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앱타 머는 작업 증권 1. 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 100 μm의 최종 농도에 도달, 물 (참조 18에서 5-Cy5에-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, 순서) 올리고 뉴클레오티드를 녹인다. </li><li> 버퍼를 결합 200 nm의에 올리고 뉴클레오티드 주식을 희석하여 앱 타머 작업 솔루션을 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 7.6, 300 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 0.01 % 트윈 20). </li><li> 90 ℃에서 2 분 동안 혼합 배양 한 샘플을 즉시 얼음에 식혀 실온에서 시료를 사용한다. </li></ol> 리간드 희석 시리즈 2. 준비 <ol><li> ) SAM (각 리간드 (아데노신 트리 포스페이트 (ATP), 아데노신 디 포스페이트 (ADP), 아데노신 모노 포스페이트 (AMP), 아데닌, 구아노 신 트리 포스페이트 (GTP), 시토신 트리 포스페이트 (CTP), 아데노신 트리 포스페이트 (dATP 존재) 및 S-아데노 실 메티오닌 10 mM의 스톡 각)는 16 단계 직렬 diluti 준비에 200 ㎕를 마이크로 반응 튜브. 참고 : 집계를 제거하는 데 도움이 될 수 14,000 XG에서 5 분 리간드 주식의 원심 분리. 낮은 볼륨, 낮은 결합 반응 튜브는 튜브 벽 분자의 흡착을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 추정 친화력보다 적어도 50 배의 최대 농도로 시작하여 각 희석 단계에서 50 % 리간드 농도를 감소시킨다. 참고 : 제어 소프트웨어로 구현 농도 측정기 도구는 데이터 바인딩을 시뮬레이션하고 희석 시리즈에 적합한 농도 범위를 찾는 데 도움이됩니다. </li><li> 16 마이크로 반응 튜브에 2 앱 타머 바인딩 버퍼의 10 μl를 추가 튜브 1의 리간드 재고 (10 mM)을 20 μl를 입력합니다. </li><li> 이전 10 관 2 관 (1)의 μl의 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 적절하게 혼합한다. 다음 튜브에 10 μL를 전송하고 나머지 관이 희석을 반복합니다. </li><li> 마지막 튜브에서 10 μl를 초과 폐기하십시오. 어떤 B를 피하십시오uffer 희석 효과. 튜브 1 및 튜브 2-16의 버퍼가 동일해야합니다. </li></ol> 최종 반응 믹스 3. 준비 <ol><li> 피펫 팅의 오차를 최소화하도록 각각의 결합 20 μL의 부피와 반응 (앱 타머 작업 용액 + 각 리간드 희석액 10 ㎕를 10 μL)을 준비한다. 만 4 μL의 볼륨은 모세관 LL Fi에 SUF 과학 효율적인이다. </li><li> 각 리간드 희석의 10 μL에 200 nm의 앱 타머 작업 용액 10 μl를 추가로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 적절하게 혼합한다. </li><li> 샘플에 모세관을 담가 모세관 기준으로 샘플 LL 실온 인터넷에서 5 분간 샘플을 인큐베이션. 긴 배양 시간은 약간의 상호 작용에 대한 필요가있을 수있다; 그러나, 5 분은 대부분 적합합니다. NOT 광학 측정이 수행 될 중간 부분에 만 측에 모세 혈관을 터치합니다. </li><li> 일 상 모세 혈관을 배치전자 모세관 트레이와 MST 장치를 시작합니다. </li></ol> 4. MST 장치 시작 참고 :이 장치는 두 개의 사전 설치된 소프트웨어 패키지, 생성 된 데이터의 해석을위한 소프트웨어 &#39;&#39; &#39;&#39;분석 제어 실험 조건과의 기술적 설정을위한 소프트웨어 &#39;를 &quot;제공합니다. <ol><li> 산악 표준시 장치에 모세관 트레이를 배치하기 전에 제어 소프트웨어를 시작하고 &#39;드롭 다운 메뉴&#39; &#39;&#39;온도 조절에서 &quot;수동 온도 제어를 가능하게 &#39;선택하여 전체 원하는 온도를 조정합니다. 이 방법으로 25 ° C의 온도를 조정합니다. 