אנו מודים פרופ &#39;כריסטוף אנגלר ופרופ דידייה Stainier עבור gifting את Tg (wt1b: GFP) Li1 ו Tg (kdrl: EGFP) s843 זנים, בהתאמה, ואת מתקן Core דג הזברה טייוואן למתן Tg (kdrl: mCherry) ci5. מחקר זה נתמך על ידי מענקי משרד של טייוואן המדע והטכנולוגיה (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

משפט ואתיקה: כל הפרוצדורות על דג הזברה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש Tunghai אוניברסיטת (אישור IRB NO 101-12.) ובוצע בהתאם להנחיות שאושרו. 1. פתרונות המניות עבור 3β-HSD אנזימתי פעילות מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן-dehydroandrosterone טרנס [10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב sulfoxide דימתיל (DMSO)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מימה dinucleotide אדנין β-nicotinamide (1.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן nicotinamide (ויטמין B3, 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב H 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן tetrazolium כחול 4-ניטרו (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב dimethylformamide 70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot כל המרכיבים האלה לתוך צינורות microfuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: מניסיוננו, חזרה הקפאה להפשרה של aliquots של כל הפתרונים הנ&quot;ל אינו משפיע על עוצמת 3β-HSD פעילות מכתימה. </li></ol> 2. Wחור-הר 3β-HSD פעילות מכתים הערה: 3β-HSD הפעילות האנזימטית ניתן לזהות עוברי דג הזברה מוקדם ככל 28 שעות שלאחר ההפריה (hpf) כאשר בתרבית על 28.5 מעלות צלזיוס, אשר עולה בקנה אחד עם תחילת ביטוי mRNA של hsd3b1 2,7. פרוטוקול מכתים פעילות כל הר 3β-HSD במחקר זה מבוסס על שיטה שתואר לעיל 8 והיה נחוש להצליח דג הזברה פיתוח עד 7 ימים לאחר ההפריה 9. לניתוח במיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה steroidogenic interrenal, כל הר מכתים פעילות 3β-HSD יש להחיל קווי מהונדס המבטא הקרינה ספציפי האנדותל, כגון Tg (kdrl: EGFP) s843 14 ו Tg (kdrl: mCherry) ci5 15 . כדי לנתח את רקמת steroidogenic interrenal שוקלת את המשך הפיתוח כליות דג הזברה, 3β-HSD פעילות מכתים יכול להיות appliעורך אל Tg (wt1b: GFP) Li1 דגים 16, שבו היווצרות של tubules glomerulus ו pronephric מותווה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את דג הזברה פיתוח על ידי דוגרים להם 0.03% phenylthiourea במים ביצה (מלח 0.06 מ&quot;ג / L שונית במים deionized), החל משלב בין 12 ל 24 hpf, לעכב היווצרות פיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן עוברים dechorionated או זחלים ב (א) 4% paraformaldehyde (PFA) ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 0.1% Tween 20 (PFAT) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT) או (ב) 2% PFAT לילה בשעה 4 ° C או עבור שעה 2 ב 4 ° C, ואחריו 4 שעות ב RT. זהירות: PFA הוא רעיל על ידי שאיפה ידי מגע עם העור. זה הרסני לעור, ריריות, עיניים, ודרכי הנשימה העליונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 4x עוברים במשך 10 דקות עם PBS בתוספת 0.1% Tween 20 (PBST) ב RT. הערה: זה קריטי כדי לא לייבש את הדגימות תוך שינוי פתרונות הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין את staפתרון ining לפני התגובות (טבלה 1). כן, מערבולת, וחלקי צנטריפוגות A ו- B ב צינורות נפרדים. הערה: הוספת כל המרכיבים ישר לתוך צינור אחד תגרום משקעים קשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הפתרון השלם של חלק לפתרון השלם של חלק ב &#39;, ומערבב היטב כדי להכין את הפתרון המכתים, ומייד להפיץ 1 מיליליטר לתוך צינור אחד microfuge המכיל עוברים קבועים ורחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת