양 관심의 단백질을 감지하기 위해 적절한 항체와 모래 바닥 수행합니다. 이 예제에서, 우리는 블로토 영화사 - 트윈에서 1:2000 희석 (1XPBS 5 %가 아닌 지방 건조 우유에서 마우스 반대 HA 항체 (Covance, 프린스턴, 뉴저지)과 잠복기에 의해 ENTH 도메인 태그 haemagglutinin (HA)의 존재를 프로브 , 0.1 % 트윈). HRP는 또한 블로토 영화사 - 트윈에서 1:2500의 희석에 염소 방지 마우스 차 항체 (피어스)를 태그로 실온에서 1 시간을위한 멤브레인에 기본 항체를 바인딩할 수 있습니다. Supersignal 웨스트 피코 Chemiluminescent 기판은 HRP 태그 방지 마우스 항체를 감지하는 데 사용됩니다. </li><li> densitometry로 단백질 발현 수준을 계량. </li></ol> 이 섹션에서는 증가 단백질 농도의 함수로 추적 표현형 개발의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 셀 인구, 기반하는 동안 단일 세포 수준에서 두 번째 연구 해. 셀 - 분할 표현형 및 세포 사망의 부량 <ol><li> 각 시간 시점에서 5 분 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 기술과 수확 세포를 사용하여 살균 eppendorf 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전송할 수 있습니다. </li><li> 뜨는을 기음과 멸균 물 속에 1mg/ml의 주식에서 파란색 30μl 메틸렌 다음 70μl 미디어 펠렛을 resuspend. 메틸렌 블루가 그걸 싫어해요, 그래서 죽은 세포 their 파란색으로 식별 수 cytosol of the 줄이는 환경에서 무색이되는 파란색 중요한 염색이지. </li><li> 피펫 ~ 깨끗한 유리 슬라이드에이 중지 6μl하고 드롭을 통해 coverslip을 넣으십시오. 유리 인터페이스 사이 세포의 얇은, 균일한 층을 형성 부드럽게 coverslip을 누르십시오. </li><li> 9 quadrants로 coverslip을 분할하여 같은 그림에 표시된 사분 당 3 이미지를 가져가라. 2. 세포 / 필드의 숫자는 정확 부량 수 있도록 30 세포보다 더 클 수 없습니다. 공기 방울이 준비를 손상하기 전에 각 coverslip 약 15 분에 대한 몇 군데 있습니다. </li><li> 연구에서 표현형을 보여주는 세포의 수를 계산합니다. ENTH2 overexpression에 유도된 세포 분열 결함은 세포 사망에 이르게하며 따라서, 우리는 또한 파란색으로 식별 죽은 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> phenotypic 세포의 비율을 계산합니다. </li><li> 로 그림에 표시된 데이터를 플롯. 3. </li></ol> 형광 현미경을 사용하여 표현형 특정 결함의 시각화 로 ENTH2 overexpression시 본 세포 분열에 결함이 세포는, 종종 세포 벽에 결함 septin mislocalization3 (GFP - 퓨전 단백질로서 시각)에 의해 특징입니다. 신진 효모의 세포 벽 쉽게 효모 세포 벽에 키틴을 irreversibly 바인딩 Calcofluor 화이트 (CfW)와 얼룩에 의해 시각하실 수 있습니다. <ol><li> 상온에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 eppendorf 튜브 및 수확 세포의 문화 때마다 포인트, 나누어지는의 1ml에. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 5 분에 대한 살균 물, 부화에 1mg/ml CfW 솔루션 100μl의 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 원심 분리 및 1X PBS로 3 번 세척하여 수확 세포. </li><li> 100X 확대에 100μl 1X PBS의 펠렛 및 자외선 광을 사용하여 현미경 이미지 (세포 벽)와 FITC 필터 (GFP - septin)를 Resuspend. </li><li> 섹션 B.2.1에서 다음 단계를 4-6으로 세포 벽의 결함과 septin mislocalization와 함께 세포의 비율을 계량 </li></ol> B.3. 단일 세포 수준에서 표현형 개발의 결정 : 시간 ​​저속 비디오 현미경. <ol><li> 70 % 알코올로 오목 우울증이있는 유리 슬라이드를 깨끗하고 건조한 공기 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 해소 때까지 전자 레인지에 살균 유리관에서 메티오닌이 부족 5ml 선택 미디어 0.06g 아가로 오스를 끓여. </li><li> 아가로 오스의 신속 피펫 200μl의 슬라이드 우울증 미디어가 포함된 기포가가 아래 갇힌되지 않도록해야 할, 그 위에 또 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 반전. </li><li> 젤 굳은 때, 항상 평행들의 표면을 유지, 부드럽게 멀리 우울증 슬라이드의 상단에 슬라이드를 이동합니다. 이것은 아가로 오스 침대의 표면은 우울증 슬라이드의 표면을 잔뜩 것을 보장합니다. 섬세한 조직으로 아가로 오스 침대를 둘러싼 슬라이드 지역을 청소하십시오. 슬라이드는 이제 사용할 수 있습니다. </li><li> 당시 = 4 시간, 상온에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 eppendorf 튜브와 수확의 문화 세포의 전송 1ml. 참고 :이 나중에이 시간 연결되는 표현형 개발이 보장되도록 단백질 표현의 높은 수준을 보장하기 위해 선택할 수 권장합니다. 파일럿 실험 determin하는 데 필요한건별로 전자 유도 시간을. </li><li> 메티오닌 부족한 신선한 선택적 매체의 100μl에 뜨는 및 resuspend 세포를 대기음. </li><li> coverslip의 가장자리에 바셀린을 적용합니다. 다음 아가로 오스 침대의 중앙에 세포 현탁액의 드롭을 배치하고 부드럽게 그들을 통해 coverslip을 눌러 균일하게 확산. </li><li> 석유 젤리로 coverslip의 가장자리를 밀봉하고 매니큐어로 가장자리를 안감하여 위치를 수정. 매니큐어 증발 때까지 기다리십시오. </li><li> 현미경의 열띤 무대에서 슬라이드를 삽입하고 적절하게 간격 10 개 이상 세포를 포함하는 필드를 선택합니다. 세포 분열 때, 필드는 시간이 지남에 붐비는 얻을 것이다. </li><li> 필드의 이미지 ~ 5 시간 동안 5 분마다 가져가라. 표현형의 진행은 ImageJ 소프트웨어 (사용하는 동영상으로 이미지를 조립하여 연구 수 <a name="cite">Rasband, WAS, ImageJ, 건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 년 미국 국립 연구소를 -2005</a> ) </li></ol> 참고 : 우리는 자이스 혈구 Axiovert 200M 현미경을 사용하여 자이스 혈구 Axiocam MRM 디지털 카메라와 라이브 셀 이미징에 대한 칼 자이스 혈구 Axiovision 이미지 수집 소프트웨어 (버전 4.4) 단색. 온도 제어는 PeCon Tempcontrol 37 장치에 의해 30 ° C로 유지 열띤 무대에서 슬라이드를 삽입하여 이루어진다. 방지하기 위해 반복적으로 초점을 다시 조정, 자동으로 모든 시간 지점에서 몇 Z - 스택 이미지를 획득하고 영화를 조립하면 나중에 최고의 중점을두고 이미지를 선택할 수있는 이미지 수집 소프트웨어를 프로그램에 편리합니다. 일부 이미지 수집 소프트웨어는 시간 코스 실험 오토포커스의 옵션이 있습니다. 그것은 가능한 경우에 옵션을 사용하시면 편리합니다. 와일드 타입 효모 세포는 30에서 최고의 성장 ° C 따라서 온도 제어가 중요합니다. 적절한 열을 보장하기 위해서는 가열 단계 이외에 열을 외부 소스를 제공하는 도움이됩니다. 예를 들어, 우리는 이미지의 전체 기간 동안에 현미경의 전송 하얀 빛을 두십시오. 또한 아가로 오스의 침대와 세포 샌드위치를 ​​준비할 때 공기 방울을 피하기 위해 중요합니다. 거품 안에 갇힌 공기는 시간이 지남에 따라 가열하면 팽창 필드가 몇 군데되지 않도록 멀리 세포를 밀어 경향이 있습니다. 필드 내의 각 세포 위치를 확인하는 것도 중요 것은 특히 다시 초점을 시도하는 동안, 이미징 프로세스의 기간 동안 appreciably 변경하지 마십시오. 영화가 조립 후 ImageJ는 셀 위치에 작은 교대를 해결할 수 있도록 이미지 안정화 플러그인을 사용할 수 있습니다. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / 코드 / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