참고 : MST 악기 온도 조절 45 ° C에 22에서 할 수있다. </li><li> 예상 수준에 도달하는 온도 기다린 다음 MST 장치에 모세관 트레이를 배치합니다. </li><li> Cy5에 염료은 &quot;빨간색 &#39;&#39;에 LED 채널을 설정하고 FL uorescenc 얻을 수있는 LED 전력을 조정표준 센서와 MST 장치 300 1,000 형광 단위의 전자 신호를 출력한다. 25 % LED 전원이 연구에 사용된다. 참고 : 6,000 18,000 형광 단위 고감도 센서와 MST 권장합니다. </li></ol> 5. 모세관 스캔 <ol><li> &quot;컨트롤&quot;소프트웨어에 대한 모세관의 위치를 ​​선택하고 클릭하여 샘플의 다른 품질의 측면을 확인하는 모세 혈관 검사를 수행합니다 &quot;캡 스캔을 시작&quot; 산악 표준시 측정을 시작하기 전에. </li><li> 형광 향상 / 담금질 및 소프트웨어의 고집 효과 (피크를 U 자형 또는 평평)의 모세관 스캔을 검사합니다. 참고 : 탐지 및 형광 처리 및 접착 효과에 대한 자세한 정보는 토론에서 찾을 수 있습니다. </li></ol> 6. MST 측정 참고 : MST 측정을 시작하기 전에 제외해야합니다 고집 효과, 강화 / 담금질 효과, 또는피펫 오류 및 모세관 스캔이 플라이 uorescence 신호가 SUF 과학 효율적인 있음을 나타냅니다 있는지 확인합니다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. <ol><li> . &#39;제어&#39;소프트웨어의 각 모세관 위치로 희석 시리즈 리간드 농도 할당 앱타 머는 리간드와 혼합 희석 단계 고려 (1 : 1). </li><li> 모세관 # 1에 대한 리간드의 높은 농도 (5 mm)를 입력 올바른 희석 유형을 선택합니다 (여기서, 1 : 1), 최대 농도를 클릭하고 자동으로 모세 혈관의 나머지 농도 # 2를 할당하는 드래그 기능을 사용 16. 가장 낮은 농도는 152.6 ㎚이다. </li><li> 제어 소프트웨어의 각 부분의 FL uorescent 앱 타머 (여기서, 100 ㎚)의 농도를 입력한다. </li><li> 5 초 동안의 FL uorescence 검출의 기본 설정을 사용하여 30 초 동안 MST를 기록하고, 상기 레이저 t의 비활성화 후 상기 5 초 동안 형광을 기록<html> O 분자의 확산을 다시 모니터링한다. </li><li> 제어 소프트웨어의 각 부분에 20 %의 레이저 파워를 조정한다. 주 : 위해 최상의 신호 대 잡음비를 수신하고 비특이적 효과를 방지하기 위해서는 20 내지 40 %의 레이저 파워가 권장된다. 특정한 경우에있어서, 고출력 레이저는 비 결합 및 결합 분자의 양호한 분리를 얻기 위하여 요구 될 수있다. </li><li> 대상 폴더를 선택한 후 실험을 저장하고 &#39;시작 MST 측정 &quot;버튼을 눌러 MST 측정을 시작합니다. 주 : .ntp 파일을 대상 폴더에 생성됩니다. 이 설정을 사용하여, 하나의 측정은 10 ~ 15 분 동안 지속됩니다. </li><li> EC의 값이 50보다 정확한 판정을 위해 적어도 두 실험 절차를 반복한다. 참고 기술의 재현성을 시험하기 위해서, 동일한 모세관 스캔 할 수 수회 (기술 반복). </li></ol> 7. MST 데이터 분석 NT &quot;&gt; 주 : 분석 소프트웨어는 측정 동안 플라이에서 데이터의 분석을 가능하게 분석 소프트웨어 리간드 농도 37 대 MST 시간 추적 및 정규화 플로리다 uorescence (F 놈)의 변화를 나타내는.. <ol><li> 산악 표준시 분석 소프트웨어 (MO.Affinity 분석)를 시작하고 대상 폴더에서 .ntp 파일을로드합니다. 데이터 선택 메뉴에서 분석 유형으로 &quot;MST&quot;를 선택합니다. 주 : 리간드 의존적 형광 효과의 경우, 초기 형광 분석을 위해 선택 될 수있다. </li><li> 드래그 앤 드롭하거나 각각의 실험 실행 아래의 &quot;+&quot;버튼을 눌러 새로운 분석 각각의 기술 또는 생물학적 실행 (들)을 추가합니다. </li><li> 실험, MST 추적, 모세 혈관 검사, 모세관 모양, 초기 형광, 표백 속도의 특성에 대한 정보를 얻기 위해 각각의 실험 실행 아래 정보 버튼을 누릅니다. 참고 :이 원시 데이터 수 등그래서 분석 이후 단계에서 검사 될 수있다. </li><li> 시각적으로 볼 범프와 스파이크로 응집 및 침전 효과에 대한 MST 추적을 검사합니다. 