צינורות microfuge עם רדיד אלומיניום על מנת להגן עליהם מפני האור והמקום משני הכתף או פלטפורמת נדנדה עבור רעד עדין ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אמפירי לקבוע את זמן התגובה על ידי ניטור אותות chromogenic באמצעות מיקרוסקופיה. משקעים קלים יפתחו לאורך זמן; עם זאת, הם לא יפריעו לתהליך התגובה. הערה: לקבלת עוברים קבועים ב 28 hpf, מכתים ב 25 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות מייצרת איתות ברורה על רקמות interrenal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי שטיפת 4x במשך 10 דקות ב PBST. אניf לא immunohistochemical נוסף (IHC) ניתוח נדרש, שלאחר לתקן את העוברים מוכתם 4% PFAT במשך 60 דקות ב RT. אחרת, לאחסן את העוברים לכבס ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופיה כל ההר, נקה את המוכתם, שלאחר קבוע, ורחץ עובר עם גליצרול 50% ב- PBS, כוון אותם עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה בשקופית, ולבחון באמצעות מיקרוסקופ זקוף תחת תאורה בשדה בהירה. הערה: כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה רקמות interrenal, שטוח הר ניתוח 3β-HSD פעילות מוכתמת עובר deyolked מומלץ. כמו רקמת steroidogenic interrenal ממוצבת ממש מעל שק החלמון, ניתוח שטוח הר הגחון של הרקמה interrenal מאפשר תצפית ישירה וברורה של מורפולוגיה interrenal 17. </li></ol> 3. ניתוח IHC של עוברי פעילות מוכתמת 3β-HSD הערה: לקבלת ניתוח המיקרו-סביבה של כלי הדם של steroiרקמת dogenic, העוברים מוכתם פעילות 3β-HSD עם כתב ניאון האנדותל ספציפי מהונדס חשופים רוחביים חתך vibratome וניתוח IHC עוקב 12,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את 3β-HSD פעילות מוכתם ורחץ עוברים עם 2% PFA בתוספת 1% Triton X-100 עבור שעה 1 ב 4 ° C ולשטוף 4x במשך 10 דקות ב PBS המכיל 1% Triton X-100 (PBSTx) ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Embedding <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% נמוך ההיתוך agarose על ידי המסת agarose ב PBS על 95 מעלות צלזיוס, aliquot לתוך צינורות microfuge, ולאחסן ב 4-8 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים aliquot של 4%-התכה נמוכה agarose ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשמור את aliquot ב -47 ° C. הטמע את כל העובר ב מותכת 4% נמוך ההיתוך agarose בכובע פרטי או צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge אשר משמש עובש, להתקרר עד מוצק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד חתיכת סרט נייר p היבשlatform של vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלוק agarose קשה מרוב עובש על ידי סכין גילוח. החל דבק מגע לקלטת נייר על הרציף, ולתקן לחסום agarose על גבי קלטת נייר, עם הצד הקדמי של המדגם פונה כלפי מעלה. חתוך את הבלוק agarose לצורה פריזמה טרפז, עם כ 4 מ&quot;מ ו 8 מ&quot;מ בכל צד של היבטים העליונים והתחתונים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הבלוק agarose המכילים מדגם עם קר PBS השלימו עם 0.5% Triton X-100 (0.5% PBSTx) באמצעות טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את גוש agarose לתוך 100 מיקרומטר חלקים לפי במדריך ההוראות של vibratome. כל הזמן לשטוף את הבלוק agarose כדי למנוע התייבשות. כמו כל פרוסה חותכת, להסיר אותו vibratome באמצעות מחט מזרק 26 G, ולהעביר לצלחת מקום המכילה קר 0.5% PBSTx (500 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הפעילות החיובית HSD-3β סעיפי רקמה ידי סימון תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ולהעביר את הסעיפים ידי pipette טיפ עם חתך סופו (כ 1 מ&quot;מ קוטר פנימי בפתיחה) לתוך צלחת 96-היטב המכילה קר 0.5% PBSTx (150 μl / טוב). דגימות הרקמה בדרך כלל לנתק מגוש agarose לאחר שלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization ו כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פרוסות 6x במשך 15 דקות ב 0.5% PBSTx ב RT, 10 דקות ב PBS, 4x במשך 10 דקות ב PBS השלימו עם DMSO אלבומין 1% שור / 1% / 0.1% Triton X-100 (PBDTx). