이 작품은 국립 필요 프로그램 (P200A100044) 분야의 대학원 지원을 통해 교육부에 의해 지원되었다.

주의 :이 프로토콜은 방사성 물질의 적절한 사용 교육 및 처리가 필요합니다. 베타 방사선 차폐를 포함하여,이 분석을 수행 할 때 필요한 개인 보호 장비를 사용하십시오. 폐기물 대량 실험의 세척 단계에서 생성 된 방사성 폐기물은 조심스럽게 취급되어야한다. 폐기물은 쉽게 이상 기절 또는 유출되지 않습니다 큰 통이나 병으로 수직 용기에 저장되어 있는지 확인합니다. 실험이 체결되면, 신중하게 모든 액체 폐기물을 적절하게 방사성 폐기물 컨테이너를 표시하는 전송합니다. 주의 모든 자료를 처리, 오염에 대한 작업 공간을 모니터링하기 위해 인근 가이거 카운터를 유지합니다. 참고 :이 프로토콜은 우리 그룹에서 이전에보고 된 분석의 수정 된 버전입니다. H 3 PO 4 15 Phosphohistidine 안정성이 방법을 사용하기 전에 모든지지 않은 히스티딘 키나제에 대한 테스트해야합니다. phosphohistidine 일기능 시험은 전술되었다. 키나제를 함유하지 않는 음성 대조군 (15)가 포함되어야한다. 이것은 각 샘플의 배경 신호를 감산하고, [γ- 32 P] -ATP 충분히 막으로부터 세정되는 것을 보장하기 위해 필요하다. 시약 및 재료 1. 준비 <ol><li> 세균 배양의 사전이 분석을 사용하여 히스티딘 키나제를 정화. <ol><li> 이 분석의 개발 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스 (EB101, ATCC 17802)에서 히스티딘 키나아제 (유전자 ID 1189383)을 정제. 을 NdeI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 발현 벡터 애완 23aHis-TEV로 키나아제를 복제 및 돌연변이의 D499A Vp1876를 구성 수득 부위 - 지정 돌연변이 유발을 수행한다. </li><li> 대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주에 플라스미드를 변환 및 37 ° C에서 TB 배지에서 세포를 성장한다. 암피실린 (100 μg의 / ㎖) 및 클로람페니콜와 보충 문화 (34 μg의 / ㎖), 교반과 함께 성장OD 0.6 600 (250 RPM). </li><li> 25 μM의 최종 농도로 IPTG로 단백질 발현을 유도하고, 16 ℃에서 밤새 배양 하였다. 원심 분리 (5,000 XG), 초음파에 의해를 Lyse, 원심 분리에 의해 수확 세포는 세포 파편 (18,000 XG)를 제거합니다. </li><li> 니켈 NTA 아가 로스를 이용하여 그 표지 된 키나제 정제. SDS-PAGE에 의해 순도를 확인합니다. 각 단백질 정제를 최적화하고,이 분석을 사용하기 전에 순도를 확인합니다. </li></ol></li><li> 25 mM의 H 3 PO 4 씻어 솔루션을 준비합니다. 증류 된 탈 이온수 1 L에 25 mM의 최종 농도 H 3 PO 4를 추가한다. 이 용액의 pH는 약 2.0이다. 얼음에 25 mM의 H 3 PO 4를 놓습니다. </li><li> 325 mM의 H (3)의 13 배 원액 PO 4를 준비하는 키나아제 반응을 해소하는 데 사용할 수 있습니다. 이 용액의 pH는 약 1.5이다. 얼음에 325 mM의 H 3 PO 4를 놓습니다. 참고 : H 3 PO 4 </sub&gt; 25 mM의 최종 농도에서 충분히 니트로 셀룰로오스 막에 결합에서 히스티딘에 결합되지 않은 방사성 표지 된 포스페이트를 차단하는 데 도움이 또한 반응을 소멸하고. </li><li> 4 배 160 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 600 mM의 KCl을 16 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 반응 버퍼 원액, 40 % 글리세롤을 준비합니다. </li><li> 단백질 농도 설정 방법 (브래드 포드, UV-비스 등) 히스티딘 키나아제 농도를 정량화. 16, 17의 4 배 원하는 최종 농도의 농도와 히스티딘 키나아제 용액을 준비한다. 충분한 신호를 얻기 위해 상기 반응의 최종 단백질 농도는 이상적으로 적어도 5 μM이어야한다. </li><li> 4 배 방사성 표지를 준비 레이블이없는 ATP의 적절한 배 농도 표시와 -ATP 솔루션 [32 P γ-] : 실험에 대한 레이블이없는 비. 