저자는 IBIS MX96에 대한 기술 지원을 노아 디토 아담 마일 감사합니다.

<ol>
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이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 베링거 인 겔 하임 제약 지불했다.

우리의 일대일 비교 연구는 각 바이오 센서 플랫폼은 자신의 강점과 약점을 가지고 있음을 보여준다. 항체의 결합 프로파일 (도 3 - 6) 시각 비교 유사하다하더라도, 취득 된 운동 속도 상수의 순위가 악기에 걸쳐 고도의 일치 (도 7), 우리의 결과와 악기 SPR 기반 보여 연속 흐름 유체는) 느린 해리 속도와 높은 친화력 상호 작용을 해결에서 더 낫다. 해리 단계에서 상향 드리프트는 데이터 세트에서 관찰된다 (예, 항체 2, 5 항체, 단클론 항체 및 9;도 5)의 유체 BLI없는 악기에 의해 발생. 이러한 결과는 시스템의 기본 제한되는 마이크로 플레이트, 경시 시료 증발에 상당 부분 기인 할 수있다. 이 고유 한 한계로, 실험 시간은 12 시간 이하로 제한되고; 실험 따라서 쉬로 프로그램 된배의 orter 다른 플랫폼들 (10 분 및 45 분 연관 해리)에 비해 (500 S 협회 30 분간 해리). BLI 기반기구에 의해 생성 된 속도 상수가 오프 비율의 일부 변동의 결과 (도 8의 (c)으로서 이하의 선형성을 표시하지만, 실험 시간을 단축하여 데이터 품질 / 일관성 증발의 영향을 완화하기 위해 나타나지 않았다 ). 시료 증발에 더하여, 사용되는 캡쳐 시약의 차이는 또한 얻어지는 결과의 차이에 기여 할 수있다. 단백질 A / G가 세 유체 기반 SPR 플랫폼에 사용되는 동안, AHC 센서는 비 유체의 BLI 플랫폼에서 사용되었다. 단백질 A / G가 AHC 항체 기반의 바이오 센서의 표면, 단백질 A / G 표면에서 항체 - 항원 복합체의 오프 속도 인위적보다 빨리 나타나는 않는보다 mAb에 대한 강한 친 화성을 가질 가능성이 있기 때문에 AHC 표면으로부터 얻어진. 이러한 가능성은 b를 지원설명 y BLI 플랫폼에 의해 발생 된 오프 속도 값은 다른 장치 (도 7의 적색 선)에 의한 것보다 더 지속적으로 낮았다 것을 보여주는 실험 데이터. 그럼에도 불구하고, BLI 플랫폼은 다른 플랫폼에 걸쳐 서로 다른 장점이 있습니다. 예를 들면, 즉시 사용으로 인해 다양한 사전 - 코팅 센서 센서 선택 및 분석에 관한 구성이 매우 유연하다. 우리의 실험에서 AHC 센서의 사용은 준비 시간을 줄이고, 리간드의 고정화 단계의 필요성을 제거. 또한, BLI 플랫폼은 복잡한 튜브 및 가치 스위치 구성을 특징으로 다른 유체의 SPR 플랫폼에 비해 훨씬 적은 유지 보수를 필요로한다. 이 기능은 막힘 오염 문제가 발생할 수 있습니다 원유 샘플을 포함하는 실험 장점이다. 치료 후보 증가, 효율적으로 신속하고 정확한 식별에 대한 수요, BI에 대한 요구로osensor 처리량도 증가하고있다. 네 개의 바이오 센서 플랫폼 중에서 96 리간드 어레이 인쇄 할 수있는 바이오 센서의 처리량 궁극적 증가 십자 36 리간드 포맷 및 16 채널 동시 판독과 BLI 기반 바이오 센서에 결합 된 바이오 센서, 다음으로 높은은 각각 96, 36, 16, 단일 결합 사이클에서 측정 된 상호 작용의 수. 이 처리량 기능은 하나의 일련의 흐름에 의해 연결된 네 개의 흐름 세포를 가지고에 의해 제한되는 기존의 SPR 플랫폼보다 훨씬 더 높다. 우리의 실험은 긴 해리 시간으로 다수의 표면 밀도에서 평가 10 단클론 항체의 비교적 작은 샘플 세트를 포함하기 때문에, 악기 처리량은 실험의 효율성을 결정하는 중간 역할을했다. 이 세 개의 높은 처리량 플랫폼의 실험 시간에 유의 한 차이는 없었다, 그리고 모든 경우에 실험은 하루에 완료되었습니다. 한편, 기존의 직렬 흐름 SPR 실험은 설치 후 데이터 수집의 도보 거리에 자동화에도 불구하고, 완료 삼일이 필요합니다. 오프 속도 순위 / 운동 검사 또는 에피토프 비닝 (binning)을 위해, (수백 또는 수천의 예) 샘플의 큰 숫자를 포함하는 다른 연구에서, 처리량은 중요한 요소가된다. IBIS MX96의 처리량이 다른 바이오 센서보다 수십 배 더 높다 따라서 이러한 목적을위한 최적의 선택이지만, 몇 가지 단점을 가지고있다. 특히, CFM하여 배열 인쇄 큰 표면 불일치 (도 1) 및 감소 된 데이터 재현성 (도 8D 및 8E)을 나타낸다. 정확한 동역학 측정을 위해 바이오 센서의 표면 리간드의 양은 결합 반응은 같은 보조 요소들에 의해 방해되지 않도록 제어 할 필요가 중요한 파라미터이다물질 전달 또는 입체 장애. 바이아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 들어, 최적의 R L 레벨이 연구 제 17에서 설명한 바와 같이 설정된 R의 최대 값의 표준 계산에 기초하여 결정 하였다. 한편, 옥텟 RED384 및 IBIS MX96 플랫폼, 단클론 항체 캡쳐 레벨은 경험적 상수 배에서 2 배 희석 한 항체의 시리즈를 사용하여 달성 하였다. 기술 또는 캡처 단계의 제어의 부족은 고밀도 표면 운동 속도 상수의 정밀도를 손상 수도 높은 결합 응답 신호 (도 2)였다. 재생성 관련된 여러 바인딩 사이클 측정을 수행 할 때 또한, SPR 검출기로부터 프린터의 분리도 문제를 제시한다. 멀티 사이클 동역학 설정을 수행 할 수있는 유일한 방법은, 고정 된 단백질 A / G에서 단클론 항체를 통해 캡처 된 Fc 반대로 모노클 직접 아민 커플 링으로했다다른 세 개의 바이오 센서 플랫폼의 표면. 결과적으로, 추가로 재생 정찰 실험 최적의 재생 조건을 결정하기 위해 필요했다. 이 설정의 결과는 더 이상 실험 시간 이외에의 Fc 캡처 방법 (그림 9)에 비해 ~ 90 % 낮은 관찰 된 표면 활동과 연결되었다. 은 FC 캡처 방법을 실행하려면, 다른 하나의주기 운동 방식이 채택되었다. 이러한 접근법은 각각의 분사 (도 2) 사이에 재생하지 않고, 증가하는 농도의 분석 물질의 연속 주입을 포함한다. 이것은 매우 편리하지만, 일반적으로 덜 적용 방법뿐만 실험 시간 단축 및 시약의 소비를 줄일뿐만 아니라 다른 바이오 센서 (도 7)의 것과 매우 유사한 운동 속도 상수를 생성. 따라서,이 단일 사이클 반응 속도 접근 방식을 적용하면 악기의 고유 한 구성의 한계를 극복하고 선물높은 처리량 방식으로 고해상도의 운동 속도 상수를 얻기위한 기회를 제공합니다. 처리량이 비아 코어 T100의 주요 제한에도 불구하고, 우리의 결과는 총체적으로는 최고의 품질과 가장 일치하는 데이터를 생성 한 것으로 나타났다. 이것은 ~ 10 배 높은 처리량을 가지고 ProteOn XPR36,으로 이어졌습니다. 악기 &#39;검출 한계에 도달하면 기술적으로 어려울 수 고친 화성 항체 - 항원 상호 작용을 특성화 할 때 고품질의 데이터를 생성하는 능력이있는 장점이된다. 옥 테트 RED384의 장비의 체계적인 제한 해리 속도 상수의 정확한 측정을 방해하는 동안 (즉, 감도의 짧은 떨어지는 속도가 느린 오프 요금에 대한 충분한 신호 부패를 해결하기 위해), 모두 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36는 민감하고 안정적인 제공 할 수 있습니다 차별화를위한 탐지.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

