Gli autori riconoscono i finanziamenti del DFG (EXC-1003 a MG).

1. Cultura cellulare <ol><li> Coltura le cellule HeLa o COS nel mezzo modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g / L D-glucosio, L-alanina-L-glutammina di dipeptide, piruvato, 10% siero fetale bovino e 10 unità / ml di penicillina / streptomicina. Neuroni di cultura in supporti di coltura senza L-glutamina, acido glutammico o acido aspartico, integrati da 0,5 mM dipeptide L-alanina-L-glutammina, supplementi neuronali privi di siero e 10 unità / ml di penicillina / streptomicina. </li><li> Una volta raggiunta la confluenza del 40%, trasporre le cellule con costrutti di scelta utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Mantenere le cellule trasfettate in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 per 15-18 h. </li><li> Per ridurre le variazioni di pH e osmolarità (a causa dell&#39;evaporazione) durante l&#39;acquisizione di immagini, riempire le camere di coltura cellulare (prima dell&#39;immagine) fino al 90% con un terreno pre-riscaldato a 37 ° C contenente 20 mM 4- (2-idrossietil) -1 -piperazinattanesolfonico (HEPES). SigillareIl coperchio, applicare un sottile strato di grasso di vuoto all&#39;interno del coperchio e premere delicatamente sulla camera di coltura contenente le cellule trasfettate. </li></ol> 2. Acquisizione di immagini NOTA: La lunghezza della filopodia varia da 2-10 μm 13 . La filopodia cresce ad una velocità media di 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 . <ol><li> Acquisire le immagini usando un microscopio con obiettivo 60X o 100X e nessun pixel di binning (qui, un microscopio confocale a filatura disco). Utilizzare le frequenze di acquisizione superiori a 1 Hertz (Hz) per tenere traccia della dinamica filopodiale. Per ridurre al minimo gli artefatti fuori fuoco, filopodia dell&#39;immagine vicina alla membrana basale (ad es. Superficie del substrato). </li><li> Per garantire un monitoraggio regolare, regolare il tempo di esposizione della fotocamera e l&#39;intensità laser in modo tale che il rapporto segnale / rumore (SNR) sia maggiore di 4. Evitare la saturazione dei singoli canali ( cioè i valori dei pixel255 per le immagini a 8 bit e 65,535 per le immagini a 16 bit), in quanto ciò precluderà l&#39;analisi dell&#39;immagine successiva. </li><li> Per evitare il sanguinamento, utilizzare solo tag di fluorescenza compatibili con linee laser e filtri del microscopio (per ulteriori dettagli vedere il riferimento 15 ). </li></ol> 3. Pre-elaborazione di immagini NOTA: Utilizzare ImageJ o un altro software disponibile per pre-elaborare le immagini 16 , 17 . <ol><li> Se il campione sta muovendo, correggere la deriva laterale usando il software disponibile ( ad es. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) prima dell&#39;analisi. Escludi i film con deriva assiale (cioè movimento in direzione z). </li><li> Sfondo corretto ( cioè valori grigi di aree al di fuori della cella), sbiancamento (perdita continua se l&#39;intensità di fluorescenza dovuta a danni alle proteine ​​di fluorescenza) e eventuale sanguinamento (segnale da un influenzaSonda di orescenza nei due canali) utilizzando il software disponibile ( ad esempio http://imagej.net/Category:Plugins e 16 , 17 ). Nota: l&#39;intensità di fluorescenza dei singoli canali non viene modificata dal software. </li><li> Per garantire un&#39;analisi successiva delle immagini, salvare i filmati corrispondenti a particolari canali proteici in scala grigia come file formato impilato &quot;.tiff&quot; nella cartella di lavoro. NOTA: Le dimensioni (dimensione e lunghezza) delle stack devono essere uguali per tutti i canali. </li></ol> 4. Analisi delle immagini - Fase 1: caricare le immagini NOTA: Il software qui descritto è stato scritto in Matlab (indicato come software di programmazione) e verrà eseguito solo con questo programma. <ol><li> Scaricare la cartella con zip contenente tutti i file necessari per l&#39;analisi delle immagini dal sito seguente: https://campus.uni-muenster.de/it/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwsiamo/. Deselezionare e copiare i file nella cartella di lavoro. </li><li> Una volta installata, aprire il software di programmazione e eseguire &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;. La finestra # 1 della GUI si apre come mostrato nella Figura 2A . </li><li> Caricare i file &quot;.tiff&quot; impilati memorizzati in corrispondenza di una particolare proteina di interesse nella finestra GUI # 1 utilizzando i pulsanti &lt;1b&gt; per la proteina A, &lt;1c&gt; per la proteina B, &lt;1d&gt; per la proteina C. Vedere la Figura 2 e la Tabella 1 per i dettagli. NOTA: La proteina A mostrata nella finestra GUI # 1 funge da canale di riferimento per l&#39;analisi ratiometrica finale. </li><li> Crea un&#39;immagine sovrapposta della cella dai canali proteici facendo clic su &lt;1a&gt;. </li><li> Fare clic su &lt;2a&gt; per assegnare il primo fotogramma e &lt;2b&gt; per l&#39;ultimo fotogramma utilizzato per l&#39;analisi. </li><li> Facoltativamente, ritagliare la regione di interesse (ROI) contenente il filopodium di interesse utilizzando il pulsante &lt;2h&gt;, ruotare l&#39;immagine uPremere il tasto &lt;2i&gt; o eliminare le regioni indesiderate usando lo strumento di disegno a mano libera &lt;2j&gt;. NOTA: Per semplificare l&#39;analisi delle immagini, è consigliabile isolare