يقر المؤلفون بتمويل من دفغ (إكسك-1003 إلى مغ).

<ol>
	<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li><li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+dendritic+spines:+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses.">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons.">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116 (2014).</li><li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis.">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li><li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction.">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization.">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).</li><li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models.">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li><li>Blum, H., Wathen-Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transformation+for+extracting+new+descriptors+of+shape.">A transformation for extracting new descriptors of shape.</a> Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. , 362-380 (1967).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion.">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li><li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking.">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li><li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension.">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li><li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+filopodial+protrusion.">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATtrack:+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells.">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).</li><li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus.">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li><li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li><li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization.">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li><li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility.">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuronGrowth,+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images.">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li><li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics.">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا نقدم بروتوكول مفصل لتتبع ديناميات النمو فيلوبوديال وتحليل تركيزات البروتين النسبية في هذه الهياكل الديناميكية عبر خوارزمية محدبة-بدن. باستخدام البرنامج، يمكن مقارنة ما يصل إلى 3 قنوات زوج الحكمة في تشغيل واحد، حيث يتم تحديد التركيزات النسبية لقناتين ( أي البروتينات) طوال دورة التمديد / التراجع وتخزينها كملفات الصور والبيانات في مجلدات منفصلة. بالإضافة إلى العمليات الروتينية، ويوفر البرنامج أيضا عددا من المعلمات التي يمكن تعديلها لتحسين التحليل لتجربة منها. ويمكن الاطلاع على وصف مفصل لهذه التعديلات وكذلك استكشاف الأخطاء وإصلاحها في قسم البروتوكول وفي الجدول 1 . تحليل الصورة لا يقتصر على نوع المجهر معين، وإنما عن طريق جودة الصورة من السلاسل الزمنية. وبالنظر إلى أهميته، ينبغي بالتالي تحسين جودة الصورة من أجل eالقناة خلال عملية الاستحواذ. وتظهر تجاربنا أن الخوارزمية تعمل بشكل أفضل مع فيلوبوديا مع شنر&gt; 4 المكتسبة في 1 هرتز باستخدام الهدف مع