참고 : 검색 및 통합 효과의 처리에 대한 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li><li> 시각적으로 평평하게 또는 U 자 모양의 봉우리로 보이는 모세 혈관 검사 및 흡착 효과 모세관 모양 오버레이를 검사합니다. 시각적으로 모세관 검사 및 형광 효과에 대한 초기 형광을 검사합니다. 시각적 효과를 photobleaching에 대한 표백 속도를 검사합니다. </li><li> 용량 반응 모드로 전환하고, 각각의 버튼을 누름에 의해 &quot;전문가&quot;모드 분석 설정을 변경. 산악 표준시 평가 전략으로 &quot;T-점프&quot;를 선택합니다. </li><li> 곡선 Fi를 tting에 대해 &quot;힐&quot;모델을 선택합니다. 바인딩 매개 변수가 자동으로 계산됩니다. 은 &quot;결과를 비교&quot;메뉴 정규화의 각 유형을 선택하여 데이터를 정규화한다. 내보내.XLS 또는 .PDF 등 중 데이터. 참고 : 바인딩 그래프 아래의 표는 계산 된 바인딩 매개 변수를 요약 한 것입니다. </li></ol>

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품질 관리 : 비특이적 부착 / 표면에 시료 물질뿐만 아니라, 응집 효과를 흡착, 선호도 데이터의 품질에 큰 영향을 미친다. 그러나, 몇 최첨단 기술을 모니터링하고 이러한 효과를 방지하기 정확하고 빠른 옵션을 제공합니다. MST 감지하고 기술적 인 설치의 단계적 최적화를 허용, 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 통합 된 품질 관리를 제공합니다. 응집 / 침전 효과 (단계 7.7)의 이동 프로파일 모니터링 할 수있는 반면 점착 형광 효과에 대한 중요한 정보는 모세관 스캔 모세관 형 (5.2 내지 7.5 단계)에서 추출 될 수있다. 이러한 컨트롤은 데이터 품질의 지속적인 개선을 가능하게하고 프로토콜의 중요한 단계를 나타냅니다. 흡착 효과와 문제 해결의 검출 : 모세관 스캔은 주로 INI로 실시은 최초 단계는 위에 형광을 스캔하여 트레이 홀더에 모세 혈관의 위치를 ​​확인합니다. 각 피크는 MST 측정을위한 시작점을 나타내는 하나의 모세관을 나타낸다. 피크 형상의 육안 검사는 MST 실험을 시작하기 전에 수행되어야 필수적인 품질 관리되는 유리 표면에 분자의 흡착의 측정을 가능하게한다. 모세관 형 오버레이는 모세관 (도 3a, 상부 패널)의 내측 유리 표면에 분자의 흡착 / 접착을 나타내는, 심지어는 U 형태를 닮은 피크 평탄화 울퉁불퉁 피크 모양 쉽게 검출 가능하다. 다르게 모세관에 분자의 용해성 최소 흡착을 위해 모세관 타입 (표준, 프리미엄 및 소수성)의 도움을 코팅. 모세 혈관 전에 바인딩 실험에 적합성 시험을해야한다. 이러한 트윈 (0.005-0.1 %) 또는 플루로 닉 F127 (0.01-0.1 %) 엄마와 같은 세제Y는 비특이적 흡착의 영향을 방지한다. 실험이 단계에서 최적화는 높은 데이터 품질 (낮은 패널도 3a를 비교)에 필수적이다. 형광 효과 및 문제 해결의 검출 : 스캔 된 모세 혈관의 피크 높이의 변화는 샘플 특성에 대한 정보를 다른 레이어를 제공합니다. 모세관 형광 임의의 차이는, 한편으로, 다른 한편으로는, 에러를 피펫 팅하거나 때문일 대폭 형광이 증가 주사 영역에서 큰 샘플 집합체로부터 유래 할 수있다. 피펫 높은 정밀도 희석 효과를 방지하기 위해 필수적이다. 아래로 pipetting 모든 솔루션을 혼합하면 더 정확성을 증가시킨다. 또한, 각 모세관 일관 버퍼를 유지하기 위해 필수적이다. 응집 효과를 처리 할 수있는 전략은 이후 절에 제시되어있다. increa와 형광의 전신 변경리간드 농도 노래를 자주 리간드 의존 담금질 / 개선 효과를 나타냅니다. 은 &quot;SD 시험&quot;비특이적 형광 손실 결합 유발 형광 변화를 구별하기 위해 수행된다; 이 테스트는 변성 조건에서 형광 강도를 모니터링합니다. 리간드 - 의존성 형광 효과의 경우, 변성 조건하에 형광 강도를, 적정의 농도와 무관 동일해야한다. 형광 강도의 차이는 여전히 이러한 조건 하에서 존재하는 경우, 재료는 하나 인한 관 벽에 비특이적 흡착 또는 응집으로 인해 이후 원심 잃었다. 