il ROI ( vale a dire tagliare, ruotare, eliminare) insieme agli altri passaggi di pre-elaborazione (sottrazione di sfondo, correzioni della candeggina, ecc.) Utilizzando ImageJ. </li><li> Spostare il cursore &lt;2c&gt; per ogni telaio per il controllo della qualità e verificare se il filopodium rimane chiaramente visibile in tutto il filmato. </li></ol> 5. Analisi delle immagini - Fase 2: generazione di traccia <ol><li> Fare clic sul pulsante &lt;3a&gt; nella finestra GUI # 1 per aprire la finestra GUI # 2 (vedere la Figura 2B ). </li><li> Fare clic sul pulsante &lt;4&gt; nella finestra GUI # 2 per generare la maschera del corpo cellulare sovrapposto (generato nella finestra GUI # 1 dopo aver fatto clic su &lt;1a&gt;). Il programma genera anche il limite della maschera, in cui è attuato lo scafo convesso per ottenere i punti di vertice. </li><li> CliTasto ck &lt;5&gt;; Apparirà un cursore. Utilizzare il cursore per selezionare la base (da dove viene misurata la distanza della punta filopodiale) seguita dalla punta della filopodia nel fotogramma in cui viene prima visualizzata. A tale scopo, spostare il dispositivo di scorrimento in Finestra # 2). NOTA: Per ridurre al minimo gli errori nell&#39;uscita dati, posizionare il punto di base verticalmente sotto la punta filopodiale lungo l&#39;asse. Posizionare il punto di base in altri luoghi ( ad es. Spostato lateralmente) può introdurre una polarizzazione direzionale nei valori di fluorescenza all&#39;interno del corpo cellulare. </li><li> Selezionare la lunghezza della soglia (sopra la quale la filopodia si piegherà) usando &lt;6c&gt;. Nota: Questa lunghezza è definita come la distanza tra il punto base (selezionato con &lt;5&gt;) e il limite del corpo cellulare ( cioè la regione da dove inizia la filopodia). La distanza misurata è in pixel. </li><li> Specificare il numero di segmenti utilizzati per approssimare la forma della filopodia nella casella &lt;6a&gt;. NOTA: il mIl numero di segmenti inimum dipende dalla lunghezza massima raggiunta dal filopodium, ma anche dal modo in cui il filopodium si curva. Non selezionare un numero di segmenti più grandi del numero di pixel tra la base e la punta ( cioè la lunghezza della soglia). Selezione di più segmenti rispetto alla lunghezza della soglia definita al punto 5.4. ( Cioè il numero di pixel tra base e punta) comporterà una sovrastima della lunghezza del filopodium. </li><li> Specificare la larghezza di scansione, che funge da scanner orizzontale per inserire i nodi, in &lt;6b&gt;. NOTA: Questi nodi vengono utilizzati dal programma per adattarsi alla linea che unisce la base e la punta con il corpo del filopodium ( cioè per creare la spina dorsale). Come punto di partenza, metti un valore in pixel pari alla lunghezza massima moltiplicata per un fattore di <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> Specificare il raggio di scansione (in pixel) nella casella &lt;6d&gt;. Utilizzare un valore che è circa il 50% più grande dell&#39;obHa servito lo spostamento della punta inter-frame. NOTA: Utilizzando un raggio di scansione molto grande potrebbe prendere punti indesiderati a scomparti convessi in strutture in cui non è presente alcuna punta filopodiale reale ( ad es. Fuori movimento piano o bassa SNR). </li><li> Specificare l&#39;angolo di piegatura nella casella &lt;6e&gt;. NOTA: La soglia angolare è determinata dall&#39;angolo massimo del filopodium che si piega durante l&#39;intera analisi. La specificazione della soglia di angolo aiuta il software ad escludere il monitoraggio delle strutture indesiderate che crescono dal lato della filopodia quando la filopodia si piega verso il corpo cellulare. Il programma funziona in modo affidabile per filopodia con angoli di inclinazione inferiori a 45 gradi rispetto all&#39;asse verticale. </li><li> Per avviare il tracciamento, fare clic sul pulsante &lt;Track &amp; Analyze&gt; nella finestra GUI # 2. Fai clic sulla casella &quot;Storia traccia&quot; nella finestra di interfaccia GUI # 2 per salvare l&#39;intero protocollo di monitoraggio per futuri riferimenti. NOTA: Dopo che la procedura di monitoraggio è completa, la lunghezza del filopodium in ogni fotogramma viene memorizzataIl foglio denominato &#39;length_vel&#39; di &#39;dynamics.xlsx&#39; per riferimenti futuri. Allo stesso modo, tutti gli altri parametri di tracciamento vengono memorizzati nel foglio denominato &quot;parametri&quot; di &quot;dynamics.xlsx&quot;. </li><li> Facoltativamente, se la filopodia non viene rilevata automaticamente in tutti i fotogrammi, correggere manualmente le seguenti operazioni. <ol><li> Visitare il rispettivo fotogramma utilizzando il cursore nella finestra # 2 e selezionare manualmente la punta del filopodium. Nota: i fotogrammi, in cui non vengono rilevati punti di scafo convessi, saranno rappresentati da una regione blu nella finestra di monitoraggio della finestra di interfaccia GUI # 2. È obbligatorio controllare il pulsante &quot;Storia traccia&quot; prima di avviare il programma di monitoraggio per accedere alle coordinate nodali in quel fotogramma. </li><li> Selezionare i punti di riferimento (base seguito dalla punta) usando &lt;6f&gt; nella finestra GUI # 2. Specificare gli altri parametri come &quot;lunghezza della scansione&quot;, &quot;misurazione accurata dopo&quot; e &quot;angolo di flessione massimo&quot;; Per quella cornice come descritto nei passaggi 