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה עבור נסיוב עגל 1 hr ב 2% עובריים (FCS) ב PBDTx ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה ראשית נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה עבור 1.5 ימי PBDTx המכילים נוגדן ראשוני (למשל, פיברונקטין אנטי אנושי polyclonal הארנב קינאז הדבקה מוקדים אנטי אנושי עכבר) ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כְּבָסִים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פרוסות 6x במשך 10 דקות ב PBDTx ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה במשך שעה 1 ב 2% FCS ב PBDTX ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת נוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות עבור 1.5 ימים PBDTx המכיל נוגדנים משני (ארנב נגד עז מצומדות fluorophore או IgG אנטי עכבר) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כְּבָסִים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פרוסות 6x במשך 10 דקות ב PBDTx ב RT ו 4x במשך 10 דקות ב PBST ב RT. הערה: לקבלת ניתוח מיקרוסקופי confocal, נקה את דגימות עם גליצרול 50% ב- PBS. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב העובר ההר השלם והסעיף ידי מיקרוסקופ confocal מצויד 10X / 0.5 ו 20X / 0.75 עדשה אובייקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהוי סימולטני של הקרינה ואת מכתים 3β-HSD, להגדיר את מצב multitrack כדלקמן: לייזר ארגון 488 ננומטר 505-530 מסנן bandpass ננומטר לצורך זיהוי של GFP; 543 לייזר הליום-נאון ננומטר מסנן bandpass 560-615 ננומטר לצורך זיהוי של mCherry; ומשודר ערוץ אור לצורך זיהוי של מכתים 3β-HSD.גודל החריר הוא 1 יחידת איירי, וההחלטה היא 1,024 x 1,024 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את ערימות z (עם 6 מרווח מיקרומטר) כהשלכת 3D, ולמזג את ההקרנה ואת השדה הבהיר, באמצעות תוכנה המובנית confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li><li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development.">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li><li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model.">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li><li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome:+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes.">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li><li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase/delta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells.">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551 (1992).</li><li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase/delta5-delta4+isomerase+gene+family.">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li><li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function,+expression,+and+evolution.">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li><li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts:+morphology,+histology,+and+immunohistochemistry.">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium.">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo.">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997 (2014).</li><li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development.">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis.">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li><li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish.">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li><li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel.">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040 (2012).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to declare.