는 SD 테스트를 수행하기 위해, 제 10 μL 마지막 리간드 희석 단계의 10 μL를 각각주의 깊게 배 SD 믹스 (4 % SDS, 40 mM의 DTT) 10 ㎕를 함유하는 새로운 튜브로 이송된다. 샘플을 혼합하고, 분자가 95 ° C에서 5 분 동안 변성된다. Afte모세관에 시료를 채우고, R, 형광 강도를 측정한다. 리간드 - 의존성 형광 효과가 검출되면, 데이터는 형광 강도의 변화로부터 추론 바인딩 정보로 직접 분석 할 수있다. 응집 효과 및 문제 해결의 검출 : 울퉁불퉁 고르지 MST 시간의 흔적이 응집 및 / 또는 침전 효과 (그림 3B, 상단 패널)을 나타냅니다. 비 집계 샘플 재료는 깨끗하고 부드러운 thermophoretic 이동 프로파일 (그림 3B, 낮은 패널)이 표시됩니다. 샘플 물질의 원심 분리에 앞서은 세제를 첨가 (0.005 % 트윈 -20, 0.01 ~ 0.1 % 플루로 닉 F-127, 또는 이와 유사한 것), BSA의 사용 ((5-10 분 XG 14,000)을 사용 &gt; 0.5 ㎎ / ㎖), 또는 버퍼 조건 (pH 및 이온 강도)의 변화를 응집 효과를 최소화하기 위해 데이터의 품질을 최적화 할 것을 권장한다. 고품질의 데이터를 얻기 위해서는,응집 효과를 최소화하는 것이 필수적이다. 데이터 분석 및 곡선 피팅 thermophoretic 운동 프로파일은 개별적으로 또는 병용하거나 검사 할 수있는 여러 단계로 나누어진다. T-점프 형광체의 고유 한 특성을 나타내는 온도 변화에 따라 형광 수율의 급격한 변화에 대해 설명합니다. 높은 바인딩시 형광 또는 형태 변화의 가까운 주변에 바인딩을 직접는 T-이동에 영향을 미칩니다. 느린 열 영동이 형성된 복합체의 전체 구조에 대한 정보를 제공하는 온도 필드에 분자의 이동을 말한다. 데이터 분석의 기본 형태는 결합 파라미터를 결정하기 위해 두 현상을 이용은 &quot;열 영동 + T 점프&quot;설정을 사용한다. 두 단계가 반대 방향이 경우, 별도로 단계를 분석하는 것이 좋습니다. 그 시간 효과와 molec의 다른 종을 유의하시기 바랍니다ules는 열 영동과 T-점프의 선호도의 차이가 발생할 수 있습니다. 분석 옵션의 다른 유형의 운동 프로파일의 특정 영역의 조사를 가능하게하는 수동 설정된다. 응집 또는 대류에 의한 교란이 방법으로 배제 될 수있다. 데이터 품질을 개선하기 위해, 커서는 응집 신호 전에 설정 될 수있다. 대류는 시간 의존적 과정이므로 초기 열 영동 검사하면 일반적으로 노이즈가 적은 데이터를 생성한다. 이 초기 수동 설정이 매우 높은 레이저 출력 (80 %)와 실험을 권장합니다. 데이터 분석 설정을 선택하면, 분석 소프트웨어에 내장 개의 피팅 모델은 결합 곡선에 맞게 적용 할 수있다. 1 바인딩 모드 또는 같은 친화력을 가진 여러 개의 결합 부위에 대한 질량 작용의 법칙에서 K d를위한 맞춤 기능은 1 적합하다. 농도 독립적 해리 상수 K D는 보우 간의 평형 설명차와 결합되지 않은 상태; 따라서, 리간드에 대한 결합 부위의 친화도를 측정한다. 힐 방정식에서 유도 된 농도 의존적 EC 50 값은 결합 된 상태의 표지 분자의 어느 절반 리간드의 효과적인 투여 량을 나타낸다. 힐 맞는 그들이 협력, 특히 경우, 결합 모델을 다가 적용해야합니다. 통합 품질 관리는 SPR 또는 ITC 같은 기술을 통해 MST 중 하나 큰 장점을 나타냅니다. 이러한 컨트롤은 최적의 데이터 품질을 보장하는 기술 설정의 빠르고 쉽게 최적화 할 수 있습니다. 시간 효율 측정 (15 분에서 K d 개) 및 고정화없는 설정뿐만 아니라, MST도 해물과 혈청 5,42,43에서 분자 상호 작용의 평가를 허용, 버퍼의 자유로운 선택을 제공합니다. 열 영동 분자량이 크기 전하 분자 수화 쉘에 의존한다는 사실 때문에, 아무런 제한은 없다MST 측정시 측정 된 상호 작용 파트너의 크기이다. 함께 낮은 샘플 소비 오후 mM의 동적 AF 과학 NITY 범위는, 상기 MST 기술의 강점을 완료합니다. 그것은 MST는 결합 친화, 화학량 론, 열역학 등의 기본 바인딩 매개 변수에 대한 정확한 데이터를 생성하는 언급 할 가치가있다. 그러나 MST는에 (k)의 측정이 가능하고 요금을 케이하지 않습니다. 또한, 하나의 MST는 대부분의 실험에서, 형광 변형 작용 파트너 중 하나에 추가되어야 것을 고려한다. 생성 된 데이터는 SPR 및 ITC 32,43-46 등의 최첨단 기술과 잘 일치한다. 그러나, 이들 데이터는 실험 빠르기, 그들은 적은 재료 소모, 품질 제어된다. 전반적으로, MST는 몇 가지 추가적인 장점과 최첨단 기술로 강력한 기술 직교를 나타냅니다.