5.4-5.8. </li><li> Fai clic sul pulsante &lt;6i&gt; per salvare i nuovi parametri (specifici di quel fotogramma). I passi devono essere ripetuti per tutti i frame indicati dalla regione blu. </li><li> Al termine, reinizializzare la procedura di tracciamento utilizzando &lt;7&gt;. NOTA: Questa correzione può essere utilizzata anche se il programma passa improvvisamente da un filopodiale ad un altro all&#39;interno di un filmato. In alternativa, prendi in considerazione i filmati che contengono più filopodi. </li></ol></li></ol> 6. Analisi delle immagini - Passo 3: Analisi della proteina spaziale-temporale <ol><li> Per l&#39;analisi spazio-temporale, selezionare la casella rappresentata da &lt;8b&gt; seguita dal canale proteico di interesse (&lt;8c&gt; e / o &lt;8d&gt; e / o &lt;8e&gt;). Nota: è obbligatorio selezionare la proteina A prima dell&#39;analisi ratiometrica (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; e / o &lt;9c&gt;) poiché la proteina A viene utilizzata come riferimento. </li><li> Fai clic su &lt;8a&gt;Per avviare il tracciamento delle proteine ​​lungo la lunghezza filopodiale utilizzando la traccia generata nel passaggio 5.9. </li></ol> 7. Analisi delle immagini - Fase 4: Analisi proteica rapporto-metrica <ol><li> Seleziona la casella di controllo &lt;9b&gt; o &lt;9c&gt; e fai clic sul pulsante &lt;9a&gt; per ottenere la trama ratiometrica spazio-temporale. NOTA: Per evitare la falsa rappresentazione della concentrazione di proteine ​​relativa, l&#39;immagine ratiometrica non viene tracciata come X / Y ma come log (X / Y). Per uso futuro, la traccia ratiometrica viene esportata in file di formato &#39;.png&#39; e &#39;.fig&#39; e i dati della trama crudi vengono memorizzati nel file &#39;dynamics.xlsx&#39;. </li></ol> 8. Analisi delle immagini - Passo 5: Analisi filopodiale delle punte <ol><li> Selezionare la casella &lt;8f&gt; e specificare la lunghezza e la lunghezza della punta dalla base usando &lt;8g&gt; e &lt;8h&gt;. Fare clic su &lt;pulsante&gt; per salvare i dati nel file &#39;dynamics.xlsx&#39;. Clicca su &lt;Analizza le intensità proteiche&gt; per generareTraccia delle intensità proteiche della punta filopodiale e per salvare l&#39;analisi ratiometrica. NOTA: La lunghezza del puntale determina il numero di pixel della punta utilizzata per l&#39;analisi. Il software restituirà il valore di intensità media dei pixel alla punta su ogni fotogramma. La lunghezza della soglia determina la distanza minima dalla base alla punta sopra la quale il filopodium (punta filopodiale) inizia a crescere (e quando il programma inizia a seguire il valore di intensità della punta). Quindi la lunghezza della punta deve essere inferiore alla lunghezza della soglia. </li><li> Fai clic sul rapporto desiderato da analizzare usando &lt;9d&gt; o &lt;9e&gt;. </li><li> Fare clic sul pulsante di confronto &lt;9a&gt; per generare i dati ratiometrici. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per il monitoraggio delle dinamiche di crescita filopodale e l&#39;analisi di concentrazioni di proteine ​​relative in queste strutture dinamiche attraverso l&#39;algoritmo convesso. Utilizzando il software, fino a 3 canali possono essere confrontati in coppia in una singola esecuzione, per cui le relative concentrazioni di due canali ( cioè le proteine) vengono determinate durante il ciclo di estensione / ritrazione e memorizzate come file immagine e dati in cartelle separate. Oltre alle operazioni di routine, il software fornisce anche una serie di parametri che possono essere modificati per ottimizzare l&#39;analisi per il rispettivo esperimento. Una descrizione dettagliata di queste modifiche e la risoluzione dei problemi possono essere trovate nella sezione del protocollo e nella tabella 1 . L&#39;analisi delle immagini non è limitata a un particolare tipo di microscopio, ma alla qualità dell&#39;immagine della serie temporale. Considerando la sua pertinenza, la qualità dell&#39;immagine dovrebbe essere ottimizzata per eCanale durante l&#39;acquisizione. I nostri esperimenti mostrano che l&#39;algoritmo funziona meglio per filopodia con SNR&gt; 4 acquisite a 1 Hz utilizzando un obiettivo con ingrandimento superiore a 40X e nessun pixel di binning. Naturalmente, questo vale solo finché i fluorofori sono compatibili con le impostazioni del filtro ( vale a dire senza sfiato, vedere la sezione 2 del protocollo per dettagli). Considerando che le intensità relative sono confrontate l&#39;una contro l&#39;altra, l&#39;analisi non è sensibile a piccole differenze nelle intensità del segnale assolute di fluorescenza tra le singole cellule. Pertanto, per dedurre dati significativi, un canale di riferimento ben definito ( p.es. marcatore citosolico) è di grande importanza. Tuttavia, anche se la qualità dell&#39;immagine è buona, ci sono alcune limitazioni biologiche. Per esempio, non è adatto ad analizzare strutture che si ramificano, inclinano più di 45 gradi dall&#39;asse ortogonale alla superficie cellulare o in cui altri oggetti stanno attraversando la struttura che viene studiata. &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Oltre a queste limitazioni sperimentali, ci sono punti critici all&#39;interno del protocollo che devono essere considerati quando si utilizza il software, in quanto ciò potrebbe in altri casi causare messaggi di errore. In primo luogo, i canali corrispondenti ad una particolare proteina devono avere una stessa dimensione e rappresentano esattamente lo stesso ROI. In secondo luogo, i file impilati devono essere in formato &#39;.tiff&#39; in formato grigio. In terzo luogo, i file di immagini impilati devono trovarsi nella cartella di lavoro. E infine, i nomi dei file di dati nella cartella di lavoro non devono essere modificati, a meno che non sia corretto nel codice. Come si confronta lo script con altri metodi esistenti? Per sondare il nostro software di analisi delle immagini, abbiamo scaricato una serie di soluzioni software recentemente pubblicate che analizzano le funzionalità filopodiali 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 e ha testato tutti per un certo numero di criteri selezionati. Un confronto dettagliato è riportato nella tabella 2 . