S843 : LI1과의 Tg (EGFP kdrl) : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)를 증여에 대한 교수 크리스토프 Englert 교수 디디에 Stainier 감사합니다 균주 각각과의 Tg (kdrl을 : mCherry) 제공하는 대만 Zebrafish의 핵심 시설 C15- 카르을. 이 연구는 102-, 과학 기술 (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 대만의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다 2321-B-400-018).

윤리 정책 : 제브라 피쉬의 모든 실험 절차는 동해 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (IRB 승인 NO 101-12합니다.) 및 승인 된 지침에 따라 수행 하였다. 3β-HSD 효소 활성 염색 1. 재고 솔루션 <ol><li> 트랜스 dehydroandrosterone [디메틸 술폭 사이드 (DMSO)에 10 ㎎ / ㎖]를 준비한다. </li><li> β - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 수화물 (0.1 M 인산염 완충액에서 1.2 ㎎ / ㎖, pH를 7.2)을 준비한다. </li><li> 니코틴 준비 (비타민 B3,을 50mg / ㎖의 H 2 O). </li><li> 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 (50 ㎎ / ㎖ 70 % 디메틸 포름 아미드)를 준비한다. </li><li> -20 ° C에서의 미세 원심 분리 튜브에 나누어 저장하는 모든 이러한 구성 요소. 참고 : 우리의 경험, 반복 동결 모든 상기 용액의 분취 량의 해동에서 3β-HSD 활동 염색의 강도에 영향을주지 않습니다. </li></ol> 2. W홀 마운트 3β-HSD 활동 염색 참고 : 3β-HSD 효소 활성이 빠르면 28시간 게시물 수정 (HPF)와 같은 경우 배양 hsd3b1 2,7의 mRNA 발현의 발병과 일관성이 28.5 ° C,에서 제브라 피쉬 배아에서 감지 할 수 있습니다. 이 연구에서 전체 마운트 3β-HSD 활성 염색 프로토콜은 전술 한 방법 (8)에 기초하고 최대 7 일 후 시비 9 현상 제브라 성공적인 것으로 측정되었다. interrenal steroidogenic 조직의 혈관 미세 환경을 분석, 3β-HSD 활동 염색을 전체 마운트하는 것은 이러한 Tg는 같은 내피 세포 고유의 형광을 발현하는 형질 전환 라인 (kdrl : EGFP)에 적용해야합니다은 : C15- 카르 (15) (14)과의 Tg (mCherry kdrl를) S843 . 제브라 신장 개발을 고려 interrenal steroidogenic 조직을 분석, 3β-HSD 활성 염색 될 수 애플리LI1 물고기 (16), 사구체 및 pronephric 세관의 형성이 묘사되어 Tg가 (GFP wt1b)에 에디션. <ol><li> 색소 형성을 억제하기 위해, 12, 24 HPF 사이의 단계에서 시작, 달걀 물에 0.03 %의 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea)에서 (탈 이온수에 0.06 ㎎ / ℓ 암초 소금)을 배양하여 개발 제브라 피쉬를 취급합니다. </li><li> 밤새 실온 (RT) 또는 (B) 2 % PFAT에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (PFAT)으로 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (A) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 dechorionated 배아 또는 유충 해결 4 °의 C 또는 실온에서 4 시간 뒤에 4 ° C에서 2 시간에 대해. 