분자 사이의 상호 작용은 자연의 기초가된다. 따라서, 기본 및 응용 연구의 많은 분야에서 과학자들은 서로 다른 종류의 분자 상호 작용의 기본 원리를 이해하려고합니다. 마이크로 열 영동 (MST)는 버퍼의 자유로운 선택으로, 용액에서 분자 상호 작용의 빠르고 정확한 비용 효율성 및 품질 제어 특성을 수행하는 과학자들 수 있습니다. 여러 결합 파트너 1-8으로 이벤트 유효성 검사, 경쟁 분석, 실험을 결합, 도서관 검사를 포함한 분석의 다른 종류를, 기술, 혼자 2016에서 MST를 사용하여 1,000 개 이상의 출판물이 이미 있습니다. 일반적으로, MST는 분자 상호 작용의 어떤 종류의 결합 친화 (mM의 PM), 화학 양론, 열역학, 같은 고전적인 바인딩 매개 변수에 대한 연구를 허용합니다. MST의 큰 장점은 상호 작용 파트너의 크기의 독립적 인 바인딩 이벤트를 공부할 수있는 기능입니다. 심지어 chal같은 작은 분자, 약물, 항생제, 또는 대사 산물로 같은의 작은 핵산 앱 타머 사이의 상호 작용 (NT를 15 ~ 30) 및 목표 정량화 할 수있다. 현재 최첨단 기술은 압 타머 - 대상의 상호 작용이 실험실 강렬하고 매우 복잡한 중 하나입니다 특성화 또는 앱 타머 - 작은 분자가 9,10의 상호 작용을 정량화하는 데 실패합니다. 플라즈몬 공명 (SPR)를 분석 (11, 12) 및 등온 적정 열량계 (ITC) 13 ~ 15, 등용 매 용리 16 평형 Fi를 여과에 17, 18으로 진정으로 라벨없는 열량 접근 방식을 기반 표면에 라인 19, 겔을 프로빙 분석을 이동, stopped- FL 흐름 FL uorescence 분광법 (20, 21), 형광 이방성 (FA) 22, 23, 단일 분자 FL uorescence 영상 24, 25, 및 바이오 층 간섭 (BLI) (26)는 압 타머 - 작은 분자와 부정확 또는 호환되지 않는 중 하나입니다 상호 작용. 기타 principa이러한 방법의 리터 문제는 낮은 민감도, 높은 샘플 소비, 고정, 표면에 대량 전송 제한 및 / 또는 버퍼 제한됩니다. 이러한 기술의 몇 응집 흡착 효과에 대한 통합 제어를 제공합니다. MST 과학자 단백질 30-33로서 앱 타머 및 소분자 27-29 사이의 상호 작용뿐만 아니라 다른 대상을 연구하는 이러한 한계를 극복하기위한 강력한 도구를 나타낸다. 이 기술은 온도 구배를 통해 분자의 움직임에 의존한다. 라고하는이 감독 운동 &quot;열 영동는&quot;분자 (34, 35)의 크기, 비용 및 수화 쉘에 따라 달라집니다. 분자에 대한 리간드의 결합을 직접 변경 thermophoretic 이동성 결과 이들 파라미터 중 적어도 하나를 변경한다. 작은 크기와 리간드가 결합 된 상태로 결합되지 않은에서 크기 변화의 측면에서 상당한 영향을 미칠하지 않을 수 있습니다,하지만 그들은 닥터를 가질 수 있습니다<html> 수화 쉘 및 / 또는 충전 amatic 효과. 결합 파트너와의 상호 작용 후 분자의 thermophoretic 운동의 변화는 기본 바인딩 매개 변수 2,7,34,36,37의 정량화 할 수 있습니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, MST 장치는 형광 검출과 같은 광학 장치를 이용하여 유리 모세관 내 샘플 상에 초점 적외선 레이저로 구성된다. 레이저 온도 구배 (2-6 ℃의 ΔT)을 설정하면서 tryptophans 6 또는 형광 표지의 상호 작용 파트너의 3,8의 고유의 FL uorescence 통한 단백질의 thermophoretic 움직임 모니터링 할 수있다. 공간 ΔT에서 생성 된 온도 차이는 Soret 의해 정량화 될 수있다 고온의 영역에서 공핍 또는 분자의 축적에 이르게 COEF 효율적인 인터넷 (S T) g &quot;/&gt; C 고온 가열 영역의 농도를 나타내고, C 감기 초기 저온 영역에서의 농도이다. 도 1b는 각자의 시간 척도에 의해 분리 될 수있는 여러 단계들로 구성된 MST 운동 프로파일 (시간 추적)에서 전형적인 MST 실험 결과에 도시 된 바와 같이. 초기 형광 정확한 시작 형광을 정의하고 또는 photoenhancement photobleaching에 대해 확인하기 위해 온도 구배의 부재에서 제 5 초 단위로 측정된다. 