التكبير فوق 40X وليس بينينغ بكسل. بطبيعة الحال، وهذا ينطبق فقط طالما فلوروفوريس متوافقة مع إعدادات مرشح ( أي لا تنزف من خلال؛ انظر القسم بروتوكول 2 للحصول على التفاصيل). وبالنظر إلى أن شدة النسبية مقارنة بعضها البعض، والتحليل ليست حساسة للاختلافات الصغيرة في شدة إشارة مضان المطلق بين الخلايا الفردية. لذلك، للاستدلال على البيانات ذات مغزى، قناة مرجعية محددة جيدا ( مثل علامة عصاري خلوي) ذات أهمية كبيرة. ومع ذلك، حتى لو جودة الصورة جيدة هناك بعض القيود البيولوجية. على سبيل المثال، فإنه ليس مناسبا تماما لتحليل الهياكل المتفرعة، إمالة أكثر من 45 درجة من محور متعامد إلى سطح الخلية، أو حيث الكائنات الأخرى هي عبور الهيكل الذي يجري التحقيق. &lt;p كلاس = &quot;jove_content&quot;&gt; بالإضافة إلى هذه القيود التجريبية، هناك خطوات حاسمة داخل البروتوكول التي تحتاج إلى النظر فيها عند تشغيل البرنامج، حيث قد يؤدي ذلك إلى ظهور رسائل خطأ. أولا، يجب أن تكون القنوات المقابلة لبروتين معين من نفس البعد وتمثل بالضبط نفس عائد الاستثمار. ثانيا، يجب أن تكون الملفات مكدسة في مقياس الرمادي &#39;.tiff&#39; تنسيق الملف. ثالثا، يجب أن تكون ملفات الصور المكدسة في مجلد العمل. وأخيرا، لا ينبغي تغيير أسماء ملفات البيانات في مجلد العمل، ما لم يتم تصحيح هذا في التعليمات البرمجية. كيف يقارن النص البرمجي مع الطرق الأخرى الموجودة؟ للتحقيق في برنامج تحليل الصور لدينا، قمنا بتحميل عدد من الحلول البرمجية التي نشرت مؤخرا التي تحلل ميزات فيلوبوديال 6 ، 10 ، 21 ، 22 ، 23 ، <sأوب كلاس = &quot;كريف&quot;&gt; 24 ، 25 ، واختبارها جميعا لعدد من المعايير المحددة. وترد في الجدول 2 مقارنة تفصيلية. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> تسيغانكوف وآخرون. </td><td> باري إت آل. </td><td> نيلوفر إت آل. </td><td> فانتي وآخرون. </td><td> كونستانتينو وآخرون. </td><td> Hendri- كوسدوتير وآخرون. </td><td> تارنوك وآخرون. </td><td> ساها وآخرون. </td></tr><tr><td> ورقة دوي </td><td> 10.1083 / jcb.201306067 </td><td> 10.1083 / jcb.201501081 </td><td> 10.1186 / 1752-0509-7-66 </td><td> 10.1002 / dneu.20866 </td><td> 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 </td><td> 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 </td><td> 10.1002 / cyto.a.22569 </td><td> 10.1091 / على mbc. E16-06-0406 </td></tr><tr><td> البرمجيات (رابط التحميل) </td><td> HTTP: //www.hahnlab. كوم / أدوات / ال softwarepage. أتش تي أم أل </td><td> HTTP: // JCB-dataviewer. rupress.org/jcb/ تصفح / 9059 / </td><td> HTTP: //www.perkinslab .CA / الحانات / NMLP20XX. أتش تي أم أل </td><td> HTTP: //www.ifc. unam.mx/ بعثة تقصي الحقائق / استخدام download.html </td><td> HTTP: // fournierlab. mcgill.ca/ نصب 7 / fTracker.html </td><td> HTTPS: // fdynamics. wordpress.com/ </td><td> HTTP: // cnblab. elte.hu/dfma </td><td> https://campus.uni-muenster.de/index.php؟id=13794&amp;L=1 </td></tr><tr><td> نوع البرنامج </td><td> ماتلاب </td><td> يماغيج </td><td> ماتلاب </td><td> يماغيج </td><td> ماتلاب </td><td> ماتلاب </td><td> يماغيج </td><td> ماتلاب </td></tr><tr><td> عملية </td><td> الآلي </td><td> الآلي </td><td> الآلي </td><td> شبه الآلي </td><td> شبه الآلي </td><td> شبه الآلي </td><td> شبه الآلي </td><td> شبه الآلي </td></tr><tr><td> تحليل مقابل دفعة واحدة </td><td> كلا </td><td> كلا </td><td> غير مرتبطة </td><td> غير مرتبطة </td><td> غير مرتبطة </td><td> غير مرتبطة </td><td> غير مرتبطة </td><td> غير مرتبطة </td></tr><tr><td> تحليل