주 :이 조합에 포함되어야 [γ- 32 P] -ATP의 양은 ^ [양에 의존7 - 32 P] -ATP는 궁극적으로 각 반응에 발견됩니다. 반응 당 5 μCi를 - 우리는 0.1 사이에 이르기까지 최종 농도로 적절한 신호를 얻을 수있다. 레이블이 지정되지 않은 ATP 비율 주어진 실험에서 모든 반응에 대해 일정하게 유지 될 : 표지는 것이 중요합니다. 모든 농도에 걸쳐 표지되지 않은 ATP 비율 전율 : 여러 ATP 농도가 요구되는 경우가 아니라 표식을 지킬 희석액이 만들어 져야한다. 최종 ATP 농도는 일반적으로 10 μM 적어도 1 ㎜의 범위, 각 농도 안정적인 운동 데이터를 얻기 위해 중으로 분석한다. </li><li> 96- 웰 점 오점 장치 <ol><li> 니트로 셀룰로오스 막 (0.2 μm의 기공 크기)의 8cm X 12cm 조각을 잘라. </li><li> 멤브레인 장치는 밀폐되고, 모든 웰을 완전히 막에 의해 커버되도록 적합 보장 도트 블롯 장치에 위치 니트로. 올바르게 조립하면 진공 APPL이면, 공기 누설이 없어야IED. </li><li> 여액을 수집하기 위해, 2 가지 부착 플라스크에 상기 장치를 연결한다. 밸브 스템에서, 상기 장치는 편안 보조 플라스크 팁없이 사용될 수 있도록 적절한 배관을 연결한다. </li><li> 흡인기 / 진공 원에 2 차측 암 플라스크를 연결합니다. </li><li> 상기 장치가 완전히 장치에 진공을인가하여 밀봉되는 것을 테스트한다. 상기 장치가 올바르게 조립되어있는 경우, 강한 진공 웰 모두 존재할 것이다. 모든 튜브 연결은 파라 필름으로 포장 될 수있다 또는 꽉 밀봉을 보장하기 위해 포장 사란. </li><li> 선택적으로, 잘 하나에 반응 버퍼의 진공, 피펫 100 μL를 테스트합니다. 진공이 잘 통해 멤브레인에 모든 액체를 그릴 수있을 정도로 견고해야한다. </li><li> 모든 샘플은 막에서 발견 될 준비가 될 때까지 진공을 해제합니다. </li></ol></li></ol> 2. 반응 개시 및 담금질 <ol><li> 반응 성분의 혼합 <ol><li> 이전 initi에반응 버퍼가 -ATP (1.6) [32 P γ-, 히스티딘 키나제 (1.5), (섹션 1.4 참조), DDH 2 O : ATION, 4 배의 재고 솔루션으로 네 반응 성분을 준비 </li><li> 반응 완충액, 히스티딘 키나아제 같은 부피 섞은 DDH 2 O. 이러한 반응 성분이 단시간 (10 분) 동안 상온에서 평형을 허용. 주 : 최종 반응 부피는 실험 시간에 따라, 효소 - 의존성 또는 기판에 의존하는지 여부에 의존한다. 여러 분취 원하는 시점에서 동일한 반응 취하여 급냉 될 때 시간에 따른 반응은 커야한다. 반응 부피는 원하는 시점의 개수에 의존 할 것이다. 상기 분석은 반응 30 μL를 포함하는 니트로 셀룰로오스 막에 각각의 스폿에 최적화되어있다. 10 시간 지점이 요구되는 경우, 따라서, 상기 반응 부피는 적어도 300 μL이어야 (높은 용적 같은 330 μL 피펫은 에러 발생시 바람직 할 것이다).효소와 기질에 의존하는 실험은 작은 반응 볼륨을 필요로한다. 이 니트로 셀룰로오스 막에서 목격되는 최종 부피는 이들 실험의 반응 부피는 30 μL로 작을 수있다. </li><li> 반응을 개시하기 위해 반응 [32 γ- P] -ATP 용액 1 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 타이머로 반응 경과 시간을 추적하고, 반응은 원하는 시간 동안 진행하도록 허용한다. </li><li> 반응을 종결 반응에 얼음처럼 차가운 325 mM의 H (3)의 총 반응 볼륨 PO 4의 1/13을 추가로 pipetting 아래로 혼합합니다. 또한, 325 mM의 H 3에 대한 반응 PO 4의 나누어지는을 추가합니다. 참고 : H 3 PO 4의 최종 농도는 충분히 반응을 해소하기 위해 25 mm 이상이어야한다. 예를 들어, 30 μL 반응에 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO 4를 추가 또는 &lt;30 μL 반응 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO를 추가서브&gt; 4. 반응의 최종 pH는 약 4.0이다. H 3 PO 4의 이러한 농도는 테스트 phosphohistidine 저하없이 버퍼의 키나아제 반응을 종결 확인되었다. <ol><li> 예를 들어, 7.5 μL [γ- 32 P] -ATP와 반응을 개시 7.5 배 μL 반응 완충액, 7.5 μL 4X 히스티딘 키나아제, 7.5 μL DDH 2 O. 