주의 : PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 독성. 그것은 피부, 점막, 눈, 상부 호흡기에 파괴. </li><li> PBS는 RT에서 0.1 % 트윈 20 (PBST)가 보충 10 분간 배아 4X 씻는다. 주 : 세탁 솔루션을 변경하면서 샘플을 건조하지에 중요합니다. </li><li> 갓 역을 준비반응 전에 ining 용액 (표 1). 준비, 소용돌이, 분리 튜브에서 원심 분리 부 A 및 B. 참고 : 바로 하나의 튜브에 모든 구성 요소를 추가하면 심한 침전을 일으킬 것입니다. </li><li> 부분 (B)의 전체 용액 A 부분의 전체 용액을 첨가 염색 용액을 제조 잘 혼합하고 즉시 고정 세정 배아를 포함하는 각 미세 원심 분리 튜브에 1 ㎖에 배포한다. </li><li> 회 전자 또는 실온에서 진탕 부드러운위한 락 플랫폼 중 하나에 빛과 장소에서 그들을 보호하기 위해 알루미늄 호일로의 microfuge 튜브를 감싸. </li><li> 경험적으로 현미경을 통해 발색 신호를 모니터링함으로써, 반응 시간을 결정한다. 시간이 지남에 따라 개발한다 약간의 침전; 그러나, 이들은 반응 과정을 방해하지 않을 것이다. 참고 : 배아가 4 시간 동안 25 ° C에서 28 HPF, 염색 고정을 위해 interrenal 조직에서 명확한 신호를 생성한다. </li><li> PBST에서 10 분 동안 4 배를 세척하여 반응을 정지. 나는F 더 이상 면역 조직 화학 (IHC) 분석이 필요하지 않습니다, 이후 수정 실온에서 60 분 동안 4 % PFAT와 스테인드 배아를. 그렇지 않으면 더 사용할 때까지 4 ° C에서 세척 된 배아를 저장합니다. </li><li> 전체 마운트 현미경 들어, PBS에 50 % 글리세롤로, 염색 후 고정, 세척 배아를 취소 슬라이드에이 위를 향하도록 몸 윗면로 방향을, 밝은 필드 조명 아래 직립 현미경을 이용하여 관찰한다. 참고 : 권장 interrenal 조직 형태의 고해상도 이미지의 3β-HSD 활동 염색 및 deyolked 배아의 분석을 평면 마운트 확인하십시오. interrenal steroidogenic 조직이 바로 난황 위에 위치로, interrenal 조직의 복부 평면 마운트 분석은 interrenal 형태 (17)의 직접적이고 명확한 관찰 할 수 있습니다. </li></ol> 3β-HSD 활동 묻은 태아의 3 IHC 분석 주 : steroi의 혈관 미세 환경 분석을위한dogenic 조직은 형질 전환 내피 특정 형광 기자와 3β-HSD 활동 묻은 배아는 vibratome 절편 이후 IHC 분석 12, 18, 20, 22를 횡단하기 위해 실시한다. <ol><li> 후 고정 <ol><li> 4 ° C에서 1 시간 동안 1 % 트리톤 X-100 보충 2 % PFA와 3β-HSD 활동 염색 및 세척 배아를 포스트 - 수정 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 PBS에서 10 분 동안 배를 씻어 (PBSTx) RT에서. </li></ol></li><li> 퍼가기 <ol><li> 4 %가 95 ° C, 4-8 ℃에서의 microfuge 튜브로 나누어지는 및 매장에서 PBS에서 아가로 오스를 용해하여 아가 로스 저 융점 준비합니다. </li><li> 10 분 동안 70 ° C에서 아가로 오스 4 % 저 융점의 나누어지는 용융 한 후 47 ° C에서 나누어지는을 유지합니다. 각각의 배아를 포함 용융 4 % 금형 역할을하는 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브의 분리 된 모자 아가로 오스 저 융점, 고체까지 냉각 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Vibratome 단면 <ol><li> 건조 페이지에 종이 테이프의 조각 스틱vibratome의 latform. </li><li> 면도날에 의해 금형에서 경화 아가로 오스 블록을 제거합니다. 