온도 점프 (T-점프)하는 형광 변화 thermophoretic 운동 전에 위상을 나타냅니다. 형광이 초기 감소는 양자 수율 uorophore 플로리다의 열 의존적 변화에 따라 달라집니다. 열 영동 상 인해 정상 분포까지 분자의 운동 thermophoretic 형광이 감소 (또는 증가)에 도달 한 다음.레이저가 꺼진 후 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 역 TJump와 플로리다 uorescent 분자의 수반 다시 확산 관찰 할 수있다. 기본적인 결합 매개 변수를 액세스하기 위해, 상호 작용 파트너의 상이한 몰비를 분석 및 비교된다. 광학 표시 분자가 일정하게 유지되고, 표지 된 리간드의 양의 증가와 함께 공급되는 반면, 일반적으로 16 개의 다른 비율 번 MST 실험에서 연구되었다. 두 결합 파트너 간의 상호 작용은 열 영동의 변화를 유도하고, 따라서 표준화의 FL uorescence에서는, 다음과 같이 계산된다 F 규범 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F 뜨거운 F 감기는 MST 추적의 드 Fi를 NED 시점에서 플라이 uorescence 강도 평균 나타냅니다. 결합 친화도 (K d 또는 EC 50 값) CURV 의해 계산 될 수있다E 피팅 (도 1C). 전반적으로, MST는 어떤 종류의 분자 상호 작용을 연구하는 강력한 도구입니다. 그리고 25-NT의 짧은 ssDNA를 앱 타머 DH25.42 (7.9 kDa의)이 원고는 작은 분자 아데노신 트리 포스페이트 (0.5 kDa의 ATP) 사이의 도전적인 상호 작용을 특성화하기위한 프로토콜을 제공합니다. 원고의 과정 동안, ATP 분자의 앱 타머의 결합 부위는 ATP의 아데닌 그룹에 아래로 매핑됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Aptamer binding buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescently labeled ATP aptamer</td>
			<td>IDT, Leuven, Belgium</td>
			<td ></td>
			<td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-ATTGCGGAGGAAGG-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2383</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ADP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2252</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A8626</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SAM</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A7007</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >11934511001</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>C1506</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >G8877</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115&#160;</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-G008</td>
			<td>Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115 capillaries Standard</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-K002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf PCR tubes</td>
			<td >Eppendorf, Germany</td>
			<td >30124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MO.affinity analysis v2.1.1</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaleidagraph 4.5.2</td>