섞는다. 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO 4의 반응을 끄다. </li></ol></li><li> 모든 반응이 종료 될 때까지 즉시 얼음에 급냉 반응을 놓습니다. 참고 효율을 최대화하기 위해, 모두 반응 할 때까지 매 15 또는 20 (S)가 개시되어 하나의 반응을 시작하는 것이 바람직하고, 소정의 반응 시간이 경과 한 후에 모든 켄칭 될 때까지, 하나의 반응을 매 15 초 또는 20 초 급랭. 처음 분석을 사용하는 사람들을 위해, 더 긴 간격이 더 관리 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3.이 보인다 오니트로 셀룰로오스에 F 담금질 반응 <ol><li> 96 웰 점 오점 장치에 진공을 시작합니다 <ol><li> 보조 용기에 미리 조립 된 96 웰 점 오점 장치 (1.7 절)을 놓습니다. 장치 및 막 사용 후 방사성되는 바와 같이, 상기 장치는 쉽게에서 분해 될 때까지 이러한 용기는 충분히 커야한다. </li><li> 96 웰 점 오점 장치에 진공을 적용합니다. </li><li> 상기 장치는 진공 하에서되면 신중 각 웰에서 니트로 셀룰로오스 막 상으로 직접 켄칭 반응 피펫. 모든 반응이 막에로드 될 때까지 반복합니다. 니트로 셀룰로오스의 결합능 때문에 (75-110 μg의 / cm 2)에 올바르게 장착 할 때 거의 모든 키나제는 세포막에 결합하는 것으로 발견 될 수있다 히스티딘 키나아제의 양보다 크다. 참고 : 사용되는 장치에 따라, 치료는 니트로 셀룰로오스에 구멍을하지 않도록주의해야합니다. 반응 모두 번째와 연락을했음을 관찰전자 니트로 셀룰로오스. 일부 또는 모든 반응이 웰의 벽에 부착하고, 니트로 셀룰로스에 도달하지하는 것이 용이하다. </li><li> 얼음처럼 차가운 25 mM의 H 3 PO 4의 100 μL로 우물을 씻으십시오. 이 모든 반응을 완전히 로딩을 보장 막에 도달하는 웰에 포획되었을 수있는 반응 부피를 허용 할 것이다. 전체 볼륨이 멤브레인을 통과 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장치를 해체하고 니트로 셀룰로오스 막에 전사 <ol><li> 조심스럽게 진공을 차단하기 전에 장치를 분해. 장치 및 니트로 셀룰로오스 막 모두가이 시간에 방사성 있음을 알려드립니다. 이 시간에 차 컨테이너에서 모든 장치의 구성 요소를 제거하지 마십시오. </li><li> 집게로 조심스럽게 약 200㎖에 25 밀리미터 빙냉 H 3 PO 4 컨테이너에 장치로부터 니트로 셀룰로오스 막 옮긴다. 세척은 라디에이터 수있는 바와 같이,이 용기에 뚜껑을 배치oactive. 이때, 진공이 차단 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 니트로 셀룰로오스 처리 <ol><li> 니트로 셀룰로오스 세척 <ol><li> 로커의 세척 막과 용기를 놓습니다. 막 부드럽게 20 분 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 20 분 후, 조심스럽게 큰 버킷에 사용할 세척액 임시 폐기물 저장에 사용되는 디 캔트. 막 반복에 얼음처럼 차가운 25 mM의 H 3 PO 4의 200 ㎖를 추가합니다. 참고 : 적어도 세 20 분 세척 배경 막에서 -ATP 신호 [32 P γ-] 제거하는 것이 필요하다. 세 번째 세척 후, 가이거 카운터와 방사선의 사용 세척 솔루션을 테스트합니다. 신호가 세척 용액에 존재하지 않을 때까지 상술 한 바와 같이 상기 멤브레인을 세척 계속. </li></ol></li><li> 니트로 셀룰로오스 건조 <ol><li> 막 충분히 세척 한 후, 간단히 공기 건조를 막을 수 있습니다. 이것은 일반적으로 5 분 이하 소요됩니다.</li></ol></li></ol> 저장 형광체 화면 5. 노출 참고 :이 섹션은 선택 사항입니다. 형광면에 막을 노출시키는 단계는 상기 멤브레인의 각 지점에서의 방사성 표지 된 키나제의 강도의 시각화를 허용하는 것이 유리하다. 이러한 스폿의 상대 강도가 ​​각각의 스폿에서의 인산화 히스티딘 키나아제의 양에 정비례한다. 또한 부 (7)에서 생성되는 행의 강도를 화상 처리 소프트웨어를 정량화 할 수 있고, 이러한 결과를 비교할 수 있으며,이 단계는 품질 관리를 허용한다. 