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Tsygankov et al. </td><td> Barry et al. </td><td> Nilufar et al. </td><td> Fanti et al. </td><td> Constantino et al. </td><td> Hendri- Cusdottir et al. </td><td> Tarnok et al. </td><td> Saha et al. </td></tr><tr><td> Documento DOI </td><td> 10,1083 / jcb.201306067 </td><td> 10,1083 / jcb.201501081 </td><td> 10,1186 / 1752-0509-7-66 </td><td> 10.1002 / dneu.20866 </td><td> 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 </td><td> 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 </td><td> 10.1002 / cyto.a.22569 </td><td> 10,1091 / mbc. E16-06-0406 </td></tr><tr><td> Software (download link) </td><td> http: //www.hahnlab. com / tools / IL softwarepage. html </td><td> http: // JCB-DataViewer. rupress.org/jcb/ sfogliare / 9059 / </td><td> http: //www.perkinslab .ca / pub / NMLP20XX. html </td><td> http: //www.ifc. unam.mx/ FFM / download.html </td><td> http: // fournierlab. mcgill.ca/ stile-7 / fTracker.html </td><td> https: // fdynamics. wordpress.com/ </td><td> http: // cnblab. elte.hu/dfma </td><td> https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&amp;L=1 </td></tr><tr><td> Tipo di programma </td><td> Matlab </td><td> ImageJ </td><td> Matlab </td><td> ImageJ </td><td> Matlab </td><td> Matlab </td><td> ImageJ </td><td> Matlab </td></tr><tr><td> operazione </td><td> automatizzato </td><td> automatizzato </td><td> automatizzato </td><td> semiautomatico </td><td> semiautomatico </td><td> semiautomatico </td><td> semiautomatico </td><td> semiautomatico </td></tr><tr><td> Analisi singola / batch </td><td> entrambi </td><td> entrambi </td><td> singolo </td><td> singolo </td><td> singolo </td><td> singolo </td><td> singolo </td><td> singolo </td></tr><tr><td> Analisi intere cellule vs subregione </td><td> totale </td><td> totale </td><td> entrambi </td><td> entrambi </td><td> entrambi </td><td> sub </td><td> sub </td><td> sub </td></tr><tr><td> Multiplo / filopodia individuale </td><td> multiplo </td><td> multiplo </td><td> multiplo </td><td> multiplo </td><td> multiplo </td><td> ind </td><td> ind </td><td> ind </td></tr><tr><td> L&#39;identificazione filopodiale e l&#39;ispezione visiva possibile </td><td> sì </td><td> sì </td><td> no </td><td&gt; yes </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td></tr><tr><td> Elaborazione delle immagini possibile </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> sì </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> sì </td></tr><tr><td> Lunghezza filopodiale </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td></tr><tr><td> Dinamiche di crescita filopodiale </td><td> sì </td><td> sì </td><td> no </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td></tr><tr><td> Vita filopodiale </td><td> sì </td><td> sì </td><td> no </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td><td> sì </td></tr><tr><td> Analisi ratiometrica in filopodia </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> no </td><td> Sì &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Uscita / formato di archiviazione </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td><td> Immagini / file di dati </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Panoramica delle soluzioni di analisi delle immagini assistite software per la quantificazione di Filopodia. Dalle otto soluzioni software di analisi sperimentale, cinque sono state gestite tramite Matlab, mentre le altre tre utilizzate ImageJ. Due soluzioni software ( tabella 2 a sinistra) sono state completamente automatizzate e ottimizzate per l&#39;analisi in batch della durata, della durata e della dinamica di filopodia in celle intere. Delle sei soluzioni software rimanenti, cinque richiedevano ulteriori input manuali ( cioè semiautomatici), mentre uno era completamente automatizzato. Tuttavia, solo thLe soluzioni semi-automatizzate forniscono informazioni dettagliate sulle dinamiche di crescita di filopodia, sul tempo di vita e sull&#39;identità. Tra questi cinque rimanenti, tre sono stati ottimizzati per l&#39;analisi subcellulare della singola filopodia, mentre due potrebbero elaborare più filopodi in parallelo. Importante, da tutte le otto soluzioni software testate, solo un approccio consentiva di combinare informazioni sulle dinamiche di crescita filopodiale con la localizzazione proteica della proteina all&#39;interno di queste strutture a dito ( tabella 2 , a destra). Sebbene il nostro software di analisi delle immagini non sia adatto per analisi automatiche di batch o intero cellulare, la quantificazione di una filopodia isolata richiede solo