라벨이없는 광 바이오 센서는 생체 분자 상호 작용의 특성에 대한 신약 개발에 강력한 도구입니다. 이 연구에서 우리는 결합 친화와 인간의 proprotein convertase의 서브 틸리 켁신 유형 (9)에 대한 열 높은 친화력 단일 클론 항체 (단클론 항체) (PCSK9)의 역학을 평가하기 위해 우리의 실험실에서 네 일상적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼의 사용을 설명합니다. 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 모두 노포 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 기술에서 유도되는 반면, 전자는 즉석에서 6 × 6 십자 통해 병렬 후자 선물 반면 36 반응 반점, 직렬 흐름 구성 형태로 연결된 네 개의 플로우 셀을 갖고 미세 유체 채널 구성. 비스 MX96은 공간 방향에서 검출을 제공하는 추가의 촬상 기능은 SPR 센서 기술을 기반으로 동작한다. 연속 흐름 Microspotter (CFM)와 결합이 검출 기술은 전자에 의해 크게 처리량을 확대동시에 반응 96 개 스포츠 다중 어레이 인쇄 및 감지 nabling. 대조적으로 옥텟 RED384는 광섬유 프로브 간섭 패턴을 검출하는 바이오 센서의 역할과 BioLayer 간섭계 (BLI) 광학 원리에 기반은 팁 표면에서 상호 결합에 바꾼다. 표면 플라즈몬 공명 기반 플랫폼과는 달리, BLI 시스템은 연속 흐름 유체에 의존하지 않는다; 그들은 오비탈 교반 중에 384- 웰 마이크로 플레이트의 분석 용액에 침지하면서 대신, 센서 팁 판독을 수집한다. 이러한 바이오 센서 플랫폼은 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 1 분자 상호 작용 모델 : 상기 설명한 프로토콜은 단순한 1 맞 항체 - 항원 동력학을 특성화하기 위해 동일한 분석 포맷과 동일한 고품질의 시약을 사용하여 실험을 보여 질 운동 데이터를 제공하기 위해 이러한 기기 능력의 직접적인 비교를 제공한다 .