이 검사에서 볼 수 이상이 섬광 계수에서 얻은 불규칙한 결과를 설명 할 수 있습니다. <ol><li> 형광면 준비 <ol><li> 저장 형광면에 막을 노광하기 전에, 5 분 이상 백색광 형광면을 노출. 이것은 스크린에 의해 유지 될 수있는 임의의 잔상이 소거되는 것을 보장한다. </li><li> 화면이 깨끗한 지 확인건조. 필요한 경우, 부드럽게 화면 제조 업체에 의해 승인 형광체 화면 청소 용액으로 화면을 청소, 건조 닦아냅니다. </li></ol></li><li> 니트로 셀룰로오스 막 제제 <ol><li> 조심 형광면 손상으로부터 잔류 수분을 방지하기 위해 얇은 플라스틱 랩 드라이 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 포장. 주름이나 기포가 더 없는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 형광체 화면에 노출 <ol><li> 스토리지 형광체 화면 카세트에 랩 된 니트로 셀룰로오스 막 배치 막 상에 스크린면이 아래를 놓고 카세트를 닫습니다. 카세트를 열거 나 노출시 막 이동은 두 번이나 얼룩 져 이미지를 캡처하는 원인이됩니다대로, 형광체 화면을 스캔하는 시간이 될 때까지 멤브레인을 이동하지 마십시오. </li><li> 한 형광면 제조 있듯이 적어도 4 시간 동안 노출하거나. </li><li> 노광이 완료되면, 형광면을 스캔하여 형광 스캐너로 이미지를 캡처. </li></ol></li></ol> 섬광 계수에 대한 니트로 셀룰로오스 막 준비 (6) <ol><li> 폰소 s 염색과 탈색 <ol><li> 간단히 폰소 s 염색 액에 담가 니트로 셀룰로오스 막 (0.1 % 폰소 s를 (W / v)의 5 % 아세트산) 1 - 2 분. 탈색하기 전에 얼룩 전체 막을 젖은. </li><li> 막에서 초과 폰소 s를 가만히 따르다. </li><li> 히스티딘 키나제 만 반점이 물들 때까지 DDH 2 O와 멤브레인을 씻어. 모든 관광 명소 단백질의 검출 금액을 포함 할 경우이 절차에만 작동합니다. 참고 :이 단계는 키나제는 니트로 셀룰로오스에 결합되어 있는지 확인하는 것이 필요하고, 그 단백질 로딩도 모든 장소에 걸쳐있다. 또한 발견 키나아제 용이 막으로부터 절단 할 수있다. </li></ol></li><li> 관광 명소를 절단 <ol><li> 가위를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 각각 자리를 잘라. 아론 완벽하게 절단 할 필요가 없습니다g 염색 스폿의 가장자리; 막 충분히 세척 한 경우, 때문에 잘라 관광 명소의 다양한 크기 배경은 무시할 수 있습니다. 각 반응에 대한 전체 자리를 잘라 만 중요합니다. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 섬광 유리 병에 각각 자리를 옮긴다. 32 P가 체렌 코프 효과에 의해 쉽게 검출 할 어떠한 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 참고 : 또는, 그 자리가 날카롭게 코르크 구멍 뚫는을 사용하여 절단 할 수 있습니다. 코르크 구멍 뚫는와 니트로 셀룰로오스에서 각 지점을 제거하고 핀으로 섬광 유리 병에 밀어 넣습니다. 이 방법으로, 상기 멤브레인은 상기 방사선 노출을 최소화 접촉 할 필요가 없다. </li></ol></li><li> [γ- 32 P] -ATP 솔루션의 결정 CPM / pmol의 <ol><li> 의 명소 몇 희석 1cm 니트로 셀룰로오스의 X 1cm 사각형 위에 -ATP 용액 (1.5 절) 32 P γ-]. 간단히 공기 건조. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 섬광에 각각의 광장을 전송유리 병. 어떤 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 이들 샘플은 ATP 용액의 CPM / pmol의을 결정하는 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. </li></ol></li></ol> 7. 섬광 계수 <ol><li> 섬광 계수기 카세트에 모든 섬광 튜브를로드합니다. 섬광 계수기로로드 카세트. </li><li> 각각의 병에 대한 CPM을 측정하는 섬광 계수 프로그램을 실행합니다. 이러한 데이터는, (6.3)에서 방사성 표지 된 ATP 믹스 CPM / pmol의 함께 각 스팟에 존재하는 인산화 히스티딘 키나아제의 양, 및 따라서 인산화의 속도를 계산하는 데 사용될 수있다. 18, 19 </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리가 설명했다 니트로 셀룰로오스 결합 분석은 히스티딘 키나제의 특성을하기 이전에 사용 된 방법에 비해 많은 장점을 가지고있다. 