pochi minuti. Quindi, immaginiamo che la quantificazione delle dinamiche proteiche in 40-50 filopodi sia fattibile in un solo giorno con il software attuale. Al contrario, le schermate ad alto rendimento possono richiedere ulteriori modifiche al codice per semplificare l&#39;immissione e l&#39;immagazzinamento di migliaia di singoli filopodi in un sistema automatizzatomaniera. Sulla base dei parametri necessari, altre soluzioni software esistenti possono quindi essere più adatte ad un tale approccio. Tenendo presente queste limitazioni, il software fornisce una piattaforma affidabile per indagare la concentrazione proteica spazi-temporale in strutture protrusive come le cellule. Considerando che le filopodie non sono le uniche strutture cellulari, è plausibile immaginare che il software di analisi delle immagini presentato possa anche essere adatto a studiare la dinamica delle proteine ​​in altri processi biologici ( ad es. Neuriti, cilia primaria).

Il controllo spazio-temporale delle proteine ​​regolatrici dell&#39;atina è associato alla dinamica dei filopodium 1 , 2 . Il monitoraggio della concentrazione proteica spazialmente risolto lungo tutta la lunghezza filopodiale nel tempo è quindi cruciale per favorire la comprensione dei meccanismi che sottendono l&#39;iniziazione, l&#39;allungamento, la stabilizzazione o il crollo di queste strutture dinamiche 3 , 4 . A differenza dell&#39;analisi proteica nel citosolo, in cui si verificano molteplici cambiamenti di forma cellulare in una scala più ampia, le filopodie sono microstrutture dinamiche che costantemente stringono 5 e si curvano, evitando così l&#39;analisi utilizzando un approccio semplice come una scansione di linea. Diverse soluzioni software per il monitoraggio della forma filopodiale sono disponibili 6 , 7 , 8 , 9 . LikewÈ stato sviluppato software per il tracking ratiometrico delle dinamiche proteiche all&#39;interno del corpo cellulare 10 , 11 . Per combinare il monitoraggio automatizzato della forma filopodiale e dell&#39;analisi proteica spaziometrica, abbiamo recentemente sviluppato un software di analisi delle immagini basato sull&#39;algoritmo convesso 12 . Questo nuovo metodo di analisi, gestito tramite un&#39;interfaccia grafica (GUI), combina per la prima volta la concentrazione di proteine ​​relativa lungo la lunghezza filopodiale e la velocità di crescita, consentendo così la misurazione accurata della distribuzione proteica spazi-temporale indipendente dal movimento di queste Strutture dinamiche 12 . L&#39;idea dietro il software (codice sorgente è liberamente disponibile, vedi sotto) è che uno dei vertici dello scafo convesso coinciderà con la punta del filopodium ( Figura 1A ). Guardando nella cornice successivaR il vertice più vicino dello scafo convesso, la punta in movimento può essere tracciata in tutto il filmato. Una volta che la punta viene rilevata in ogni telaio, la sua posizione viene usata per disegnare un asse unendosi alla punta con un punto di riferimento alla base del filopodium ( figura 1B ). Infine, usando punti nodali equidistanti, le cui posizioni sono determinate dal pixel mediano con intensità massima lungo la linea ortogonale all&#39;asse, vengono utilizzati per determinare una spina dorsale che segue la forma filopodiale. Approfittando di questa base adattativa, viene generato un kymograph per tracciare la crescita filopodiale e le concentrazioni proteiche per un massimo di tre canali lungo la lunghezza filopodiale ( Figura 1C ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Figura 1: Principio di funzionamento del software di analisi delle immagini. ( A ) L&#39;algoritmo dietroil software. In Step1 l&#39;utente specifica il riferimento (base) e il vertice (la punta) del filopodium. Nel passaggio 2-1 si ottiene la spina dorsale del filopodium usando il pixel mediano con il valore massimo di intensità. Nel passaggio 3 la spina dorsale è utilizzata per il profilo di intensità proteica spaziale. Nel passaggio 2-2 il software segue automaticamente la punta nel fotogramma successivo. L&#39;intera procedura si estende. ( B ) Snapshot dell&#39;algoritmo con filopodium reale introducendo elementi importanti come lo scafo convesso che viene utilizzato per il tracciamento. ( C ) Panoramica dei parametri che possono essere misurati con l&#39;algoritmo. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Il software di analisi delle immagini viene utilizzato in Matlab (indicato come software di programmazione) tramite un uso graficoR interfaccia. Per massimizzare la flessibilità e la robustezza per la particolare impostazione sperimentale, l&#39;utente può regolare una serie di parametri di tracciamento ( ad esempio l&#39;angolo di flusso consentito e il movimento inter-frame) e anche fare alcune correzioni ai filmati ( ad es. Ritaglio, rotazione, rimozione di oggetti indesiderati) ( Figura 2A e Tabella 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> No. </td><td> Obbligatorio </td><td colspan="5"> Descrizione </td><td> Nome (in GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Caricare un file .tiff impilato che rappresenta il corpo cellulare (con casella controllata) o crea un corpo cellulare sovrapposto dai canali </td><td> Corpo cellulare </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Caricamento di file di immagini sovrapposte che corrispondono alla proteina 1 </td><td> Proteina 