الخلية بأكملها مقابل دون الإقليمية </td><td> كامل </td><td> كامل </td><td> كلا </td><td> كلا </td><td> كلا </td><td> الفرعية </td><td> الفرعية </td><td> الفرعية </td></tr><tr><td> متعددة مقابل فيلوبوديا الفردية </td><td> مضاعف </td><td> مضاعف </td><td> مضاعف </td><td> مضاعف </td><td> مضاعف </td><td> دائرة الهجرة والجنسية </td><td> دائرة الهجرة والجنسية </td><td> دائرة الهجرة والجنسية </td></tr><tr><td> معرف فيلوبوديال والتفتيش البصري ممكن </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> لا </td><tد&gt; نعم </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td></tr><tr><td> معالجة الصور الممكنة </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم فعلا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم فعلا </td></tr><tr><td> فيلوبوديال، لينغث </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td></tr><tr><td> ديناميات النمو الفيلوبودي </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> لا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td></tr><tr><td> فيلوبوديال، ليفيتيمي </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> لا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td><td> نعم فعلا </td></tr><tr><td> تحليل راتيوميتريك في فيلوبوديا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم &lt;/ td&gt; </tr><tr><td> إخراج / تنسيق التخزين </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td><td> الصور / ملف البيانات </td></tr></tbody></table> الجدول 2: نظرة عامة على حلول تحليل الصور بمساعدة البرمجيات ل فيلوبوديا الكمي. من ثمانية حلول تحليل البرمجيات اختبارها، تم تشغيل خمسة من خلال ماتلاب، في حين أن الثلاثة المتبقية تستخدم إيماجيج. كان اثنين من حلول البرمجيات ( الجدول 2 ، إلى اليسار) مؤتمتة بالكامل والأمثل لتحليل دفعة من طول فيلوبوديا، وعمر وديناميات في الخلايا بأكملها. ومن بين الحلول البرمجية الستة المتبقية، كانت هناك حاجة إلى خمسة مدخلات يدوية إضافية ( أي شبه آلية)، في حين كانت واحدة مؤتمتة بالكامل. ومع ذلك، فقط ثه حلول شبه الآلي توفر معلومات مفصلة عن ديناميات النمو فيلوبوديا، وقت الحياة والهوية. من بين هذه الخمسة المتبقية، تم تحسين ثلاثة لتحليل خلوية من فيلوبوديا الفردية، في حين أن اثنين يمكن معالجة فيلوبوديا متعددة في موازاة ذلك. الأهم من ذلك، من جميع الحلول الثمانية اختبار البرمجيات، نهج واحد فقط يسمح للجمع بين المعلومات عن ديناميات النمو الفيلوبودي مع توطين البروتينات النسبية داخل هذه الهياكل تشبه الإصبع ( الجدول 2 ، إلى اليمين). على الرغم من أن برنامجنا تحليل الصور ليست مناسبة ل دفعة الآلي أو تحليل خلية كاملة، الكمي من فيلوبوديا معزولة يستغرق دقائق فقط. وهكذا، فإننا نتصور أن الكمي من ديناميات البروتين في 40-50 فيلوبوديا هو ممكن في غضون يوم واحد مع البرنامج الحالي. على النقيض من ذلك، قد تتطلب شاشات عالية الإنتاجية المزيد من التعديلات على التعليمات البرمجية لتبسيط المدخلات وتخزين الآلاف من فيلوبوديا الفردية في الآليالطريقة. وبناء على المعلمات المطلوبة، قد تكون الحلول البرمجية القائمة الأخرى أكثر ملاءمة لهذا النهج. مع الحفاظ على هذه القيود في الاعتبار، ويوفر البرنامج منصة موثوقة للتحقيق في تركيز البروتين المكاني والزماني في نتوء مثل الهياكل في الخلايا. وبالنظر إلى أن فيلوبوديا ليست الهياكل الخلوية الأصابع الوحيدة، فمن المعقول أن تصور أن برنامج تحليل الصور المقدمة قد تكون مناسبة أيضا لدراسة ديناميات البروتين في العمليات البيولوجية الأخرى (على سبيل المثال نيوريتس، ​​أهداب الأولية).