전통적인 SDS / PAGE 계 오토 라디오와 비교하여, 우리의 방법은 높은 처리량과 더 짧은 시간이 소요된다. 니트로 셀룰로오스 막을 SDS 겔에 비해 취급이 용이하며, 고정 될 필요는 없다. 단백질 명소가 가시화 될 때까지 니트로 셀룰로오스를 염색 개양귀비 빛이 있습니다. 이 섬광 계수에 대한 각 자리를 잘라, 단백질 로딩이 모든 점에서 일관성이 있는지 결정하는 쉬운 방법을 제공합니다. 각각의 스폿의 섬광 계수에 용이도 3b에 도시 된 표준 곡선의 기울기를 이용하여 반응 속도로 변환 될 수있는 정확한 결과를 제공한다. 저장 형광면에 니트로 셀룰로오스 막을 노광하는 실험의 전체 지속 시간을 추가하지만,이 단계 블롯의 성공에 대한 통찰력을 제공한다. 어떤섬광 계수 데이터에서 발견되는 잠재적 불일치 상보 형광 이미지에 의해 설명 될 수있다. 예를 들면, 멤브레인을 충분히 세정하지 않은, 경우, 형광 화상이 정보를 공개한다. 막의 Fluorography이 단계의 결과는 추가 정보의 중요한 부분이 될 수 있기 때문에,이 분석을 사용하도록 계획 사람에게 추천된다. 이 분석의 또 다른 중요한 장점은 섬광 계수 데이터를 생성하는 기능이다. 섬광 계수에 대한 각각의 지점을 절단하는 것은 일반적으로 페이지 기반 분석법에 대해 수행 된 바와 같이, 밴드의 강도를 정량화하는 화상 처리 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다. 상한 및 검출을위한 동적 범위는 섬광 계수와 훨씬 더 높다. 표준 곡선을 생성하면 CPM / pmol의 ATP를가 쉽게 원시 데이터에서 인산화의 속도를 산출 할 수 있도록 결정한다. 이 방법을 사용하여, 정확하게 검출 할 수있다인산화 된 제품의 picomoles. 우리의 방법을 사용하는 많은 장점에도 불구하고, 그것은 한계가없는 것은 아니다. 우리의 방법은 1 phosphohistidine 및 3 phosphohistidine 구분하지 않습니다. phosphohistidine 항체 이러한 인산화 제품을 구별하는데 사용될 수 있으나, 우리의 방법은 아직 인산화를 정량 체렌 코프 효과를 이용하는 이점을 갖는다. Cherenkov 방사선은 넓은 동적 범위 및 검출의 높은 상한을 제공한다. 검출 방법에 따라, 더 작은 상한 동적 범위에서 겪을 수 phosphohistidine 형성을 정량화하는 항체를 사용. 우리의 방법은 정제 된 단백질과 함께 사용되는 것에 한정되어, 생체 내에서 인산화 키나아제를 검출하기 위해 사용될 수 없다. 우리의 방법은 방사능에 대한 장착되지 않은 실험실을 억제 할 수있다 방사성 표지 기판을 필요로한다. 궁극적으로,이 방법은 이미 처리되어 있습니다 실험실에 대한 대부분 적합방사능 및 높은 처리량에 관심이 적은 시간 대안을 소모 자주 히스티딘 키나제를 공부 SDS-PAGE 기술을 사용합니다. 빼앗아 /의 Thr / 티르 키나제를 공부하는 사람들은 이러한 단백질을 연구하기위한 다른 방법의 상대적 풍요 로움에도 불구하고,이 방법은 유용하게 찾을 수 있습니다. 법의 진보 키나제의 다른 유형의 정량화 불구 히스티딘 키나아제의 특성화 긴 애매왔다. 이 분석을 통해, 우리는 이러한 생물학적으로 관련 아직 제대로 이해 단백질의 특성을 시작할 수 있습니다. 궁극적으로이 성분은 박테리아에서 신호에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 히스티딘 키나제 인산화를 정량화하기위한 방법론이 발전. 이 분석은 여러가지 이성 신호 경로에서 히스티딘 키나아제 활성에 동족 자극 및 단백질 - 단백질 상호 작용의 효과를 탐구 유용한 도구가 될 것이다.