도 1은 두 고정화 방법에 의해 CFM 및 발견 항체 농도에서 항체 어레이 이미지를 도시하고,도 2는 이러한 항체 어레이의 다중 사이클에서 MX96에 운동 생성 대응 결합 sensorgrams 및 단일주기 운동 측정을 도시 . 6 - 바인딩 4 개 개의 바이오 센서 플랫폼에서 발생하는 다수의 항체가 코팅 된 표면으로부터 역학적으로 장착 곡선 실시간은도 3에 도시된다. 도 7은 이러한 결합 곡선의 글로벌 분석으로부터 얻어진 최종 운동 속도 및 평형 결합 상수를 비교 한 것이다. 개별 협회 (a를 K), 해리 (유전율 d), 평형 (K D) 결합 상수를 표 1에 나타내었다. 같은 기기 내에서 생성 된 데이터 세트의 변동성을 설명하기 위해, <st룽&gt;도 8은 다른 항체 표면 밀도에서 k 개의 A, K의 D 및 K D의 플롯을 도시하고,도 9에있어서, 상기 바이오 센서 플랫폼 단클론 항체 표면의 산출 결속 액티비티를 비교한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> 아민 결합 (A) 및 IBIS MX96에 CFM에서 출력 (B) 표면 항체를 포획 된 Fc-그림 1. 다중 리간드 어레이. 인쇄 어레이 이미지 붉은 사각형으로 둘러싸인 회색 영역은 항체의 존재를 나타내는 왼쪽 패널에 나타낸다. 활성 항체 스폿 간의 위치 진한 interspots 참조 감산에 사용된다. 각 열은 다음과 화상의 좌측 식별 적정 농도로 인쇄하는 항체를 포함한다. 디을 계산하여 정량 인쇄 된 항체의 양은활성과 기준 위치 사이의 부피 변화에 fference는 우측 패널에 도시되어있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> 멀티 사이클 (A)에서 Sensorgrams 바인딩 실시간 및 단일 - 사이클 (B)를 IBIS MX96의 운동 실험 그림 2. 비교. 10 × 8 항체 어레이에 걸쳐 증가하는 농도에서 사람 PCSK9의 순차 주사는 각 해당 센서 그램 세그먼트 위에서 언급된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <st바이아 코어 T100 1 운동 모델 맞추기 오버레이 : 룽&gt;도 3은 인간의 PCSK9 1과 상호 작용하는 항체의 캡쳐 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> ProteOn XPR36 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 4. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 고 (상단 패널), 메디을 통해 평가각하, (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> 옥 테트 RED384 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 5. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 포개어 적색 라인 1에 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다 :<html> 1 개 상호 작용 모델. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> IBIS MX96 1 운동 모델 맞추기 오버레이 :도 6 인간 PCSK9 1과 상호 작용 아민 결합 (A)과의 Fc- 캡처 (B) 항체의 Sensorgrams 바인딩. 바인딩 정보는도 1의 배열 판지도를 따라 10 × 8 패널로 구성된다. 검은 색 선은 다른 사람 PCSK9 농도에서 기록 된 결합 응답 신호를 나타내고, 포개어 적색 라인 피팅 곡선을 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> gure 7 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg &quot;/&gt; 도 협회 항 비교 포 바이오 센서 플랫폼에 의해 생성 된 바인딩 상수 A (A), 해리 (K)의 D (B)를 K, 평형 K D (C). 6 - 운동 파라미터는도 3의 결합 곡선 글로벌 분석으로부터 유도된다. 다음과 같은기구가 표현된다 : 비아 코어 T100 (블루) ProteOn XPR36 (녹색), 옥텟 RED384 (적색), 아민 결합 (보라색) IBIS MX96 및 IBIS MX96 (오렌지색)이 된 Fc-캡처. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> BIAC의 여러 항체 표면 밀도 이상 운동 속도 상수의 일관성의 그림 8. 비교<html> T100 석 (A), ProteOn XPR36 (B), 옥텟 RED384 (C) IBIS MX96 아민 결합 (D), 및 캡처 된 Fc-IBIS MX96 (E). 운동 파라미터는 (상위 서브 패널), 케이 D (중간 서브 패널) K, D 및 K (하단 서브 패널) 개별 항체 표면 밀도 그룹 분석으로부터 유도된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> 그림 네 개의 바이오 센서 플랫폼의 항체 표면과 그 표준 편차 (오차 막대)의 9 바인딩 활동. 값은 연구 논문 (17)에 기재된 식을 사용하여 계산된다.large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> (KA) </td><td> K D </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 (S) -1) </td><td> (S-1) </td><td> (㎚) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (1) </td><td> (7.8) 11.7 10 5 X </td><td> (4.18) 4.89 10 X -5 </td><td> 0.052 (0.05) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 2 </td><td> (0.28) 1.53 10 5 X </td><td> (1.54) 1.30 10 X -5 </td><td> 0.092 (0.12) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 3 </td><td> (8.3) 11.4 10 5 X </td><td> (11.0) 27.6 10 X -5 </td><td> 0.333 (0.20) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 4 </td><td> (1.6) 3.61 10 5 X </td><td> (12.3) 20.1 10 X -5 </td><td> 0.659 (0.54) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (5) </td><td> (0.21) 0.59 10 5 X </td><td> (2.50) 3.46 10 X -5 </td><td> 0.663 (0.46) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (6) </td><td> (0.78) 1.19 10 5 X </td><td> (3.83) 7.21 10 X -5 </td><td> 0.894 (0.64) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (7) </td><td> (0.53) 1.29 10 5 X </td><td> (5.63) 16.4 10 X -5 </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (8) </td><td> (2.23) 4.02 10 5 X </td><td> (10.7) 22.8 10 X -5 </td><td> 0.768 (0.68) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (9) </td><td> (2.13) 4.20 10 5 X </td><td> (4.3) 6.67 10 X -5 </td><td> 0.197 (0.16) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (10) </td><td> (0.49) 1.20 (1) X0 5 </td><td> (7.64) 12.5 10 X -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 1 상호 작용 모델 : 운동 요금 및 평형이 1 개의 바이오 센서 인스트루먼트의 바인딩 곡선의 글로벌 피팅에 의해 획득 (10) 단클론 항체의 상수 바인딩.