플랫폼에 종이 테이프에 순간 접착제를 적용하고 위를 향 샘플의 앞쪽면, 종이 테이프에 아가로 오스 블록을 수정합니다. 각각 약 4mm 상부 및 하부면 양쪽에 8mm로, 사다리꼴 프리즘 형상 아가 블록 낸다. </li><li> 스포이드를 사용하여 0.5 % 트리톤 X-100 (0.5 % PBSTx) 보충 차가운 PBS로 샘플을 함유 아가로 오스 블록을 씻어. </li><li> vibratome의 사용 설명서에 따라 100 μm의 섹션으로 아가로 오스 블록을 슬라이스. 계속해서 건조를 방지하는 아가 블록을 헹군다. 각 슬라이스 절단되기 때문에, 26 G 주사기 바늘을 이용하여 vibratome에서 제거하고, 차가운 0.5 % PBSTx (500 μL / 웰)를 포함하는 스폿 플레이트에 옮긴다. </li><li> 해부 현미경 하에서 검사하여 3β-HSD 활성 양성 조직 절편을 수집하고, PI에 의한 부분 전송추운 0.5 % PBSTx (150 μL / 웰)를 포함하는 96 웰 플레이트에 끝 차단 (개방에서 약 1mm 내경)와 pette 팁. 조직 샘플은 통상적으로이 공정 후의 아가 블록으로부터 해리. </li></ol></li><li> Permeabilization 및 세척 <ol><li> PBS에서 10 분, 1 % 소 혈청 알부민 / 1 % DMSO / 0.1 % 트리톤 X-100 (PBDTx)로 보충을위한 슬라이스 RT에서 0.5 % PBSTx 15 분간 PBS에서 10 분, 4 배 6 배 씻는다. </li></ol></li><li> 블로킹 <ol><li> RT에서 1 시간 PBDTx 2 % 소 태아 혈청 (FCS)을위한 슬라이스 부화. </li></ol></li><li> 차 항체 반응 <ol><li> 차 항체를 함유하는 PBDTx 1.5 일 동안 인큐베이션 슬라이스 (예를 들어 토끼 다 클론 항 - 인간 피브로넥틴 및 마우스 항 - 인간 국소 부착 키나아제) 4 ℃에서. </li></ol></li><li> 세탁 <ol><li> 조각은 실온에서 PBDTx에서 10 분 동안 6 배 씻으십시오. </li></ol></li><li> 블로킹 <ol><li> PB에 2 % FCS에서 1 시간 동안 조각을 품어RT에서 DTX. </li></ol></li><li> 차 항체 반응 <ol><li> 4 ° C에서 차 항체 (형광 결합 염소 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 IgG)를 포함 PBDTx 1.5 일 동안 조각을 품어. </li></ol></li><li> 세탁 <ol><li> 조각은 실온에서 PBST에서 10 분 동안 10 RT에서 PBDTx에서 분 및 4 배에 대한 6 배 씻으십시오. , 공 초점 현미경 분석을 위해 PBS에 50 % 글리세롤로 샘플을 취소 : 참고. </li></ol></li></ol> 4. 공 촛점 분석 <ol><li> 전체 마운트 배아 및 10X / 0.5 20X / 0.75 대물 렌즈가 장착 된 공 초점 현미경으로 단면을 관찰한다. </li><li> 다음 형광 및 3β-HSD 염색을 동시에 검출 들어, 멀티 모드를 설정 488nm의 아르곤 레이저 및 GFP의 검출 505-530 nm의 대역 통과 필터; 543 nm의 헬륨 - 네온 레이저 mCherry 감응 560-615 nm의 대역 통과 필터; 및 3β-HSD의 얼룩의 검출을위한 광 채널 전송된다.핀홀 크기는 1 Airey 부이고, 해상도가 1024 X 1024 픽셀이다. </li><li> 3 차원으로 투영 (6 μm의 간격)의 Z 스택을 조립하고 이용함으로써, 돌기와 시야 병합 내장 촛점 소프트웨어. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests to declare.