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Caricamento di un file di immagine impilato corrispondente alla proteina 2 </td><td> Proteina 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Caricare il file di immagine sovrapposto alla proteina 3 </td><td> Proteina 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> Ripristina tutti i file di immagine impilati precaricati </td><td> Reset </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra di scorrimento per determinare il frame iniziale per l&#39;analisi nella finestra GUI # 2 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra di scorrimento per determinare il frame finale per l&#39;analisi nella finestra GUI # 2 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra di scorrimento che rappresenta la curraNt frame </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5"> Il valore grigio dei pixel al di sotto di cui tutti i pixel saranno impostati su zero </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> Il valore grigio dei pixel al di sopra del quale tutti i pixel saranno impostati sui valori massimi </td><td> N / A </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> Impostare i valori di intensità dei pixel specificati da &lt;2e&gt; e &lt;2f&gt; </td><td> Impostato </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2g </td><td> N </td><td colspan="5"> Riprodurre il filmato regolato dall&#39;intensità </td><td> Giocare </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> Ritaglia l&#39;immagine </td><td> raccolto </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> Ruota l&#39;immagine </td><td> Ruotare </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2J </td><td> N </td><td colspan="5">Cancellare le regioni in tutta la pila </td><td> Elimina regioni </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Fare clic per aprire la finestra di analisi (finestra GUI # 2) </td><td> Finestra di monitoraggio </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Immettere le dimensioni di un pixel in micron </td><td> Inserisci dimensione pixel </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Fare clic per generare l&#39;immagine del bordo / bordo del corpo cellulare sovrapposto </td><td> Confine </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clicca per selezionare la base e la punta della filopodia </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Inserisci il numero di segmenti o nodi </td><td> No di segmenti </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Inserisci la lunghezza della scansione (perpendicolare all&#39;asse) </td><td> Larghezza di scansione </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Immettere la lunghezza sopra la quale filopodia inizia a piegarsi </td><td> Accurate misura dopo </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Inserisci il raggio del cerchio di rilevamento della punta (ovvero l&#39;area in cui il vertice può essere localizzato nel fotogramma successivo) </td><td> Raggio di rilevamento delle punte </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Inserisci l&#39;angolo massimo che il filopodium può piegarsi dall&#39;asse verticale </td><td> Soglia di angolo </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5"> Aggiungere punti di riferimento per la base e la punta per quella specifica cornice </td><td> Seleziona il riferimento </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6g </td><td> N </td><td colspan="5"> Immettere la lunghezza sopra la quale filopodia inizia a piegarsi per quel particolare fotogramma </td><td> Accurate misura dopo </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> Inserisci il raggio del cerchio di rilevamento per quel fotogramma specifico </td><td> Raggio di rilevamento delle punte </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> Dopo aver inserito tutti i parametri per il frame specifico cliccare per memorizzare i valori in memoria e file per ulteriori riferimenti </td><td> Inserisci </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5"> Fare clic per eliminare i parametri impostati manualmente per quel fotogramma </td><td> Elimina </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6K </td><td> N </td><td colspan="5"> Fare clic per eliminare tutti i parametri memorizzati manualmente utilizzando il pannello delle funzioni opzionali per tutti i fotogrammi </td><td> Reset </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6L </td><td> N </td><td colspan="5"> Accedere prima del monitoraggio per memorizzare tutti i risultati di monitoraggio in memoria per futuri riferimenti </td><td> Traccia di storia </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Fai clic per avviare il tracciamento </td><td> Traccia e Analisi </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5"> Fai clic per iniziare a monitorare l&#39;intensità del canale proteico </td><td> Analizzare le intensità proteiche </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5"> Entra per monitorare l&#39;intensità del canale proteico lungo la lunghezza filopodiale </td><td> Tutta la filopodia </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5"> Entra per il monitoraggio della proteina o della proteina di riferimento A </td><td> proteína </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5"> Entra per il monitoraggio della proteina B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> Entra per il