وترتبط السيطرة المكانية والزمانية للبروتينات التنظيمية أكتين مع ديناميات فيلوبوديوم 1 ، 2 . تتبع مكانيا حل تركيز البروتين على طول طول فيلوبوديال كله من خلال الوقت هو بالتالي حاسمة لتعزيز فهمنا للآليات الكامنة بدء، استطالة، استقرار أو انهيار هذه الهياكل الديناميكية 3 ، 4 . على عكس تحليل البروتين في السيتوسول، حيث تحدث العديد من التغييرات شكل الخلية على نطاق أوسع، فيلوبوديا هي الهياكل الدقيقة الحيوية التي مشبك باستمرار 5 والانحناء، وبالتالي يحول دون تحليل باستخدام نهج بسيط مثل خط المسح الضوئي. حلول البرمجيات المختلفة لتتبع شكل فيلوبوديال متاحة 6 ، 7 ، 8 ، 9 . Likewأيس، وقد تم تطوير البرمجيات لتتبع راتيوميتريك من ديناميات البروتين داخل الجسم الخلية 10 ، 11 . للجمع بين التتبع الآلي لشكل فيلوبوديال وتحليل البروتين المكاني والزماني، قمنا مؤخرا بتطوير برنامج تحليل الصور على أساس خوارزمية محدبة-بدن 12 . طريقة التحليل الرواية هذه، التي يتم تشغيلها من خلال واجهة المستخدم الرسومية (غوي)، تجمع لأول مرة، تركيز البروتين النسبي على طول طول الفيلوبوديال وسرعة النمو، مما يسمح بالقياس الدقيق لتوزيع البروتين المكاني الزماني المستقل عن حركة هذه الهياكل الديناميكية 12 . الفكرة وراء البرنامج (شفرة المصدر متاحة بحرية، انظر أدناه) هو أن واحدة من القمم من بدن محدب سوف تتزامن مع غيض من فيلوبوديوم ( الشكل 1A ). من خلال النظر في الإطار اللاحق فوr أقرب قمة الرأس من محدب بدن، ويمكن تتبع طرف متحرك في جميع أنحاء الفيلم كله. مرة واحدة يتم الكشف عن طرف في كل إطار، يتم استخدام موقفها لرسم محور عن طريق الانضمام إلى طرف مع نقطة مرجعية في قاعدة فيلوبوديوم ( الشكل 1B ). وأخيرا، تستخدم النقاط العشرية متساوية البعد، التي يتم تحديد مواقفها من قبل بكسل المتوسط ​​مع أقصى كثافة على طول خط متعامد للمحور، وتستخدم لتحديد العمود الفقري الذي يتبع شكل فيلوبوديال. الاستفادة من هذا العمود الفقري للتكيف، يتم إنشاء كيموجراف لتتبع نمو فيلوبوديال وتركيزات البروتين لمدة تصل إلى ثلاث قنوات على طول طول فيلوبوديال ( الشكل 1C ). <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> الشكل 1: مبدأ العمل من برامج تحليل الصور. ( A ) الخوارزمية وراءالبرنامج. في STEP1 يحدد المستخدم المرجع (قاعدة) و قمة الرأس (غيض) من فيلوبوديوم. في الخطوة 2-1 يتم الحصول على العمود الفقري للفيلوبوديوم باستخدام بكسل المتوسطة مع أقصى قيمة شدة. في الخطوة 3 يتم استخدام العمود الفقري لملامح كثافة البروتين المكاني. في الخطوة 2-2 يقوم البرنامج بتتبع الطرف تلقائيا في الإطار اللاحق. الإجراء بأكمله يتكرر. ( ب ) لقطة من الخوارزمية مع فيلوبوديوم الحقيقي إدخال عناصر هامة مثل الهيكل المحدب الذي يتم استخدامه للتتبع. ( C ) نظرة عامة على المعلمات التي يمكن قياسها مع الخوارزمية. وقد عدل هذا الرقم من المرجع 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> يتم تشغيل برنامج تحليل الصور في ماتلاب (المشار إليها باسم برمجة البرمجيات) عن طريق استخدام رسوميةr واجهة. لتحقيق أقصى قدر من المرونة والمتانة لإعداد تجريبي معين، يمكن للمستخدم ضبط سلسلة من المعلمات تتبع (على سبيل المثال يسمح زاوية الانحناء والحركة بين الإطار) وأيضا إجراء بعض التصحيحات على الأفلام ( مثل المحاصيل، والتناوب، وإزالة الأجسام غير المرغوب فيها) ( الشكل 2A والجدول 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> واجهة المستخدم الرسومية </td><td> لا. </td><td> إلزامي </td><td colspan="5"> وصف </td><td> الاسم (في واجهة المستخدم الرسومية) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1A </td><td> Y </td><td colspan="5"> تحميل ملف .tiff مكدسة تمثل الجسم الخلية (مع مربع فحص) أو إنشاء جسم خلية فرضه من القنوات </td><td> CellBody </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1B </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; تحميل ملف صورة مكدسة المقابلة للبروتين 1 </td><td> البروتين 