3β-HSD 활동의 신호 강도는 반응의 과정을 통해 증가. 3β-HSD 활동의 명확한 신호는 이후 28 HPF에서 단계에 대한 반응 4 시간 후에 발견되었다. 그러나, 반응 시간은 분석의 목적에 따라 경험적 결정이 필요하다. 염색 밤새 처리 요구의 경우, 약간 엷은 배경 샘플을 개발하는 경향이있다. 이 문제는 HSD-3β 활성 염색 전에 고정 지속 시간 (예를 들어, RT에서 4 % PFAT에서 4 시간)의 증가에 의해 극복 될 수있다. 이러한 실온에서 4 % PFAT와 밤새 고정으로 대비, overfixation에 의해, 매우 분명 배경에 연결됩니다. 그러나, 더 긴 시간은 상기 신호의 원하는 강도를 얻기 위해 요구된다. 우리는 3β-HSD 활동 염색하기 전에 밤새 2 %보다는 4 % PFAT와 샘플을 고정하는 것은 일반적으로 후속 형광 기자의 관찰 또는 I에서 더 바람직한 결과를 얻을 것으로 나타났습니다HC 분석. 그러나, 4 % PFAT와 배아를 고정하기 (1 일 이내에 완료)를 3β-HSD 활성의 신속한 분석을 허용하고, 따라서 interrenal steroidogenic 조직을 표적 유전자 또는 화학 스크린 이득 것이다. 화학 성분 미량의 더욱 광범위한 세척 후 스테인드 샘플에서 지속하는 경향이 긴 저장 기간 후 높은 배경을 초래할 것이기 때문에 3β-HSD 활동 염색 후 배아를 포스트 - 고정하는 것은 필수적이다. 그러나, 3β-HSD 활동 염색, 4 ° C에서 배아를 씻어 하룻밤 배경의 눈에 띄는 향상을 초래하지 않는 저장, IHC 분석을 촉진하기 위해 실시되는 3β-HSD 활동 묻은 배아 경우. 3β-HSD 활동 묻은 태아의 현장 하이브리드 (ISH) 분석에서 가능하다. 예를 들어, prox1 사체의 발현은 steroidogen에서 3β-HSD 활동과 colocalized된다IC에서 조직 10. ISH 외에 3β-HSD 활동 염색을 수행하려면 배아는 세포의 RNA 전 사체는 ISH 분석을위한 바람직한 품질을 보존 할 수 있도록 이전과 3β-HSD 활동 분석 후 모두 4 시간 동안 4 % PFAT에서 해결해야합니다. ff1b, cyp11a1, hsdb1, 스타의 리보 프로브를 사용하여 ISH 분석은 interrenal steroidogenic 조직 1,2,11의 개발 연구에 적용되었습니다. cyp11a1와 스타의 사람들은 24 HPF에 의해 interrenal 세포를 분화 감지하면서 ff1b의 리보 프로브 (riboprobe)는 22 HPF에 의해 원시 interrenal 세포를 감지합니다. 28 HPF 전방으로부터 차별화 interrenal 조직을 검출 3β-HSD 조직 화학적 염색과 비교해서 ISH 분석 모두 원시 차별화 interrenal interrenal 세포에서 특정 유전자의 스펙트럼을 분석하기 위해 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 3β-HSD 조직 화학적 염색 하분화 steroidogenic interrenal 조직의 표현형 분석을위한 간단하고 신속하고 신뢰할 수있는 이점을 S 및 따라서 상세한 연구 개발 강력한 도구뿐만 아니라 대규모 유전자 또는 화학 화면이다. 관련 문헌의 검토에 따라, 안정적으로 면역 조직 화학 염색을 통해 steroidogenic interrenal 조직에서 단백질 발현을 검출 할 수있는 특정 항체가 존재하지 않습니다. 따라서, 3β-HSD 조직 화학적 염색 방법은 조직과 steroidogenic interrenal 조직의 세포 형태를 서술하는데 특히 유용하다. 3β-HSD 조직 화학적 염색은 차별화 된 steroidogenic interrenal 조직의 시각화하는 데 유용하지만, 직접 스테로이드 합성 능력 또는 interrenal 세포의 기능을보고하지 않습니다. steroidogenic 합성 폭포의 상류 또는 3β-HSD의 다운 스트림 효소에 영향을 미치는 돌연변이 또는 화학 물질하지 않을 수 있습니다그들이 나 크기 또는 interrenal 조직의 형태를 교란하지 않을 수 있기 때문에 반드시이 기술 된 방법으로 검출 될 수있다. 따라서,이 프로토콜의 사용자는 특정 효소 장애 기능에 영향을 미치는하지만 interrenal 조직의하지 형태가 쉽게이 방법에 의해 감지되지 않을 수 있음을 명심해야한다.