			<td >Synergy Software</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

본 연구에서는, MST는 ATP의 DH25.42 DNA 앱 타머 (18)의 결합 부위의 특성을 적용 하였다. ATP 또는 임의로 하나 이상의 형광 38-40 표지 단백질과 소형 분자 ATP를 흉내 낸의 상호 작용의 특성을 다른 연구와 대조적으로, 본 연구에서는 5 &#39;말단에 한 Cy5의 분자와 7.9 kDa의 ssDNA를 앱 타머에 표지 된 버전을 포함 . 다른 ATP 유도체 및 관련 분자는 다양한 위치에서 ATP 상이한 모두는 ATP 분자의 결합 부위를 매핑하는데 사용되었다. 다른 리간드 (각각 50 %로 리간드 농도를 감소시키는 단계 (16)에서) 일련의 희석을 준비하고, Cy5에 표지 된 압 타머의 일정량과 혼합 하였다. 샘플은 25 LED %, 20 %의 레이저 전력 표준 모세관 분석 하였다. 이동 프로파일 (MST 시간의 흔적)을 기록하고, T-점프 단계에서 파생 된 형광 단위, 리간드 CONCENTR 대 꾸몄다했다ATION (도 1C)와 비교. 커브 피팅은 EC (50) 값의 결과 힐 방정식을 적용 하였다. 5 독립적 인 생물 반복 (4 가지 연산자, 2 개의 다른 앱 타머 주식, 2 개의 다른 ATP 주식)에서 ATP-앱 타머 상호 작용은 6 ~ 13 단위의 음의 결합 진폭 및 52.3 ± 5.0 μM의 평균 EC (50) 값 (그림 2A를 보여줍니다 ). 오류 바인딩 그래프 바, 선호도 데이터에 제시된 &quot;±는&quot;5 생물학적 반복 (다른 모세관 5 독립적 인 측정)의 표준 편차를 나타냅니다. [2,8,5&#39;- 3 H] -adenosine 및 ATP 아가로 오스와 DH25.42 앱 타머의 상호 작용을위한 이전에보고 친화도는 비슷 하였다. 앱 타머와 방사성 표지 아데노신의 상호 작용은 원심 필터 분석에 의해 정량화하고, 6 ± 3 μM의 친 화성 (K D를) 결정 하였다. ATP IMMOBIL에 등용 매 용출 실험13 μM 18,41의 친 화성 (K d 개) 결과 아가로 오스 할화된. 더 비교표를 들어, 데이터는 다음의 방정식을 사용하여 (FB 결합 분획) 복합체 분자의 비율로 정규화 될 수있다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq3.jpg" /> 값 (c)의 농도 C는 측정 된 MST 값이고, 무료 결합되지 않은 상태 (낮은 농도)에 대한 MST의 값이고, 복합체는 완전히 결합 된 상태 (도 2B)에 대한 MST의 값이다. 도 2c에 도시 된 바와 같이,이 정규화 한 그래프 다른 리간드의 결과를 비교하는 것이 이상적이다. 뉴에서 ATP 다를 검출 AF 과학 ADP (생물학적 중복에서 63.6 ± 5.9 μM), AMP의 대하여 이야기 (생물학적 중복에서 91.6 ± 9.1 μM) 및 SAM (생물학적 중복에서 44.4 ± 3.2 μM)인산염 그룹의 mber,이 위치가 더 또는 앱 타머 (그림 2C와 D)의 결합 행동에 플로리다 영향력에 사소한을 가지고 있다는 것을 의미합니다. dATP를도 약간 감소 AF 과학 NITY (생물학적 중복에서 64.4 ± 6.1 μM)와 앱 타머에 구속되면서 ATP의 리보스의 C2 탄소에서 OH 그룹은 주요 결합 부위 인에서 제외 될 수있다. CTP는 상호 작용이 그룹의 중요성을 입증 상기 앱 타머의 구속력 결과 피리 미딘 그룹 ATP의 퓨린 그룹 변경. 결합 부위가 ATP 분자의이 부분에 있어야한다는 표시 (생물학적 중복)에서 141.7 ± 9.4 μM의 친화력과 아데닌에 결합 앱 타머. 퓨린 GTP 분자 및 ATP는 ATP의 앱 타머의 주요 결합 부위를 나타내는도 2D에 나타낸 녹색 음영 영역에서 다르다. 또 다른 연구는 서로 다른 ATP 유도체와 비 정량적 용출 실험을 사용이 MST 연구 (18)에 유사한 결과를 보였다 ATP 아가로 오스,에서 방사성 표지 앱 타머를 용출. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55070/55070fig1.jpg" /> 그림 1 : 마이크로 열 영동. (A)가 MST 기술의 기술적 설정이 도시된다. 