עוצמת האות של פעילות 3β-HSD וגובר במהלך ריאקציה. אותות ברורים של פעילות 3β-HSD אותרו לאחר 4 שעות של התגובה לשלבים מ -28 hpf ואילך. עם זאת, משך התגובה דורש נחישות אמפירית, בהתאם לצורך של assay. במקרים בהם מכתים דורש עיבוד לילה, רקע כחלחל מעט נוטה להתפתח על דגימות. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי הגדלת משך קיבעון (למשל, 4 hr ב PFAT 4% ב RT) לפני מכתים פעילות 3β-HSD. לעומת זאת, overfixation, כגון תיקון עבור לילה עם 4% PFAT ב RT, מוביל רקע ברור מאוד. עם זאת, כבר זמן שיידרש כדי להשיג עוצמת רצויה של האות. שמנו לב כי תקנו את דגימות לילה עם 2% במקום 4% PFAT לפני מכתים פעילות 3β-HSD בדרך כלל מניב תוצאות רצויות יותר התבוננות כתב ניאון עקב או שאניניתוח HC. עם זאת, לתקן את העוברים עם 4% PFAT מאפשר assay מהירה של הפעילות 3β-HSD (הושלמה בתוך 1 יום) וכך ירוויח מסך גנטי או כימי מיקוד רקמות steroidogenic interrenal. פוסט לתקן את העוברים לאחר מכתים פעילות 3β-HSD חיוני, כי כמויות זעירות של מרכיבים כימיים נוטות להתמיד דגימות המוכתמות גם לאחר כביסה נרחבת ו תבאנה רקע גבוה לאחר תקופת אחסון ארוכה. עם זאת, אם 3β-HSD עובר מוכתם הפעילות הם יינקטו כלפיו באופן מעמיק IHC, אחסון הפעילות מוכתמת 3β-HSD ורחץ עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לא לגרום שיפור מורגש של הרקע. כלאה באתרו (שאני עורך) ניתוח של עוברי מוכתם פעילות 3β-HSD אפשרי. לדוגמה, הביטוי של תמלילי prox1 הוא colocalized עם פעילות 3β-HSD על steroidogenic רקמות 10. כדי לבצע מכתים פעילות 3β-HSD בנוסף אי&quot;ש, העוברים חייב להיות קבוע PFAT 4% במשך 4 שעות הן לפני והן אחרי assay פעילות 3β-HSD כך תעתיקי רנ&quot;א הסלולר יכול להישמר עם איכות רצויה לניתוח שאני עורך. ניתוח שאני עורך באמצעות riboprobes של ff1b, cyp11a1, hsdb1, וכוכב יושמו המחקרים ההתפתחותי של 1,2,11 רקמות steroidogenic interrenal. Riboprobe של ff1b מזהה תאים interrenal הקדמוני ידי 22 hpf, בעוד אלה של cyp11a1 וכוכב לזהות הבחנה תאים interrenal ידי 24 hpf. לעומת 3β-HSD מכתים histochemical אשר רק מזהה רקמות interrenal הבדיל בין 28 hpf ואילך, ניתוח שאני עורך יכול לשמש כדי לנתח ספקטרום של גנים interrenal ספציפי בשני תאים interrenal הקדמוני ומובחן. אף על פי כן, 3β-HSD חה מכתים histochemicalזה את היתרון של להיות פשוט, מהיר, ואמין לניתוח פנוטיפ של הרקמה interrenal steroidogenic הבדיל, ולכן הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים התפתחותיים מפורט כמו גם מסכי גנטי או כימי בקנה מידה גדול. לפי סקירתנו של ספרות רלוונטית, לא מקיים נוגדן ספציפי שיכול לזהות את ביטוי החלבון מהימן רקמת interrenal steroidogenic באמצעות אימונוהיסטוכימיה. לכן, השיטה המכתימה histochemical-HSD 3β היא מועילה במיוחד תוך התוויית רקמות מורפולוגיה הסלולר של רקמת interrenal steroidogenic. למרות 3β-HSD מכתים histochemical שימושי עבור להדמיה של רקמת interrenal steroidogenic בדיל, זה לא ישירות לדווח יכולת סינתזת סטרואידים או פונקציונלי של תאי interrenal. מוטציות או כימיקלים המשפיעים אנזימים במעלה או במורד הזרם של 3β-HSD במפל סינתזה steroidogenic אולי לאבהכרח להתגלות עם שיטה מתוארת זה, שכן הם עשויים או לא עשויים להפריע או גודל או מורפולוגיה של רקמת interrenal. לכן, משתמשים של פרוטוקול זה צריכים לזכור כי ליקויי האנזימטית מסוימים המשפיעים על תפקוד אבל לא המורפולוגיה של רקמת interrenal לא תזוהה בקלות על ידי שיטה זו.