이 프로토콜은 단백질 overexpression시 형태학의 표현형 (적절한 세포 분열을 거쳐 수없는 효모 세포)의 개발을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 빠른 속도 전지하고, 모호한 결과를 손상 수 있으므로 권장 원심 분리 속도 pelleting하여 효모 세포를 수확하기 위해 기억하는 것이 중요합니다. 메틸렌 블루와 Calcofluor 흰색들은 독성으로 직전 이미징에 세포를 사는에 추가되어 있어야합니다. 이 절차는 또한 쉽게 대상이 제어 모터의 표현 제공, 단백질 탄압 조건 하에서 관찰 phenotypes에 대해 적용할 수 있습니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. 이 프로토콜은 단백질의 overexpression를 기반으로하지만, 그것은 쉽게 단백질 표현의 억제에 따라 형태학의 phenotypes에 대해 적용할 수 있습니다. 우리 연구실은 endocytic 어댑터 단백질 epsin의 신호 특성을 공부에 관심을 가지고있다. 그 목적은 우리가 우리가 보존 - 이리 표현하는 지배적인 부정적인 접근 방식을 사용<u&gt; E</u&gt; psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; erminal<u&gt; H</u내생 epsin - 2 (Ent2 또는 YLR206W)의 기능을 방해하기 위해&gt; omology (ENTH) 도메인. 우리는 비계 단백질, septins의 가족의 mislocalization에 따라 달라집니다 세포 분열의 결함에 LED 야생 유형 세포 Ent2 (ENTH2)의 ENTH 도메인의 overexpression을 관찰했다.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Nanyang Technological University

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10.7K 조회수.  Purdue University. 유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명 Saccharomyces cerevisiae.

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Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

쥐에서 도보의 질적 분석 방법으로 Rotorod의 사용

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

연구

생물학

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...