적응 반응은 박테리아의 생존을 위해 매우 중요하다. 검출 및 환경 변화에 대응하기 위해, 박테리아는 이성 신호라고도 자극 - 반응 시스템을 사용한다. 전형적인 2 성분계 1,2-는 히스티딘 키나아제는 동족 자극 검출의 보존 히스티딘 잔기 autophosphorylates 후 반응 조절 단백질의 수신기 영역에 보존 된 아스파 테이트 잔기에 인산을 전송한다. (3)이 이벤트는 하류 효과를 자극 반응 조절제의 활성의 변화를 트리거한다. 4,5- 따라서, 박테리아 감지 지역 환경의 변화에 적응할 수있다. 어떤 두 개의 구성 요소 경보 시스템이 원형에서 이탈. 어떤 경우에는, 히스티딘 키나아제의 감각 영역 직접 감각 입력을 검출하고 단백질 - 단백질 상호 작용을 통해 키나아제 활성을 수정 독립형 단백질이다. 6 - 그러나 8, 펀드amental 처리 시스템의 전체적인 역할은 동일하다. 이성 시그널링은 박테리아의 생존에 필수적이다 유비쿼터스 - 응답 시스템 및 히스티딘 키나제는 신호 전달에 중요한 역할을한다. 9 세균 생물학 히스티딘 키나제의 중요성에도 불구하고, 그들은 가난 특성화 남아있다. 이것은 phosphohistidine의 고유 한 불안정성과 인산화를 측정하는 실제적인 방법의 결여에 기인한다. Phosphohistidine는 포스 포세린, phosphothreonine 및 포스보다 더 불안정하다. 10 따라서, 일반적으로 빼앗아 /의 Thr / 티르 키나제를 분석하는 데 사용되는 기술은 히스티딘 키나제에 대한 적용되지 않습니다. 히스티딘 키나제을 연구하는 11 체외 분석은 크게 SDS-PAGE의 오토 라디오 그래피로 제한되어있다. 이 방법은 12, 13, [γ- 32 P] -ATP은 키나제와 함께 배양하고, 키나제 인산화 POL로 분석yacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)은 겔의 오토 라디오 그래피 하였다. 이 방법은 반응 조절기 키나아제의 인산화 키나아제뿐만 아니라 phosphotransfer을 모니터링하는데 사용될 수있다. 그러나,이 방법에 띄는 결점이있다. 페이지 기반 분석은 낮은 처리량 및 시간 소모적이다. 이러한 제한은 단백질의 특성과 운동 매개 변수를 확인하는에 도움이되지 않습니다. 최근 발표 된 히스티딘 키나아제를 연구하기위한 다른 방법은 인산화를 검출 phosphohistidine 항체를 이용한다. 이 방법은 1, 3 phosphohistidine phosphohistidine 구별하는 이점을 갖지만 (14)는 검출에 이용되는 장비에 따라서,이 방법은 넓은 동적 범위 또는 검출의 높은 상한을 제공하지 않을 수있다. 따라서, 이러한 중요한 단백질을 연구하는데 사용될 수있는 빠르고 덜 힘든, 더욱 민감한 분석이 필요하다. 여기, 우리가 설명하고 D시험관 내에서 정제 된 박테리아 히스티딘 키나아제의 인산화를 정량화하는데 사용될 수있는 니트로 셀룰로오스 신중 개발 결합 분석을 emonstrate. 이 분석은 높은 처리량과 PAGE 기반 분석법보다 시간이 덜 걸린다. 이 방법은 또한 검출 및 큰 동적 범위의 높은 상한을 구비 phosphohistidine 정량 용 체렌 코프 효과를 이용한다. 상기 분석은 히스티딘 키나아제에 대한 운동 매개 변수를 결정하기 위해 사용될 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAAA18067-AP</td>
			<td>For quenching reactions and washing nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-5000.0</td>
			<td>Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>RPI</td>
			<td>P41000-2500.0</td>
			<td>For kinase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M24000-500.0</td>
			<td>For kinase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>G22020-4000.0</td>
			<td>For kinase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-ATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6011</td>
			<td>Kinase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-5&#39;-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002Z250UC&#160;</td>
			<td>6000 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well dot blot apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td>For spotting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>32-10401396-PK</td>