부신은 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축의 중요한 구성 요소, 스테로이드를 분비하고 스테로이드 항상성과 스트레스에 대한 신체 반응을 조정한다. 부신은 카테콜아민을 합성 ㄱ 영역 별 방식으로 스테로이드를 분비 바깥 쪽 피질, 및 내부 수질를 포함한다. 경골 어류의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 상대이며, 부신 피질과 수질, 각각 1-3의 기능적 등가물이다 steroidogenic interrenal과 크롬 친화 세포로 구성되어있다. 제브라 피쉬 모델을 사용하여 수행 연구는 모두 steroidogenic 및 크롬 친화 세포의 계보가 매우 포유류 1, 2에서와 유사한 분자 및 세포 메커니즘에 의해 형성되는 것으로보고있다. 따라서, 제브라 피쉬는 유전 질환, 신경 내분비 조절하고, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (interrenal) 축 시스템 생물학 연구를위한 잠재적으로 강력한 모델이다. 4,5에서 17α-hydroxypregnelolone에서 프레 그네 놀론, 17α-hydroxyprogesterone에서 프로게스테론의 변환 및 안드로 스텐 디온을 촉매. 3β-HSD 호르몬 스테로이드, 즉 황체 호르몬, 글루코 코르티코이드, 무기질 코르티코이드, 안드로겐과 에스트로겐의 모든 클래스를 생합성을 위해 필수적이다. 두 사람의 3β-HSD는 HSD3B1을 동질 효소와 HSD3B2는 차동 (6) 표현된다. HSD3B2가 신피질 생식선에서 발현되는 반면 HSD3B1는 태반 및 말초 조직에서 발현된다. 인간 HSD3B1 및 HSD3B2는 interrenal 조직과 성인 생식선에서 표현되는 제브라 피쉬 hsd3b1, 공동 orthologs이다; 제브라 피쉬 hsd3b2 누구의 성적 기관 형성 칠하기 전에 사라질 모체 표현 유전자이다. 제브라 피쉬의 전체 마운트 3β-HSD 효소 활성 분석의 프로토콜, 레비의 방법을 수정하여 개발 된밀라노 등의 알에 의해 설명 s의. 여덟 경골 종 (8)의 동결 절편에. 때문에 조직 투과성 현상 지브라 피쉬의 광학 투명성, 3β-HSD 조직 화학 성공적 고정 제브라 배아와 유충에 사용할 수있는 전체 마운트 구체적 차별화 interrenal 조직을 서술. 이 민감하고 신속한 분석은 interrenal dysmorphogenesis의 다른 유형을 보여주는 다양한 돌연변이 morphants 적용되었다. interrenal 3β-HSD 활성은 interrenal 조직 명세가 Ff1b 전사 인자의 특정 녹다운을 중단하고 interrenal 분화가 Ff1b의 coregulator Prox1 9,10-의 최저 의해 영향으로 감소 된 배아 부재. 특히, 3β-HSD 활동과 같은 하나 아이드 핀 머리 심한 초기 결손 돌연변이 체에서 검출 될 수 있고, 여기서 H-3β, 곁눈질SD 조직 화학은 interrenal 세포 이동 (11)를 어떻게 영향을 받는지 묘사. interrenal 조직의 분화에도 혈액과 혈관의 완전한 부재에 손상되지 않습니다. 따라서, 내피 세포 유래 신호를 형성하는 방법을 개발 interrenal 기관은 12, 13를 측정 할 수있다. 전반적으로,이 조직 화학적 분석은 성공적으로 제브라 피쉬 모델의 사양, 차별화, 그리고 steroidogenic 세포의 이동을 연구에 사용되었다. 따라서, 효율적이고 부신 및 interrenal 장기 장애를 타겟팅하는 유전자 또는 화학 스크린에 대한 신뢰할 수있는 도구를해야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:187px;">Carl Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:72px;">LSM510&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>USB</td>
			<td>US16374</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S380C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nusieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylthiourea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100Tab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PYREX Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reef Salt</td>
			<td>AZOO</td>
			<td>AZ28001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-Dehydroandrosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