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Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

determination-high-affinity-antibody-antigen-binding-kinetics-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

20.6K 조회수.  Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc..  우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜. 

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

연구

생화학

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In plants, freeze damage occurs when extracellular ice crystals grow, resulting in the rupture of plasma membranes and possible cell death. Adsorption of IBPs to ice crystals restricts further growth by a process known as ice-recrystallization inhibition (IRI), thereby reducing cellular damage. IBPs also demonstrate the ability to depress the freezing point of a solution below the equilibrium melting point, a property known as thermal hysteresis (TH) activity. These protective properties have raised interest in the identification of novel IBPs due to their potential use in industrial, medical and agricultural applications. This paper describes the identification of plant IBPs through 1) the induction and extraction of IBPs in plant tissue, 2) the screening of extracts for IRI activity, and 3) the isolation and purification of IBPs. Following the induction of IBPs by low temperature exposure, extracts are tested for IRI activity using a &#39;splat assay&#39;, which allows the observation of ice crystal growth using a standard light microscope. This assay requires a low protein concentration and generates results that are quickly obtained and easily interpreted, providing an initial screen for ice binding activity. IBPs can then be isolated from contaminating proteins by utilizing the property of IBPs to adsorb to ice, through a technique called &#39;ice-affinity purification&#39;. Using cell lysates collected from plant extracts, an ice hemisphere can be slowly grown on a brass probe. This incorporates IBPs into the crystalline structure of the polycrystalline ice. Requiring no a priori biochemical or structural knowledge of the IBP, this method allows for recovery of active protein. Ice-purified protein fractions can be used for downstream applications including the identification of peptide sequences by mass spectrometry and the biochemical analysis of native proteins.

This paper outlines the identification of ice-binding proteins from freeze-tolerant plants through the assessment of ice-recrystallization inhibition activity and subsequent isolation of native IBPs using ice-affinity purification.

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.