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1C </td><td> Y </td><td colspan="5"> تحميل ملف صورة مكدسة المقابلة للبروتين 2 </td><td> بروتين 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1D </td><td> Y </td><td colspan="5"> تحميل ملف صورة مكدسة المقابلة للبروتين 3 </td><td> بروتين 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1E </td><td> N </td><td colspan="5"> إعادة تعيين كل شيء لتحميل مسبق ملفات الصور مكدسة </td><td> إعادة تعيين </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2A </td><td> Y </td><td colspan="5"> شريط التمرير لتحديد الإطار الأولي للتحليل في إطار واجهة المستخدم الرسومية # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2B </td><td> Y </td><td colspan="5"> شريط التمرير لتحديد الإطار النهائي للتحليل في نافذة واجهة المستخدم الرسومية # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2C </td><td> Y </td><td colspan="5"> شريط التمرير يمثل كيرنت الإطار </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2D </td><td> N </td><td colspan="5"> القيمة الرمادية للبكسل التي سيتم تعيين جميع وحدات البكسل فيها على الصفر </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2E </td><td> N </td><td colspan="5"> القيمة الرمادية للبكسل التي سيتم تعيين جميع وحدات البكسل فيها على القيم القصوى </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2F </td><td> N </td><td colspan="5"> عين قيم شدة البكسل المحددة بواسطة &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; </td><td> جلس </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2G </td><td> N </td><td colspan="5"> تلعب الفيلم تعديل كثافة </td><td> لعب </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2H </td><td> N </td><td colspan="5"> قص الصوره </td><td> ا &amp; قتصاص </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2I </td><td> N </td><td colspan="5"> تدوير الصورة </td><td> استدارة </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2J </td><td> N </td><td colspan="5">احذف المناطق في المجموعة بأكملها </td><td> حذف المناطق </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3A </td><td> Y </td><td colspan="5"> انقر لفتح &quot;نافذة التحليل&quot; (نافذة واجهة المستخدم الرسومية رقم 2) </td><td> نافذة التتبع </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3B </td><td> Y </td><td colspan="5"> أدخل حجم بكسل في ميكرون </td><td> أدخل حجم بكسل </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> انقر لتوليد صورة الحدود / حافة الجسم الخلية فرضه </td><td> حدود </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> انقر لتحديد قاعدة و غيض من فيلوبوديا </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6A </td><td> Y </td><td colspan="5"> أدخل عدد الشرائح أو العقد </td><td> لا من القطاعات </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6B </td><td> Y </td><td colspan="5"> أدخل طول المسح الضوئي (عمودي على المحور) </td><td> عرض المسح الضوئي </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6C </td><td> Y </td><td colspan="5"> أدخل طول أعلاه الذي فيلوبوديا يبدأ الانحناء </td><td> دقيقة دقيقة بعد </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6D </td><td> Y </td><td colspan="5"> أدخل نصف قطر الدائرة الكشف عن طرف (أي المنطقة حيث يمكن أن تكون موضعيا قمة الرأس في الإطار التالي) </td><td> نصف القطر للكشف عن طرف </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6E </td><td> Y </td><td colspan="5"> أدخل أقصى زاوية فيلوبوديوم يمكن أن ينحني من المحور الرأسي </td><td> زاوية العتبة </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6F </td><td> N </td><td