광학함으로써 광학 표시 분자의 형광 신호를 검출하는 유리 모세관의 중심부에 집중한다. 적외선 레이저 광학계의 관찰 창에 온도 구배를 설정하는 데 이용된다. 형광의 변화는 온도 구배 용액 (B) MST 시간 트레이스 이동 프로 파이 르 분자의 분자 thermophoretic 움직임을 감시하기 위해 이용 될 수있다. 레이저가 꺼져있는 동안 초기 형광은 5 초 동안 측정한다. 레이저에 대한 전환 온도 구배를 생성한다. 바로 T-점프 P 후FL uorescent 염료 열 유도시의 신호 수율을 감소하는 하세가의 thermophoretic 운동이 발생하고 30 초 동안 관찰된다. 레이저가 턴 오프 된 후, 다시 확산 분자. 전형적인 실험의 MST (C) 결과 (좌) 형광 분자의 동일 농도 및 표지 된 리간드의 증가하는 농도를 함유하는 16 모세관; 산악 표준시 시간의 흔적을 기록하고 초기 형광으로 정규화된다. (오른쪽) 정규화 플라이 uorescence; F 및 F 감기 뜨거운 차이는 리간드의 농도에 대해 플롯된다. 이러한 결합 AF 과학 NITY과 같은 매개 변수를 바인딩이 데이터 수익률의 곡선에 맞게. 엘스 비어, 방법 (28)의 허가를 재 인쇄; 라이센스 번호 3890230800113. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55070/55070fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </글꼴&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55070/55070fig2.jpg" /> 그림 2 : MST 데이터 분석. (A)베이스 라인이 MST TJump 신호에서 파생 된 ΔF 규범 (‰), uorescence 정규화 FL 수정 (μM 단위) ATP 농도에 그려집니다. 힐 방정식 (EC 50) 곡선 피팅에 적용 하였다. 오차 막대는 다섯 생물학적 반복의 표준 편차를 나타낸다. (B) 각 데이터 세트의 결합 비율로 정규화 하였다 A.에 도시 된 데이터의 분획 결합 플롯, 이러한 정규화 된 데이터의 평균 결합 그래프로 제시된다. 오차 막대는 5 생물학적 반복의 표준 편차를 나타낸다. (C) 분율 바인딩 그래프는 앱 타머에 다른 리간드의 양적 비교 (힐 적합)를 보여줍니다. 오차 막대는 표준 devia를 나타내는이 생물 반복 기. 앱타 머는 서로 다른 리간드 (D) 바인딩 AF 과학 대하여 이야기 (EC 50). 녹색 음영 지역은 ATP의 아데닌 그룹에 앱 타머의 결합 부위를 나타냅니다. 이 수치는 엘스 비어, 방법 (28)에서 수정; 이전 연구에서 라이센스 번호 3890230800113. 데이터 세트를 재분석하고 본 연구에서 확장됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55070/55070fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55070/55070fig3.jpg" /> 그림 3 : MST 실험에 대한 분석 최적화. (A) 단백질 흡착 및 접착 효과가 모세관 스캔으로 검출 할 수있다. 이러한 평탄화 또는 U 자형 불규칙 피크의 피크 형상은, 유리 표면에 시료 물질의 접착을 나타낸다. 기음모세관 형 (표준, 프리미엄 또는 소수성)을 매달려 일정한 피크 형상 생성 분자의 흡착을 방지 할 수있다. 집합체 범프 스파이크로도 검출 할 수 있기 때문에 (B)가 MST 시간 추적은 또한, 품질 관리의 역할을한다. 실험 조건 (예를 들면 플루로 닉 F-127 또는 다양한 pH 값 또는 염 농도 세제 포함 예) 분자의 용해도를 개선함으로써 최적화 될 수있다. 원심 분리는 큰 집계를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최적의 데이터 품질을 보장하기 위해, MST 시간 트레이스 주어진 예와 유사해야한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55070/55070fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K 조회수.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

연구

생화학

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...