monitoraggio della proteina C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5"> Entra per tenere traccia dell&#39;intensità media della proteina in thE punta </td><td> Punta dirigente </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> Inserire la lunghezza della punta </td><td> Tip Lunghezza </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> Immettere la distanza minima dalla base sopra la quale la punta comincia a formarsi </td><td> soglia </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> Fare clic per salvare i risultati principali dell&#39;analisi dei suggerimenti in file </td><td> Premi il bottone </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5"> Fare clic per avviare analisi proteometrica delle proteine </td><td> Confrontare </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> Controlla per confrontare la proteina B rispetto a A </td><td> log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5"> Controlla per confrontare la proteina C rispetto a A </td><td> log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> Controlla per confrontare la proteina B rispetto a A alla punta </td><td> log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> Controlla per confrontare la proteina C rispetto a A alla punta </td><td> log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10a </td><td> N </td><td colspan="5"> Scegli un&#39;altra mappa a colori (impostazione predefinita: Jetplot) </td><td> Mappa del colore </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5"> Modifica la colormap </td><td> Modifica colormap </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Panoramica di tutte le funzioni presenti nella GUI Windows # 1 e # 2. Una volta raggiunto questo obiettivo, il programma crea uno scafo convesso e traccia automaticamente la punta in tutto il filmato. Parametri estratti dal film, come un kymograph ratiometrico, velocità di crescita e lunghezza filopodiale aVengono visualizzati e memorizzati nella cartella di lavoro come immagini e come file di dati. Possono poi essere estratti altri parametri, come la durata della vita filopodiale, la velocità di crescita e la frequenza di ritiro e vengono ulteriormente analizzati dai file di dati memorizzati ( Figura 2B ). <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Figura 2: Interfaccia grafica utente per l&#39;utilizzo del software di analisi delle immagini. ( A ) La finestra # 1 della GUI viene utilizzata per il caricamento e l&#39;elaborazione di immagini. Il programma può caricare fino a 3 canali proteici, per cui 2 canali vengono confrontati in coppia. La finestra viene fornita con le funzioni obbligatorie (blu) e facoltative (verde) per la pre-elaborazione delle immagini prima della tracciabilità ( B ) La finestra # 2 della GUI viene utilizzata per il monitoraggio dell&#39;analisi della proteina filopodica e spaziometrica e rapporto-metrica. Ancora una volta, le caratteristiche facoltative sono contrassegnate in verde. Questa cifra è stata modificataDal riferimento 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione del campione e la gestione del software. Iniziamo con istruzioni dettagliate sulle cellule di coltura e l&#39;acquisizione di filmati ottimizzati per l&#39;analisi delle immagini. Questa sezione relativa all&#39;acquisizione dati è seguita da una descrizione dettagliata per l&#39;utilizzo del software di analisi delle immagini. Durante tutto il protocollo, vengono introdotti passi critici e funzionalità opzionali che dovrebbero essere considerate durante la raccolta e l&#39;elaborazione dei dati. Infine, analizziamo filopodi da diversi sistemi di modello con il software di analisi delle immagini, prima di chiudere con un confronto del software di analisi delle immagini descritto con altri programmi disponibili per la quantificazione filopodiale e una discussione sulle limitazioni e la direzione futura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Le filopodie sono dinamiche, protrusioni cellulari simili a dito associate alla migrazione e alla comunicazione cellulare. Per comprendere meglio i complessi meccanismi di segnalazione sottostanti all&#39;iniziazione filosofica, all&#39;allungamento e alla successiva stabilizzazione o ritrazione, è fondamentale determinare l&#39;attività proteica spazi-temporale in queste strutture dinamiche. Per analizzare la funzione proteica in filopodi, abbiamo recentemente sviluppato un algoritmo semi-automatizzato di tracciamento che si adatta a cambiamenti di forma filopodiale consentendo così un&#39;analisi parallela delle dinamiche di protrusione e della concentrazione di proteine ​​relative lungo tutta la lunghezza filopodiale. Qui presentiamo un dettagliato protocollo dettagliato per la gestione delle celle ottimizzate, l&#39;acquisizione di immagini e l&#39;analisi del software. Inoltre forniamo istruzioni per l&#39;utilizzo delle funzioni opzionali durante l&#39;analisi delle immagini e la rappresentazione dei dati, nonché le linee guida per la risoluzione dei problemi per tutti i passaggi critici lungo la strada. Infine, includiamo anche un confronto del dSoftware di analisi di immagini escribed con altri programmi disponibili per la quantificazione filopodia. Insieme, il protocollo presentato fornisce un quadro per un&#39;analisi accurata delle dinamiche proteiche nelle protuberanze filopodiali usando il software di analisi delle immagini.