colspan="5"> إضافة نقاط مرجعية للقاعدة والطرف لهذا الإطار المحدد </td><td> حدد المرجع </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6G </td><td> N </td><td colspan="5"> أدخل طول أعلاه الذي فيلوبوديا يبدأ الانحناء لهذا الإطار محددة </td><td> دقيقة دقيقة بعد </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 6H </td><td> N </td><td colspan="5"> أدخل نصف قطر دائرة الكشف عن هذا الإطار المحدد </td><td> نصف القطر للكشف عن طرف </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6I </td><td> N </td><td colspan="5"> بعد إدخال كافة المعلمات لإطار محدد انقر لتخزين القيم إلى الذاكرة والملف لمزيد من المرجع </td><td> إضافة </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6J </td><td> N </td><td colspan="5"> انقر لحذف مجموعة المعلمات يدويا لهذا الإطار </td><td> حذف </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6K </td><td> N </td><td colspan="5"> انقر لحذف جميع المعلمات المخزنة يدويا باستخدام &quot;لوحة الميزات الاختيارية&quot; لجميع الإطارات </td><td> إعادة تعيين </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6L </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق قبل المتابعة لتخزين جميع نتائج التتبع في الذاكرة للرجوع إليها في المستقبل </td><td> تتبع التاريخ </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> انقر لبدء التتبع </td><td> تتبع وتحليل </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8A </td><td> N </td><td colspan="5"> انقر لبدء تتبع كثافة قناة البروتين </td><td> تحليل كثافة البروتين </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8B </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في لتتبع كثافة قناة البروتين على طول طول فيلوبوديال </td><td> فيلوبوديا كله </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8C </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في لتتبع البروتين المرجعي أو البروتين A </td><td> ProteinA </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8D </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في لتتبع البروتين B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8E </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في لتتبع البروتين C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8F </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في لتتبع متوسط ​​كثافة البروتين في ثe تلميح </td><td> نصيحة رئيسية </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8G </td><td> N </td><td colspan="5"> أدخل طول الطرف </td><td> طول النصيحة </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8H </td><td> N </td><td colspan="5"> أدخل الحد الأدنى للمسافة من القاعدة أعلاه التي تبدأ غيض تشكيلها </td><td> عتبة </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8I </td><td> N </td><td colspan="5"> انقر لحفظ نتائج تحليل تلميح الرائدة للملف </td><td> اضغط الزر </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9A </td><td> N </td><td colspan="5"> انقر لبدء تحليل البروتين راتيوميتريك </td><td> قارن </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9B </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في مقارنة البروتين B فيما يتعلق A </td><td> LOG10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9C </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في مقارنة البروتين C فيما يتعلق A </td><td> LOG10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 9D </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في مقارنة البروتين B فيما يتعلق A في الطرف </td><td> LOG10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9E </td><td> N </td><td colspan="5"> تحقق