			<td>For spotting reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P3504-50G</td>
			<td>For staining nitrocellulose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of bacterial histidine kinase autophosphorylation using a nitrocellulose binding assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

<html> 대표 데이터 집합 형광체 이미 저 (도 1) 니트로 셀룰로오스 막, 폰소 s 염색 (도 2), 및 섬광 계수 데이터 (도 3)로 촬영 한 화상을 갖춘 생성 하였다. 그림 3a는 위버 - 버크 플롯에서 효소 반응 속도 상수를 보여줍니다. 이러한 결과는 그램 음성 종 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스 (유전자 ID 1189383)로부터 정제 된 히스티딘 키나아제를 사용하여 수득 하였다. 키나제를 정화하는 데 사용되는 프로토콜은 섹션 1.1에 기재되어있다. 반응의 최종 키나아제 농도 7.5 μM이었다. 최종 ATP 농도는 0 μM부터 1.28 밀리미터였다. 에서 [γ- 32 P] -ATP 솔루션은 171.97 CPM / pmol의의 ATP했다. 이러한 데이터는 모든 우리 기재 한 절차에 따라 하루에 생성 될 수있다. /55129/55129fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 니트로 셀룰로오스 막 폰소 s 염색. 니트로 셀룰로오스 막에 결합 키나제를 보여주는 개양귀비 빛 얼룩. 멤브레인 ATP 다양한 농도하지만 일정한 키나제의 농도를 포함하는 반응을 발견 하였다. 어떤 단백질은 노 키나제 제어 관광 명소 (4 번째와 8 번째 행)에서 검출되지 않는다. 폰소 s 염색 액은 0.1 % 폰소 s 구성되었다 (W / v)의 5 % 아세트산이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55129/55129fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55129/55129fig2.jpg" /> 그림 2 : Fluorography 결과. 니트로 셀룰로오스 막에 노출되었던 형광면의 스캔 이미지. 멤브레인은 죄수를 포함하는 반응을 발견했다키나아제 일정한 농도 및 ATP 다양한 농도. 각각의 농도는 세중에서 분석 하였다. 각각의 농도에서 무 키나아제 제어는 (제 4 및 제 8 행) 방사성 표지 된 ATP는 완전히 세정 공정 중에 막으로부터 제거되는 것을 보여주기 위해 포함되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55129/55129fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55129/55129fig3.jpg" /> 그림 3 : 섬광 계수 데이터. 히스티딘 키나제의 인산화의 A)을 두 번 왕복 줄거리. 기판 의존성 곡선은 섬광 계수로부터 생성되었습니다. Phosphohistidine 형성은 또한 SC에 의해 생성 된도 3b (CPM / pmol의의 ATP)의 기울기를 이용하여 계산 하였다intillation 분석. B) ATP의 CPM / pmol의 표준 곡선. 기울기는 각 샘플에 존재 phosphohistidine (pmol의)의 양을 계산하는데 사용된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55129/55129fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

quantification-bacterial-histidine-kinase-autophosphorylation-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K 조회수.  Stony Brook University. We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

연구

생화학

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...