<html> בלוטת יותרת הכליה, מרכיב חיוני של ציר hypothalamo-היפופיזה-אדרנל, מפריש סטרואידים ומתאם הומאוסטזיס סטרואידים ואת התגובה הגופנית ללחץ. בלוטת יותרת הכליה כולל הקורטקס החיצוני, אשר מפריש סטרואידים באופן אזור ספציפי, ומדולה פנימית, אשר מסנתז קטכולאמינים. בלוטת interrenal ב teleosts היא העמית של בלוטת יותרת הכליה ביונקים והוא מורכב של תאי interrenal ו chromaffin steroidogenic, שהן ושווי תפקודי של קליפת יותרת הכליה ומדולה, בהתאמה 1-3. מחקרים שנערכו תוך יישום מודל דג הזברה דיווחו כי הן שושלות תאים steroidogenic ו chromaffin נוצרות על ידי מנגנונים מולקולריים ותאיים מאוד דומים לאלה ביונקים 1,2. לכן, דג הזברה הוא מודל רב עצמה פוטנציאלית ללימוד הפרעות גנטיות, בקרת נוירואנדוקריניים, וביולוגית מערכות של hypothalamo-היפופיזה-אדרנל הציר (interrenal). s = &quot;jove_content&quot;&gt; בבלוטת יותרת הכליה, 3β-HSD מזרז את ההמרה של פרוגסטרון מ פרגננולון, 17α-hydroxyprogesterone מ 17α-hydroxypregnelolone, ו אנדרוסטנדיון מ dehydroepiandrosterone 4,5. 3β-HSD חיונית biosynthesizing כל המעמדות של סטרואידים הורמונלית, כלומר פרוגסטרון, גלוקוקורטיקואידים, מינרלוקורטיקואידים, אנדרוגנים, אסטרוגנים. שני-HSD 3β האדם isozymes HSD3B1 ו HSD3B2 מבוטא 6 דיפרנציאלי. HSD3B1 מתבטא השליה ורקמות פריפריה, כאשר HSD3B2 מתבטא בקליפת והאשכים הכליה. האדם HSD3B1 ו HSD3B2 הוא-orthologs שיתוף של hsd3b1 דג הזברה, אשר באו לידי ביטוי על רקמות interrenal ואשכים מבוגרים; hsd3b2 דג הזברה הוא גן אימהי הביע שאת התמלילים להיעלם לפני organogenesis 7. הפרוטוקול של assay הפעילות האנזימטית כל הר 3β-HSD עבור דג זברה פותח על ידי שינוי השיטה של ​​לוי,שעות שתואר על ידי Milano et al. , על חלקים קפואים של שמונה בעלי חוליות 8. בגלל חדירות רקמות שקיפות אופטית של דג הזברה פיתוח, כל הר 3β-HSD היסטוכימיה יכול לשמש בהצלחה העובר הזחלים דג הזברה קבוע ובאופן ספציפי להתוות הרקמות interrenal מובחן. assay הרגיש ומהיר זו יושם כדי מוטנטים morphants שבאו להפגין סוגים שונים של dysmorphogenesis interrenal. פעילות interrenal 3β-HSD תיאור בעובר שבו מפרט של רקמת interrenal מופר באמצעות מציאה ספציפית של גורם שעתוק Ff1b והוא ירד כמו הבידול interrenal מושפע מציאה של coregulator Ff1b Prox1 9,10. יש לציין, כי פעילות 3β-HSD ניתן לאתר מוטציות עם מומים בשלב מוקדם חמורים, כגון ראש סיכת שתום עין לפזול, שבו 3β-Hsd היסטוכימיה מתווה כיצד נדידת תאי interrenal מושפעת 11. הבידול של רקמת interrenal לא נפגע גם בהיעדר המוחלט של דם בכלי דם. לכן, איך אותות שמקורם האנדותל לעצב את איבר interrenal בפיתוח ניתן לקבוע 12,13. בסך הכל, assay histochemical זה שימש בהצלחה ללימוד מפרט, בידול, והגירה של תאים steroidogenic במודל דג הזברה. לכן, זה צריך להיות יעיל כלי אמין עבור כל מסך גנטי או כימי מיקוד הפרעות איבר האדרנל interrenal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:187px;">Carl Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:72px;">LSM510&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>USB</td>
			<td>US16374</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S380C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nusieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylthiourea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100Tab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PYREX Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reef Salt</td>
			<td>AZOO</td>
			<td>AZ28001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-Dehydroandrosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