Utilizzando le cellule COS trasfettate con un marker per l&#39;actina filamentosa (f-tractina 18 , rossa) e un riferimento citosolico (verde), abbiamo trovato protrusioni filopodiali ricche di actina ( figura 3A , pannello superiore). La serie temporale ha dimostrato che la filopodia si estende e si ritrae rapidamente ( figura 3A , pannello centrale). Utilizzando il software di analisi delle immagini, abbiamo quindi tracciato singole filopodie. Il confronto della lunghezza filopodiale misurata a mano rispetto al software di analisi delle immagini ha mostrato un valore di cross-correlazione di Pearson di 0.947 sostenendo che il software ha monitorato in modo affidabile l&#39;estensione filopodiale 12 . Oltre ai tassi di crescita e di ritrazione di una singola filopodia, i kymographs in fondo alla Figura 3A descrivono anche le intensità di fluorescenza dell&#39;attina (top), il riferimento citosolico (medio) e la relativa concentrazione di actina normalizzata al citoso(In basso). Insieme, questi esperimenti dimostrano che il programma misura in modo affidabile le dinamiche di crescita e la concentrazione di proteine ​​relative allo spazio in tutto il ciclo di vita di un singolo filopodium nelle cellule COS. Successivamente, abbiamo studiato la dinamica delle filopodie nei neuroni ippocampali coltivati ​​nel mouse ( figura 3B , pannello superiore). Per questo, i neuroni sono stati trasfettati al giorno in vitro (DIV) 8 con f-tractina (rosso) e un riferimento citosolico (verde) ( figura 3B , pannello centrale). Come nell&#39;esperimento precedente, i cymografi che mostrano intensità di fluorescenza dell&#39;attina e del riferimento citosolico hanno mostrato che l&#39;arricchimento relativo dell&#39;attina precedette la formazione di filopodie esplorative dendritiche ( figura 3B , pannello inferiore). Questi risultati sono in linea con il lavoro pubblicato, descrivendo la formazione di patch ricchi di actina prima del filopodialeAllungamento 3 , 19 , 20 . <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig3.jpg" /> Figura 3: Esempi di Filopodia analizzati dal Software. ( A ) Panoramica immagine (pannello superiore) e serie temporali (centrale) delle cellule COS trasfettate con f-tractina (rosso) e marcatore citosolico (verde). Qui di seguito sono riportate diagrammi che illustrano l&#39;analisi delle dinamiche di crescita filopodiali e la relativa concentrazione di f-tractina lungo il filopodium (pannelli inferiori). ( B ) Panoramica immagine del neurone ippocampale trasfettato con marcatore citosolico (top) e serie temporali di neurone trasfettato con f-tractina (rosso) e marcatore citosolico (verde) (pannello centrale), nonché diagramma che raffigura l&#39;analisi della dinamica di crescita filopodiale dendritica E la concentrazione relativa di f-tractina lungo la sporgenza (pannelli inferiori).( C ) immagine SEM (pannello sinistro) e serie temporali di cellule HeLa trasfettate con f-tractina (pannello a destra). Notare le fluttuazioni dell&#39;intensità di fluorescenza dovuta all&#39;insufficienza filopodiale. Barre di scala = 20 μm (A, superiore), 50 μm (B, superiore), 10 μm (C, superiore). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55653/55653fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Infine, abbiamo cercato di sfidare il software monitorando la filopodia nelle celle HeLa. La filopodia nelle cellule HeLa è lunga ( figura 3C , pannello sinistro) e altamente dinamica, spesso lasciando il piano di acquisizione. Intrigante, quando si concentra sulla membrana basale, abbiamo osservato una sub-frazione di filopodia per subire una torsione elicoidale ( figura 3C , pannello superiore destro), in cui parti del filopodium transAbbandonò il piano focale. Di conseguenza, i cymografi che rappresentavano l&#39;intensità assoluta della fluorescenza della tractina f hanno mostrato variazioni d&#39;onda dell&#39;intensità di fluorescenza nel tempo ( Figura 3C , pannello a destra destro). Questo comportamento ricorda l&#39;instabilità filopodiale, un meccanismo recentemente descritto per essere utilizzato da filopodia per esercitare forze di tiro 5 . In sintesi, questi esperimenti dimostrano che il software è in grado di seguire in modo affidabile le concentrazioni di proteine ​​e le dinamiche di crescita dei filopodiali provenienti da varie origini.

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A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Presentiamo una soluzione software per il monitoraggio semi-automatico della concentrazione proteica relativa lungo la lunghezza delle protuberanze cellulari dinamiche.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Muenster.  Presentiamo una soluzione software per il monitoraggio semi-automatico della concentrazione proteica relativa lungo la lunghezza delle protuberanze cellulari dinamiche. 

Video: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Ricerca

Biologia

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visivamente monitoraggio Odore mediata durante il volo in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Un'interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine in protrusioni cellulari dinamiche