pronephric 신장 사구체 및 초기 혈관과 steroidogenic interrenal 조직 codevelops에서, 3β-HSD 효소 활성 분석은 이중 형질 전환의 Tg (wt1b : GFP)에서 수행 된 방법을 결정하려면 LI1, Tg는 (kdrl : mCherry) C15- 카르 배아를 34 HPF에서 (그림 1). 이 단계에서, 3β-HSD 활동을 양성 steroidogenic 조직을 바로 중간 선에 위치하고 있으며 일부 steroidogenic 세포가 중간 선에서 마이그레이션을 시작하고 지느러미보기에서 돌출 가장자리를 형성하는 반면 즉시 pronephric 신장 사구체에 꼬리 지느러미. steroidogenic 조직은 밀접하게 지느러미 대동맥 (DA) 및 후방 추기경 정맥 (PCV)와 연결되어 있습니다. Tg는 (kdrl : GFP)의 3β-HSD 효소 활성 분석 S843 배아는 DA, PCV를 포함하여 근교 interrenal 선박의 명확한 묘사 허용및 interrenal 용기 (IRV도 2). 3β-HSD 활성 염색 배아 Vibratome 섹션 국소 부착 키나제 인산화 된 세포 외 기질 단백질 피브로넥틴 및 그 하류 이펙터를 검출하기위한 IHC 분석을 실시 하였다. 피브로넥틴의 요정-DA 증착 IRV 성장 (18)을지지하기위한 필수적이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54820/54820fig1.jpg" /> 그림 1 : 형광 기자를 표현하는 제브라 피쉬에서 수행 3β-HSD 활동 염색을 전체 - 마운트합니다. 지느러미 (패널 왼쪽)과 배면 측면 (오른쪽 패널)를 3β-HSD 활동 묻은의 Tg (wt1b : GFP)의 전망 LI1, Tg는 (kdrl : mCherry) (34) HPF에서 C15- 카르 배아의 interrenal의 상대적 공간 분포를 시각화 할 수 있습니다 조직 (IR), pronephric 사구체 (PG), pronephric 세관 (PT), 등쪽 대동맥 (DA), 측면 지느러미대동맥 (LDA), 후방 추기경 정맥 (PCV). 때문에이 단계에서 interrenal 조직의 위치는 배면 측면 뷰는 배아의 오른쪽에서이다. D, 지느러미; V, 복부; A, 전방; P, 후방; R, 오른쪽; L, 왼쪽. 스케일 바는 50 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54820/54820fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54820/54820fig2.jpg" /> 그림 2 : Vibratome는 절편과 3β-HSD 활동 묻은의 Tg (kdrl : GFP)의 IHC 분석 S843 배아. 34 HPF 배아는 3β-HSD 효소 활성 분석하고 vibratome 단면 처리를 행 하였다. 3β-HSD 활동-긍정적 인 부분은 F (토끼 항 - 인간 피브로넥틴으로 두 번 IHC에 의해 염색엔; 1/200) 및 마우스 항 - 인간 인산화 초점 부착 키나아제 (pFak; pY397 1/100). 횡단면은 interrenal 조직 (IR)와 지느러미 대동맥 (DA), 후방 추기경 정맥 (IRV), 후방 추기경 정맥 (PCV)를 포함하는 인접 선박의 상대적 분포를 보여줍니다. NT, 신경관; NC, 척색; S, 체절. 스케일 바는 50 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54820/54820fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 주식 농도 </td><td> 1000 μL에서 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 부분 A. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td> 40 μL </td><td></td></tr><tr><td> DHEA </td><td> 10 ㎎ / ㎖ </td><td> 10 μL </td><td> 0.1 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> NAD </td><td> 1.2 ㎎ / ㎖ </td><td> 10 μL </td><td> 12 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 파트 B. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td> 936 μL </td><td></td></tr><tr><td> 비타민 B3 </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td><td> 2 μL </td><td> 0.1 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> NBT </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td><td> 2 μL </td><td> 0.1 ㎎ / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 3β-HSD 염색 반응 요소.

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ 5-4 이성화 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K 조회수.  Tunghai University.  제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ 5-4 이성화 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다. 

비디오: Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...