כדי לקבוע כיצד codevelops רקמות interrenal steroidogenic עם glomerulus כליות pronephric ואת כלי הדם המתהווה שלה, assay הפעילות האנזימטית 3β-HSD בוצע על כפול מהונדס Tg (wt1b: GFP) Li1; Tg (kdrl: mCherry) העובר ci5 ב 34 hpf (איור 1). בשלב זה, רקמת steroidogenic הפעילות חיובית 3β-HSD ממוקמת ממש על קו האמצע ומייד זנב glomerulus הכליות pronephric, בעוד כמה תאי steroidogenic להתחיל נודדות ברחבי קו האמצע ויוצרים יתרון בולט מתצוגת הגבי. רקמת steroidogenic קשורה קשר הדוק עם האאורטה הגבה (DA) וריד קרדינל אחורי (PCV). את assay הפעילות האנזימטית 3β-HSD על Tg (kdrl: GFP) s843 עוברים מותר סימון מדויק של כלי פרי-interrenal, כולל DA, PCV, וכלי interrenal (אירב; איור 2). Vibratome קטעי העוברים מוכתם פעילות-HSD 3β היו נתונים ניתוח IHC לגילוי חלבון תאי מטריקס פיברונקטין ו מפעיל במורד שלה פוספורילציה קינאז הדבקה מיקוד. בתצהיר הפרי-DA של פיברונקטין חיוני תומך צמיחה אירב 18. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54820/54820fig1.jpg" /> איור 1: Whole-Mount 3β-HSD פעילות מכתימה מבוצע על דג זברה לבטא כתבי ניאון. הגבי (משמאל לוחות) ו דורסולטרלי (לוחות מימין) נופים של Tg מוכתם פעילות 3β-HSD (wt1b: GFP) Li1; Tg (kdrl: mCherry) העובר ci5 ב 34 hpf, המאפשרת לדמיין את הפריסה המרחבית היחסי של interrenal רקמה (IR), glomerulus pronephric (PG), tubules pronephric (PT), אבי העורקים הגבי (DA), הגבי לרוחבוריד קרדינל האאורטה (LDA), ואת אחורי (PCV). בשל מיקומו של רקמת interrenal בשלב זה, את הדעות דורסולטרלי הן מהצד הימני של העובר. D, הגבה; V, גחון; A, קדמי; P, אחוריים; R, נכון; L, עזב. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54820/54820fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54820/54820fig2.jpg" /> איור 2: חתך vibratome וניתוח IHC של 3β-HSD פעילות מוכתם Tg (kdrl: GFP) s843 עוברים. העובר 34-hpf היה נתון assay הפעילות האנזימטית 3β-HSD ולאחר מכן חתך vibratome. 3β-HSD פעילות חיוב הסעיף הוכתם כפול IHC עם פיברונקטין אנטי אנושי ארנב (Fn; 1/200) ועכבר אנטי אנושי קינאז הידבקות פוספורילציה מוקדים (pFak; pY397, 1/100). הסעיף רוחבי מראה את ההפצה היחסית של הרקמה interrenal (IR) וכלי השכנות, כולל האאורטה הגבי (DA), וריד הקרדינל האחורי (אירב), וריד הקרדינל האחורי (PCV). NT, בצינור העצבי; NC, notochord; S, somite. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54820/54820fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז מניות </td><td> בשנת 1000 μl </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> חלק א. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td> 40 μl </td><td></td></tr><tr><td> DHEA </td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 10 μl </td><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> NAD </td><td> 1.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 10 μl </td><td> 12 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חלק ב &#39; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBST </td><td></td><td> 936 μl </td><td></td></tr><tr><td> ויטמין B3 </td><td> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 2 μl </td><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> NBT </td><td> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 2 μl </td><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1: רכיבים של התגובה מכתים 3β-HSD.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish at JoVE.com

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח.

לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K Views.  Tunghai University.  בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח. 

Video: Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...