في مقارنة البروتين C فيما يتعلق A في الطرف </td><td> LOG10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10A </td><td> N </td><td colspan="5"> اختر خريطة ألوان أخرى (افتراضي: جيتبلوت) </td><td> لون خريطة </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10B </td><td> N </td><td colspan="5"> عدل كولورماب </td><td> تحرير كولورماب </td></tr></tbody></table> الجدول 1: نظرة عامة على جميع الوظائف الموجودة في واجهة المستخدم الرسومية ويندوز # 1 و # 2. مرة واحدة يتم إنجاز هذا، البرنامج بإنشاء بدن محدب وتتبع تلقائيا طرف في جميع أنحاء الفيلم. المعلمات المستخرجة من الفيلم، مثل كيموغراف راتيوميتريك، سرعة النمو، وطول فيلوبوديالإعادة عرض وتخزينها أيضا في مجلد العمل كصور وملفات البيانات. ويمكن بعد ذلك استخراج غيرها من المعالم مثل فيلوبوديال العمر، ومعدل النمو ومعدل التراجع وتحليلها من ملفات البيانات المخزنة ( الشكل 2B ). <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> الشكل 2: واجهة المستخدم الرسومية لاستخدام برامج تحليل الصور. ( A ) يستخدم واجهة المستخدم الرسومية نافذة رقم 1 لتحميل الصور ومعالجتها. يمكن للبرنامج تحميل ما يصل إلى 3 قنوات البروتين، حيث يتم مقارنة 2 قنوات زوج من الحكمة. نافذة يأتي مع إلزامية (الأزرق) وميزات اختيارية (الأخضر) لمرحلة ما قبل تجهيز الصور قبل تتبع ( B ) يستخدم واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 2 لتتبع فيلوبوديوم وكذلك المكاني الزماني وتحليل نسبة البروتين متري. مرة أخرى، يتم تمييز الميزات الاختيارية باللون الأخضر. وقد كان هذا الرقم معدلاإد من المرجع 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> هنا، نقدم بروتوكول مفصل لإعداد العينات والتعامل مع البرمجيات. نبدأ مع تعليمات مفصلة حول زراعة الخلايا والحصول على الأفلام الأمثل لتحليل الصور. ويتبع هذا القسم المتعلق باقتناء البيانات وصفا تفصيليا لتشغيل برمجيات تحليل الصور. في جميع أنحاء البروتوكول، ونحن نقدم خطوات حاسمة والميزات الاختيارية التي ينبغي النظر فيها عند جمع ومعالجة البيانات. وأخيرا، فإننا نحلل فيلوبوديا من أنظمة نموذجية مختلفة مع برنامج تحليل الصور، قبل أن يغلق مع مقارنة بين برامج تحليل الصور الموصوفة مع البرامج الأخرى المتاحة للقياس الكمي فيلوبوديال ومناقشة حول القيود والتوجه المستقبلي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

فيلوبوديا هي ديناميكية، تشبه الإصبع النتوءات الخلوية المرتبطة الهجرة والاتصالات الخلوية الخلية. من أجل فهم أفضل لآليات الإشارات المعقدة الكامنة وراء بدء فيلودوديال، استطالة وتثبيت لاحق أو تراجع، فمن الأهمية بمكان لتحديد النشاط البروتيني الزماني المكاني في هذه الهياكل الحيوية. لتحليل وظيفة البروتين في فيلوبوديا، قمنا مؤخرا بتطوير خوارزمية التتبع شبه الآلي التي تتكيف مع فيلوبوديال شكل التغييرات، مما يسمح تحليل مواز للديناميات نتوء وتركيز البروتين النسبي على طول طول فيلوبوديال كله. هنا، نقدم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتحسين التعامل مع الخلايا، والحصول على الصور وتحليل البرمجيات. كما نقدم إرشادات لاستخدام الميزات الاختيارية أثناء تحليل الصور وتمثيل البيانات، بالإضافة إلى إرشادات تحري الخلل وإصلاحه لجميع الخطوات المهمة على طول الطريق. وأخيرا، فإننا تشمل أيضا مقارنة دبرنامج تحليل الصور المقتبسة مع البرامج الأخرى المتاحة لتقدير فيلوبوديا. معا، يوفر البروتوكول المقدم إطارا لتحليل دقيق للديناميات البروتين في نتوءات فيلوبوديال باستخدام برنامج تحليل الصور.

باستخدام خلايا كوز ترانزفكتد مع علامة للأكتين الخيطية (و- تراكتين 18 والأحمر) ومرجع عصاري خلوي (الأخضر)، وجدنا نتوءات فيلوبوديال الغنية أكتين ( الشكل 3A ، لوحة أعلى). وأظهرت سلسلة زمنية أن فيلوبوديا تمتد بسرعة وسحب ( الشكل 3A ، لوحة الأوسط). باستخدام برنامج تحليل الصور، ثم تتبعنا فيلوبوديا الفردية. مقارنة بين طول فيلوبوديال يقاس باليد مقابل برنامج تحليل الصور أظهرت بيرسون قيمة الارتباط المتبادل من 0.947 حجة أن البرنامج تعقب موثوق تمديد فيلوبوديال 12 . بالإضافة إلى معدلات النمو والتراجع من فيلوبوديا الفردية، كيموجرافس في الجزء السفلي من الشكل 3A يصور أيضا شدة مضان من أكتين (أعلى)، مرجع عصاري خلوي (وسط)، والتركيز النسبي للأكتين تطبيع إلى سايتوسومرجع ليك (أسفل). معا، هذه التجارب توفر دليلا على أن البرنامج يقيس موثوقية ديناميات النمو وكذلك حل مكانيا تركيز البروتين النسبي طوال دورة حياة كاملة من فيلوبوديوم الفردية في خلايا كوز. بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في ديناميات فيلوبوديا في المستزرعة الخلايا العصبية الحصين الماوس ( الشكل 3B ، لوحة أعلى). لهذا، تم ترانزفكتد الخلايا العصبية في اليوم في المختبر (ديف) 8 مع f- تراكتين (الأحمر) ومرجع عصاري خلوي (الأخضر) ( الشكل 3B ، لوحة الوسطى). كما هو الحال في التجربة السابقة، كيموغرافس تصور شدة مضان من الأكتين والمرجعية عصاري خلوي أظهرت أن الإثراء النسبي للأكتين تكوين مسبوق من فيلوبوديا شجيري استكشافية ( الشكل 3B ، لوحة أسفل). هذه النتائج تتماشى مع العمل المنشورة، واصفا تشكيل بقع الغنية بالأكتين قبل فيلوبوديالاستطالة 3 ، 19 ، 20 . <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig3.jpg" /> الشكل 3: أمثلة من فيلوبوديا تحليلها من قبل البرنامج. ( A ) نظرة عامة صورة (اللوحة العليا) وسلسلة زمنية (لوحة الوسطى) من خلايا كوز ترانزفكتد مع f- تراكتين (الأحمر) وعلامة عصاري خلوي (الأخضر). أدناه، يتم عرض المؤامرات التي تصور تحليل ديناميات النمو الفيلوبودي والتركيز النسبي لل f- تراكتين على طول فيلوبوديوم (لوحات أسفل). ( B ) نظرة عامة على صورة من الخلايا العصبية قرن آمون ترانزفكتد مع علامة عصاري خلوي (أعلى) وسلسلة زمنية من الخلايا العصبية ترانزفكتد مع f- تراكتين (الأحمر) وعلامة عصاري خلوي (الأخضر) (لوحة الوسطى)، وكذلك مؤامرة تصور تحليل ديناميكية نمو دينامية متغاير والتركيز النسبي لل f-تراكتين على طول نتوء (لوحات أسفل).( C ) سيم صورة (اللوحة اليسرى) وسلسلة زمنية من خلايا هيلا ترانزفكتد مع f- تراكتين (اللوحة اليمنى). ملاحظة تقلبات في كثافة مضان بسبب التواء فيلوبوديال. الحانات مقياس = 20 ميكرون (A، أعلى)، 50 ميكرون (B، أعلى)، 10 ميكرون (C، أعلى). وقد عدل هذا الرقم من المرجع 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> وأخيرا، ونحن تهدف إلى تحدي البرنامج عن طريق مراقبة فيلوبوديا في خلايا هيلا. فيلوبوديا في خلايا هيلا طويلة ( الشكل 3C ، اللوحة اليسرى) ودينامية للغاية، وغالبا ما تترك الطائرة من الاستحواذ. ومن المثير للفضول، عندما ركزنا على الغشاء القاعدي، لاحظنا وجود جزء صغير من فيلوبوديا للتخلي عن حلزوني ( الشكل 3C ، أعلى اللوحة اليمنى)، حيث أجزاء من فيلوبوديوم ترانزتركت ببطء الطائرة البؤرية. وفقا لذلك، كيموغرافس تصور شدة مضان المطلقة من f- تراكتين أظهرت موجة تشبه التغيرات في كثافة مضان من خلال الوقت ( الشكل 3C ، لوحة اليمنى السفلى). هذا السلوك هو تذكرنا التواء فيلوبوديال، وهي آلية وصفت مؤخرا لاستخدامها من قبل فيلوبوديا لممارسة قوات سحب 5 . باختصار، هذه التجارب توفر دليلا على أن البرنامج يتتبع موثوق تركيز البروتين وديناميات النمو من فيلوبوديال من أصول مختلفة.

Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

نقدم حل البرمجيات لتتبع شبه الآلي من تركيز البروتين النسبي على طول نتوءات الخلوية الديناميكية.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Muenster.  نقدم حل البرمجيات لتتبع شبه الآلي من تركيز البروتين النسبي على طول نتوءات الخلوية الديناميكية. 

Video: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

تطبيق فاتح الشفاء الراتنج لاصق الأسنان أو تركيب لأقطاب مجسات Microdialysis في التجارب المزمنة

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

تتبع الرائحة بصريا وساطة خلال الطيران في ذبابة الفاكهة

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...